研究契約ミゲルServet（ISCIII CD14 / 00032）から（GN-G。）。 （CH）の科学研究「トランスレーショナル神経科学プログラム研究科 &quot;のオランダ機構（022005019）からフェローシップ。 プリンセスベアトリクスフォン（プロジェクトWAR08-12）と協会フランセーズcontreレミオパシーからの補助金（PM-M。）;ならびに科学研究費オランダ機構（916.10.148）のVeniフェローシップによるオランダの脳財団のフェローシップ（FS2008（1）-28）とプリンセスビアトリクスフォン（プロジェクトWAR08-12）（MLへ）。 我々は、フローサイトメトリーによる選別B細胞の彼女の助けのためJozienヤスパースに感謝します。

<ol>
	<li>Vrolix, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+heterogeneity+of+thymic+B+cells+from+early-onset+myasthenia+gravis+patients+with+antibodies+against+the+acetylcholine+receptor.">Clonal heterogeneity of thymic B cells from early-onset myasthenia gravis patients with antibodies against the acetylcholine receptor.</a> J Autoimmun. 52, 101-112 (2014).</li><li>Yamashita, M., Katakura, Y., Shirahata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+generation+of+human+monoclonal+antibody.">Recent advances in the generation of human monoclonal antibody.</a> Cytotechnology. 55 (2-3), 55-60 (2007).</li><li>Pereira, K. M., Dellavance, A., Andrade, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+identification+of+autoantibodies+specific+to+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases+in+high+throughput+operation:+Proposal+of+reliable+and+feasible+strategies.">The challenge of identification of autoantibodies specific to systemic autoimmune rheumatic diseases in high throughput operation: Proposal of reliable and feasible strategies.</a> Clin Chim Acta. 437, 403-410 (2014).</li><li>Losen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+myasthenia+gravis+by+preventing+acetylcholine+receptor+modulation.">Treatment of myasthenia gravis by preventing acetylcholine receptor modulation.</a> Ann N Y Acad Sci. 1132, 174-179 (2008).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen.">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li><li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+making+human+monoclonal+antibodies.">A novel method for making human monoclonal antibodies.</a> J Autoimmun. 35 (2), 130-134 (2010).</li><li>Traggiai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+to+make+human+monoclonal+antibodies+from+memory+B+cells:+potent+neutralization+of+SARS+coronavirus.">An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus.</a> Nat Med. 10 (8), 871-875 (2004).</li><li>Fraussen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantigen+induced+clonal+expansion+in+immortalized+B+cells+from+the+peripheral+blood+of+multiple+sclerosis+patients.">Autoantigen induced clonal expansion in immortalized B cells from the peripheral blood of multiple sclerosis patients.</a> J Neuroimmunol. 261 (1-2), 98-107 (2013).</li><li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+individual+immune+responses+elicited+by+in+vitro+immunization.">Different individual immune responses elicited by in vitro immunization.</a> Cytotechnology. 40 (1-3), 161-165 (2002).</li><li>Hui-Yuen, J., Koganti, S., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+B+cell+immortalization+for+monoclonal+antibody+production.">Human B cell immortalization for monoclonal antibody production.</a> Methods Mol Biol. 1131, 183-189 (2014).</li><li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning.">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li><li>Lanzavecchia, A., Corti, D., Sallusto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monoclonal+antibodies+by+immortalization+of+memory+B+cells.">Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 523-528 (2007).</li><li>Traggiai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+B+cells:+analysis+of+B+cell+repertoire+and+production+of+human+monoclonal+antibodies.">Immortalization of human B cells: analysis of B cell repertoire and production of human monoclonal antibodies.</a> Methods Mol Biol. 901, 161-170 (2012).</li><li>Strober, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+growth.+Curr+Protoc+Immunol+/+edited+by.">Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol / edited by.</a> John E. Coligan ... [et al.]. Appendix 3, Appendix 3A (2001).</li><li>Ibrahim, S. F., van den Engh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+cell+sorting.">Flow cytometry and cell sorting.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 106, 19-39 (2007).</li><li>Leith, J. T., Padfield, G., Faulkner, L. E., Quinn, P., Michelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+feeder+cells+on+the+X-ray+sensitivity+of+human+colon+cancer+cells.">Effects of feeder cells on the X-ray sensitivity of human colon cancer cells.</a> Radiother Oncol. 21 (1), 53-59 (1991).</li><li>Hui-Yuen, J., McAllister, S., Koganti, S., Hill, E., Bhaduri-McIntosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Epstein-Barr+virus+growth-transformed+lymphoblastoid+cell+lines.">Establishment of Epstein-Barr virus growth-transformed lymphoblastoid cell lines.</a> J Vis Exp. (57), 3321 (2011).</li><li>Smith, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+detection+in+automated+DNA+sequence+analysis.">Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis.</a> Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

本稿では、ヒトPBMCからのIgG抗体の生成のためのすべてのステップを詳細に示します。このプロトコルは、以前に公表された技術を超えるいくつかの利点が含まれています。利点の一つは、産生された抗体は、B細胞クローンの元の対に対応する重鎖および軽鎖を保つことです。 IgG抗体の同定は、ヒトドナーの任意のタイプで行うことができ、ワクチン接種5による免疫応答の悪化を必?...

この論文の目的は、具体的にヒト末梢血単核細胞（PBMC）から得られたヒトIgGモノクローナル抗体を作製し、特徴づけるための方法を記述することです。 ヒト抗体を研究するための関心は、研究のさまざまな分野に成長しました。特に、多くの研究グループは、自己抗体によって引き起こされる病理1-3に興味を持っています。我々は、クローン化され、1病原性の自己抗体を特徴としています。自己抗体の研究は、競合抗体4を使用して、 例えば 、それらの標的を同定し、治療戦略を開発するのに役立ちます。また、ヒト抗体の研究はまた、露出して特定の病原体6または研究するためにどのに耐性となった個体の抗体プロフィールを特徴付けるために、ワクチン接種後5免疫応答を評価するために、 すなわち 、研究の他の分野に関心のものであることができます抗体がです天然のレパートリー7,12。 いくつかの技術が、組換えヒトモノクローナル抗体8-12を生成するために開発されています。これらのほとんどは、ファージディスプレイおよびB細胞の不死化を使用します。ファージディスプレイの使用は、広範囲に新13抗体の検出に適用されています。しかし、となるヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖対は、プロセス中に解離していること、すなわち、主要な欠点​​を有します。ヒトB細胞またはEBV形質転換とハイブリドーマの生産は、この欠点を克服します。 我々は、Toll様受容体9（TLR-9）、6,12を介して、ポリクローナルB細胞刺激と組み合わせたEBVで胸腺B細胞の感染を使用します。 本稿では、in vitroでの抗体生成にPBMC単離からのすべてのステップの完全な概要と、詳細に我々は、IgGヒト抗体の開発のために使用する技術が記載されています。このこのプロトコルは、ヒトIgGのプロファイルのいずれかのタイプの分析のために使用することができます。我々の研究室では、IgG抗体を産生するB細胞が正常にソートした後のPBMCの残りの部分から分離されました。五8は 、マルチウェルプレートに播種し、単一のB細胞のクローン性増殖のために、EBV及びTLR-9活性化によって不死化することができるB細胞を選別しました。フィーダー細胞としては、ヒト胎児肺組織からの線維芽細胞は、不死化B細胞の可視化を容易にする細胞系WI38が、使用されています。これらのB細胞から、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の配列を、PCRにより得ることができる、および抗体」遺伝子は、免疫グロブリンGを発現ベクター中にクローン化し、 インビトロで生成しました。この技術を用いて、ドナーに見られる全く同じ抗体配列を有する単一の抗体を試験することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td>solution containing polysucrose and sodium diatrizoate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II cell sorter&#160;</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 U-bottom micro well plates&#160;</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium&#160;</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>12633-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% v/v EBV-containing supernatant of the B95-8 cell line&#160;&#160;</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1612</td>
			<td>3.4 x 108 copies/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG2006&#160;</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ODN 7909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wi38 cells&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>90020107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>10799068001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Microlon</td>
			<td>655092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fc&#947; Fragment Specific (unconjugated)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-006-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% non-fat dry milk (Blotting Grade Blocker)&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IgG&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I 2511</td>
			<td>HUMAN IgG purified Immunoglobulin, 5.6 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat F(ab)2 antihuman IgG Fc&#947; (conjugated with peroxidase (PO))</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>109-036-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA reader (Perkin Elmer 2030)&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>2030-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgM, Fc5&#181;&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>309-035-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript III Cells Direct cDNA Synthesis System&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>18080-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems (ABI) GeneAm PCR System 2700</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure RNA Isolation Kit&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription system kit&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Taq DNA Polymerase</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>R001A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers (2&#956;l)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 bp ladder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15628-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 4.5.2 (Gel Doc 2000)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>170-8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR purification kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 ml reaction plate (MicroAMP Optical 96-well)</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetic analyser ABI300&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent cells (E. coli)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>pfusess-hchg1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)&#160;</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>pfusess-hchg4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>pfuse2ss-hclk</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)&#160;</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>pfuse2ss-hcll2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-based agar medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>fas-zn-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Zeocin (Fast-Media Zeo TB)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>fas-zn-l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Miniprep kit&#160;</td>
			<td>Omega Bio Technology</td>
			<td>D6942-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop (ND1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-based agar medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast Agar)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>fas-bl-s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terrific Broth (TB)-based liquid medium supplemented with Blasticidin (Fast-Media Blast TB)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>fas-bl-l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101S</td>
			<td>20,000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NheI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0131S</td>
			<td>10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Log DNA ladder</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N3200S</td>
			<td>0.1-10.0 kb, 1,000 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XmaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0180S</td>
			<td>10,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsiWI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0553S</td>
			<td>10,000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AvrII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0174S</td>
			<td>5,000 U/ml, in 10x CutSmart Buffer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>1 U/&#181;L, in 10x FastAP Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH5&#945; competent cells&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18263-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human IgG</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>555787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Clone: HIB22</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>BDB563942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of recombinant human igg monoclonal antibodies from immortalized sorted b cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

CD22およびIgG陽性細胞を染色した後の選別ゲートは、 図1に示されているこの画像では二重陽性細胞の面積- 。IgG抗体を産生するB細胞が-別のチューブ内のすべてのこれらの細胞を選別するために選択されます。分析では、全PBMCの約1％が、この二重陽性集団に対応しています。得られた選別された細胞の数は、セクション1で得られた細胞の数に依存します。 ...

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Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

generation-recombinant-human-igg-monoclonal-antibodies-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.2K ビュー.  Maastricht University. Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.