この系統誘導アプローチにより、脊椎動物の胚内の空間的および時間的分解能で重要な発生イベントのプロテオミクス解析が可能になり、全胚測定ではアクセスできない情報が得られます。このアプローチは、発生中に分化するさまざまな胚細胞からのタンパク質、代謝物、転写産物を研究するために容易に拡張できます。この方法は、発生初期における組織誘導や細胞運命関与のメカニズムなど、正常および疾患の発生を制御する分子メカニズムの理解を深めることができます。
ヘアループを使用して各胚をウェルに導き、目的のターゲット細胞がマイクロニードルに対して直角になるようにゆっくりと配置します。アフリカツメガエルの組織運命マップに従って、目的の系統の前駆細胞を特定します。2つの鋭利な鉗子を使用して、胚を囲む卵子膜をそっと取り除きます。
鉗子を用いた手動解剖によって胚から単一細胞を単離する。系統トレーサー溶液を含む注射針をセットアップすることから始めます。マイクロインジェクションニードルを多軸マイクロマニピュレータで制御されるマイクロピペットホルダーに取り付けます。
マイクロピペットホルダーをマイクロインジェクターに接続し、負圧を加えて針に系統トレーサーを充填します。針を校正し、針先のサイズと注入時間を調整して、鉱油で測定された約1ナノリットルの系統トレーサー溶液を供給します。注入する液滴サイズが正確であることを確認し、必要に応じてインジェクターの設定を調整します。
マイクロインジェクション粘土皿に3%fCAL溶液を浸し、トランスファーピペットを使用して約10個の胚を粘土皿に移します。目的の細胞に約1ナノリットルの蛍光デキストランまたは200ピコグラムのGFP mRNAを注入します。実体顕微鏡を用いて、細胞標識の成功を確認します。
目的のセルのみが注入されていることを確認してください。損傷した細胞や誤ってラベル付けされた細胞を含む胚は、施設の方針に従って廃棄してください。注入した胚を0.5倍のスタインバーグ溶液を含むシャーレに移します。
希望の発達段階に達するまで、摂氏14度から25度の間で培養します。3〜5個の胚を、微小解剖用の0.2倍のスタインバーグ溶液を含む寒天ディッシュに移します。鉗子を使用して、標識されたクローンを胚から解剖します。
解剖した組織を0.5〜10マイクロリットルのピペットで収集し、マイクロ遠心分離機ファイルに堆積させます。ピペットを使用して、採取した組織を取り囲む媒体を吸引し、サンプル中の塩分を制限し、HRMS分析への干渉を回避します。サンプルバイアルをドライアイスまたは液体窒素の上に置いて、単離した細胞を直ちに凍結します。
質量分析までマイナス80°Cでサンプルを保管してください。CEによるシングルセルサンプル処理では、サンプルを摂氏60度に約15分間加熱してタンパク質を変性させます。次に、サンプルを室温に5分間平衡化し、消化のためにサンプルにトリプシンを加えます。
NanoLCによる分析のために、50マイクロリットルの溶解バッファーで最大5つの解剖組織を溶解します。サンプルを上下にピペッティングすることで、プロセスを容易にします。解剖した組織を処理するには、ライセートを摂氏4度で10分間インキュベートします。
次に、4, 500 RCFで濃縮することにより、摂氏4度で細胞破片と卵黄血小板をペレット化します。上清を清潔なマイクロ遠心バイアルに移し、10%SDSを加えて、ライセート中の最終濃度1%SDSを取得します。組織の場合、0.5モルのジチオスレイトールをライセートに加えて、約25ミリモルの最終濃度を取得します。
次に、ライセートを摂氏60度で30分間インキュベートして、タンパク質のジスルフィド結合を化学的に還元します。0.5モルのヨードアセトアミドを加えて、ライセート中の最終濃度約75ミリモルを取得し、暗所で室温で15分間インキュベートします。初期容量と同じ0.5モルのジチオスレイトールを加えて、アルキル化反応から残っている反応物をクエンチします。
テキストプロトコルに記載されているように、アセトン中で一晩タンパク質を沈殿させ、0.5モルの重炭酸アンモニウムで再構成します。サンプル消化のためにトリプシンを加え、バイアルを摂氏37度でインキュベートします。CEを使用してペプチドを分離するには、1〜2マイクロリットルのサンプル溶媒で消化したタンパク質を再構成します。
混合サンプルをボルテックスし、摂氏4度で2分間10, 000 RCFで遠心分離して、細胞破片をペレット化します。CEキャピラリーをBGEでフラッシュして、CE-ESI機器を初期化します。1マイクロリットルのサンプルをサンプルバイアルに入れ、1〜10ナノリットルのサンプルを流体力学的注入によってCE分離キャピラリーに注入します。
CE分離キャピラリーの入口端をBGEに移します。アースグランドからCE分離電圧を徐々に上昇させて電気泳動分離を開始します。20〜28キロボルトの電位と10マイクロアンペア未満の電流は、分析のための安定した再現性のある機器性能を保証します。
Nano LCを使用して分離するには、ペプチドサンプルを移動相に再懸濁します A.サンプルの濃度と注入量は、利用可能なLCシステムとカラムによって異なります。サンプルをLCバイアルに移します。約200ナノグラムから2マイクログラムのペプチドサンプルをC18分析カラムにロードし、テキスト原稿に記載されているようにグラジエント溶出を使用して毎分300ナノリットルの流速でペプチドを分離します。
カメラを使用して、エレクトロスプレーエミッターを通る液体の流れを確認し、漏れの可能性がないかセットアップを視覚的に検査します。質量分析イベントを取得し、テキスト原稿に記載されているようにペプチドを配列決定します。遺伝子翻訳の違いは、CE-ESI-HRMSを使用して異なる胚から解剖されたD11細胞間で検出されました。
系統標識された解剖細胞クローンをLC-HRMSにより解析した。タンパク質の経路解析は、神経外胚葉を用いたSpemannのオーガナイザーにおけるアップレギュレーションされたタンパク質翻訳およびエネルギー代謝を示した。神経外胚葉プロデウムは、細胞内のタンパク質貨物の核輸送に関連するタンパク質に富んでおり、シグナル伝達後の下流イベントを示している可能性があります。
分子機能の濃縮解析は、翻訳開始、RNA結合、およびプロテアソーム複合体の結合におけるアップレギュレーションを示し、Spemannのオーガナイザーを発達させる動的タンパク質代謝回転の役割を示唆しています。このプロトコルでは、再現性と結果の解釈を改善するために、ステレオタイプの胚のみを選択してください。解剖した組織はバイアルに移し、緩衝塩による汚染を最小限に抑えるために、できるだけ最小限の培地バッファーを含む直ちに凍結する必要があります。
このアプローチにより、同定された細胞におけるタンパク質動態と生きた胚の細胞系譜を研究することができました。発生組織における重要なタンパク質の空間的時間的生産に関する新しい情報により、それらの生物学的機能を評価するための標的実験を設計することができました。
