著者らは、インフルエンザの逆遺伝学技術とプラスミドの開発のためのアドルフォガルシア、サストレとピーターPaleseの研究室で過去と現在のメンバーに感謝したいと思います。 AG - Sの研究室で研究の一部は手足の不自由な人、インフルエンザの研究と監視のための優秀NIAID資金によるセンター（HHSN266200700010C）によっておよび大学評価学位授与機構の助成金R01AI046954、U01AI070469とP01AI058113によって賄われています。 LM - Sのラボの研究は、部分的にNIAIDの助成金RO1AI077719によって運営されている。

1。インフルエンザウイルスの救助のトランスフェクションインフルエンザウイルスは、負の鎖RNAエンベロープウイルスのオルトミクソウイルス科のファミリーに属する。インフルエンザは、ウイルスゲノムは、少なくとも、11のウイルスタンパク質（図1）4をエンコードする負極性の8種類のRNAの遺伝子で構成されています。我々は（8インフルエンザA/PR/8/34ウイルスのセグメントを含むambisenseプラスミド（PDZ）を使用して最も一般的な実験室株、インフルエンザA/PR/8/34、5のうちの1つの救助に、このレポートでは、焦点を当てる図2）。 プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスの救助のために、我々は、それぞれの組換えウイルスごとに3つの独立したトランスフェクションをお勧めします。複数の組換えウイルスの救助が試みられると、救出されるウイルスの数に一致して、次の手順を拡張する。以下のトランスフェクションと感染のプロトコルは、6ウェルプレートのために確立されます。プロトコルの概略図を図3に示します。 <ol><li> OPTIMEM -リポフェクタミン2000（LPF2000）混合：OPTIMEMのメディアとトランスフェクションあたりLPF2000の6-8μlを250μlを準備。室温（RT）で5〜10分間インキュベートする。一方、プラスミドトランスフェクション混合物を準備する。 </li><li>プラスミドのトランスフェクション混合物：OPTIMEMメディアの50μlのプラスミドトランスフェクションのカクテルを準備。我々は通常、救助あたりのプラスミドを各インフルエンザのDNAの1μgを使用してください。 OPTIMEMメディア50μlを含むチューブに1 PDZプラスミドの溶液（1μg/μLの時）PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、およびNSを追加。 </li><li> OPTIMEM - LPF2000 - DNAプラスミド混合物：インフルエンザのDNAプラスミドのトランスフェクション混合液（ステップ1.2）に、ステップ1.1から250μlを追加する。室温で20-30分のためにこの混合物をインキュベートする。一方、トランスフェクションのための293TとMDCK細胞の懸濁液を準備する。 </li><li> 293T/MDCK共培養の準備：開始する前に、37にPBS 1X、DMEM 10％FBS 1パーセントPSメディア、およびEDTA -トリプシンの混合物をもたらす℃に細胞の密度は80〜90％コンフルエントでトランスフェクションの日でなければなりません。通常は、293TとMDCK細胞の一つコンフルエント100 mmディッシュの一つコンフルエントな100 mmディッシュは、救助10月12日に使用することができます。私たちは、ウェルあたりの細胞の250μlを使用するつもりです。両方の細胞株をDMEM 10％FBS 1パーセントPSの3mlの合計に再懸濁される。 <ul><li>慎重に15 mlの遠心チューブでDMEM 10％FBS 1パーセントPSの10mlにそれぞれの細胞株を懸濁します。あなたは、293T細胞およびMDCK細胞用のチューブ用の管を持つこ​​とになります。 </li><li> DMEM 10％FBS 1パーセントPS 3mlに293T細胞を再懸濁し、再懸とき、それらの細胞を再懸濁するために、MDCK細胞に3 mlを実現。これは、あなたの共培養に使用される293TとMDCK細胞の混合物を与える。 </li><li>ウェルあたり293T/MDCK細胞（10-12 6ウェルウェル）250μlを添加する。 </li></ul></li><li> RTのインキュベーション（ステップ1.3）20〜30分後、OPTIMEM - LPF2000 -インフルエンザのDNAプラスミド混合液にDMEM 10％FBS 1パーセントPSの1 mlを加える。 </li><li> 293T/MDCK細胞を250μl（ステップ1.4）でウェルに1.3ミリリットル（ステップ1.5）を追加します。 </li><li>穏やかに6ウェルプレートを振とうし、℃、5％CO 2で37インキュベーターで一晩トランスフェクションインキュベートする（ON）ができます。 </li><li>翌日、約16-24時間後にトランスフェクションは、トランスフェクションのメディアを変更し、48時間TPCK -トリプシンのの1μg/ mlを含むPS DMEM 0.3％BAに1％をトランスフェクションされた細胞をインキュベートする。 </li><li>メディアを変えるの48時間後に、マイクロ遠心チューブにトランスフェクションした細胞の上清を移す。 </li><li> 1〜2分、13,000 rpmの遠心で組織培養上清を遠心してください。 </li><li> 6ウェルプレート（前日に播種）またはステップ1.10〜遠心組織培養上清の200μlの10日齢の鶏孵化卵に新鮮なMDCK細胞に感染。 2〜3日で37細胞および/または卵° Cをインキュベートする。 <ol><li> 10日齢の鶏孵化卵の感染：鶏孵化卵に感染するすべての手順は、無菌条件下で行われる。 <ol><li>気嚢と尿膜腔の間のインタフェースを確認するためにライトキャンドルボックスを使用して、10日齢の卵キャンドル。インタフェースの境界上で鉛筆のマークを付けます。 </li><li> 5 mlの注射針で卵殻に穴を開ける。 </li><li> 1mlのシリンジで、ステップ1.10〜組織培養上清の200μlで各卵に感染する。 </li><li>綿棒を使用して、溶けたワックスと卵殻に穴をカバーする。 </li><li> 2〜3日間37οCで感染した卵をインキュベートする。 </li></ol></li><li>新鮮なMDCK細胞の感染：通過前日293T/MDCK共培養から組織培養上清、事前に皮をむくMDCK細胞を6ウェルプレートの料理翌日80-90％コンフルエントに到達する。通常、コンフルエントな100 mm組織培養プレートは6〜8ウェルに分割することができます。細胞を洗浄、二回、PBS 1Xで、トリプシン処理し、6ウェルプレートを準備。静かに細胞の均一な分布を持つために手でプレートを振る。文化のセル、ON、37℃インキュベーター、5％CO 2。感染する前に、単分子層を確認するために顕微鏡下で細胞をオンにし、感染を続行して下さい： <ul><li> PBS 1X 1mlで、二回、細胞を洗浄。 </li><li>室温で1時間遠心分離した組織培養上清の200μlで感染する。細胞は乾燥させないでください。 6ウェルプレート10分ごとに揺らし。 </li><li>ウイルス性吸収の1時間後、MDCK細胞から感染の媒体を削除し、TPCK -トリプシンのの1μg/ mlを含むPS DMEM 0.3％BA 1％2 mlを加える。 </li><li>通過後48〜72時間で、トランスフェクション効率とウイルスの負荷に応じて、細胞変性効果（CPE）はMDCK感染細胞で観察される。 CPEは、成功した救助を示唆している。しかし、HAアッセイ（セクション2）が依然として組織培養上清中のウイルスの存在を確認するために実行する必要があります。 </li></ul></li></ol></li><li>感染した鶏の孵化卵から収穫尿膜液：感染した卵から尿膜液を採取するすべての手順は、無菌条件下で行われる。尿膜腔液の約8〜12ミリリットルは、それぞれの10日齢に感染した卵から収穫することができる。尿膜液を採取する前に、℃でニワトリ胚を殺すと血液を凝固するために4で2時間（またはON）のために鶏の卵をインキュベートする。 <ul><li>無菌状態を確立するために70％エタノールで卵の殻を洗ってください。 </li><li>スプーンで軽くたたくことによって空気の空洞を介して、慎重に、卵を開きます。鉗子の助けを借りて、壊れた卵の殻を外します。 </li><li> 1mlの針で、卵の黄身を壊すことなく、尿膜を取り除く。 </li><li>あなたが尿膜液に10 mlのピ​​ペットをガイドとしてスパチュラでニワトリ胚を安定させます。壊したり、卵の卵黄のいずれかを収集せずに、氷のバケツに氷の上に15 mlの遠心管に、できるだけ多くの尿膜液として収集する。それぞれの卵のための15 ml遠心チューブを使用してください。 </li><li> 4℃で5分間遠心し℃、新鮮な15 ml遠心管に尿膜腔液を（ペレット化赤血球を服用せずに）転送する。 </li><li>それらは赤血球凝集（HA）アッセイによる救出、ウイルスの有無をチェックされるまで、4℃で遠心分離した尿膜液を含むチューブ℃で保管してください。 </li></ul></li></ol> 2。組換えインフルエンザウイルスの救助を確認するために、HAアッセイ赤血球凝集アッセイ（HA）は、日常的にMDCK細胞培養上清及び/または収穫卵の尿膜腔液の救出、ウイルスの存在を検出するために使用されます。また、免疫蛍光アッセイ（IFA）も行うことができます。アッセイは、救出のウイルスの存在を識別する一度、ウイルスをプラーク精製されるべきであり、ウイルスの遺伝的組成は、RT - PCRおよび配列決定によって確認されます。 MDCK細胞の培養上清及び/または感染した卵から尿膜液中のウイルスの存在は、肉眼的に鶏のHA（または別のソース）赤血球（RBC）を用いて決定することができる。ウイルスの不在は、ウェルの底に赤ペレット（図4）の形成を可能にしながら、ウイルスの存在は、RBCの赤血球凝集を誘導する。インフルエンザウイルスの場合には、それは約10 3 -10 4プラーク形成単位（PFU）は、HAのアッセイで陽性信号を与えるために必要とされると考えられているので、IFAは、確認のため、HAアッセイと並行して行うことができます。真の陰性結果。未満103から104のウイルスはこの手法で検出できるので、一次抗インフルエンザ抗体を用いたIFAは、HAアッセイよりも感度が高いです。それはIFAで陽性のHA陰性である上清あるいは尿液より可能です。この場合、ウイルスはMDCK細胞で、卵で、再び、継代によって増幅されるべきである。第2流路から尿膜液および/または組織培養上清は、現在、HAアッセイで明らかな陽性でなければなりません。 HAアッセイは、V底96ウェルプレートで実施されています。負（例えば、PBS 1X）と正（組織培養上清及び/またはインフルエンザウイルスの感染から尿膜腔液）コントロールのサンプルは、常にそれを検証するために、任意のHAアッセイに含まれるべきです。 <ul><li> V底96ウェルプレートの各ウェルにPBS 1Xの50μlを分注する。 </li><li> 50μlを加え感染した最初のウェルに卵と、からMDCK細胞の培養上清および/または尿膜液は、以下の井戸を2倍希釈系列を作る。最後のウェルからの余分な50μlを捨てる。 </li><li>各ウェルに0.5％-1.0％ニワトリ赤血球（PBS 1Xで調製）を50μlを追加。 </li><li>氷上で30-45分（赤い点は、陰性コントロールのPBS試料の底部に見えるようになるまで）のためのV底96ウェルプレートをインキュベートします。図4に示される結果を読んで、interpretate。 </li></ul> 3。組織培養上清のパッセージ HAアッセイで陰性の結果は、組織培養上清および/または尿膜液中のウイルスという存在の低水準と低いトランスフェクション効率の結果である可能性があります。新鮮なMDCKおよび/または孵化卵におけるこれらのサンプルの通過は、感染症は、以前は次のセクション1.11.2で説明したように実行されます（図3に示される）ウイルスの増幅が可能になります。 4。代表的な結果成功したインフルエンザウイルスの救助は、正のHAアッセイ（図4）の存在によって確認される。さらに、組織培養上清、または卵から尿膜液と感染細胞におけるCPEの存在は肯定的なウイルスの救助を提案します。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。インフルエンザウイルスの構造：インフルエンザウイルスは、2つのウイルス糖タンパク質（HA、NA）と、また、イオンチャネル蛋白質、M2を含む脂質二重層に囲まれています。 HAは、シアル酸含有受容体に結合することの責任のウイルス付着タンパク質、です。 NAは、宿主細胞からのウイルスのリリースを担当しています。脂質二重層の下、ビリオンアセンブリと出芽およびウイルスribonucleocapsidsの核外輸送に必要な核輸出タンパク質（NEP）、の役割を果たしている内面のエンベロープのマトリックスタンパク質1、M1、から構成される蛋白質の層です。ウイルスのコアは、ウイルスの核タンパク質、NPでcapsidに包まれた8つのシングル鎖陰性RNAウイルスの遺伝子で構成される、リボ核タンパク質（RNP）複合体で作られています。 RNP複合体に関連付けられているウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットPA、PB1、PB2となります。非構造タンパク質NS1およびRNAのセグメントNSとPB1にコードされるPB1 - F2は、それぞれ、ビリオンの構造の一部ではありません。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。インフルエンザウイルスのレスキュープラスミド：8インフルエンザウイルスの遺伝子ambisenseプラスミドPDZにクローニングされたが示されている。 pCAGGs 7プラスミドタンパク質の発現から得られるプラスミドPDZ 6は 、ヒトのRNAポリメラーゼIはプロモーターと負のセンスのゲノムRNAをコードするマウスターミネーター配列との双方向のプラスミドベクターであり、逆方向に私が団結ポリメラーゼに、ポリメラーゼII転写カセット（ニワトリβ-アクチンプロモーターとポリA）は、同じウイルスの遺伝子からウイルスタンパク質をコードしている。各ウイルスのセグメントからのcDNAは、SAPIの制限エンドヌクレアーゼ部位と各セグメントの非翻訳領域を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いたRT - PCR（ウイルス遺伝子の端にある黒色のボックス）によって生成されます。 PCR産物は、SAP - Iで消化PDZにクローニングされています。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。八プラスミドベースのインフルエンザのレ ​​スキューシステム：8インフルエンザウイルスの遺伝子を含むPDZプラスミドを293T - MDCK細胞共培養（1日目）で、懸濁液に、同時トランスフェクトされています。二十四時間トランスフェクション後、FBSのないメディアがTPCK /トリプシンを含むが（2日目）に置き換えられます。四十八時間のメディアを変更した後、組織培養上清を回収し、MDCKまたは10日齢発育鶏卵を（4日目）に感染するために使用されます。 48〜72時間後の増幅、卵からMDCK感染細胞や尿膜腔液から組織培養上清は、HA（6日）で採取し、ウイルスの存在についてアッセイする。ウイルスが検出されない場合は、同じ上清および/または尿液は、新鮮なMDCK細胞および/または孵化卵に再継代することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。赤血球凝集素分析（HA）：ウイルス粒子によるRBCの凝集は、肉眼で見えるであり、組織培養上清または/および尿液にウイルス粒子を検出するための基礎です。 HAアッセイは、ウイルス感染性粒子と劣化したと細胞に感染することはもはやできる粒子を区別しませんが、アッセイは、サンプル中のウイルスの存在の良い指標です。 A）生物学的サンプル中のウイルスの存在の不在（上）（下）は、プレートの底部におけるRBCの存在や彼らの不在、RESPによって決定されます。ectively。 B）HAのウイルスの検出可能なレベルの分析（上）またはウイルスの存在（下）から代表的な結果が示されています。

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

マウントサイナイ医科大学では、組換えインフルエンザウイルスの分野で知的所有権を有し、およびAG - Sは、この知的財産の発明者です。

プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスの救助は、プロトコルが日常的に実験室で実施されると、シンプルかつ簡単なプロセスですが、初めに、複数の物事が間違って行くことができます。それは、ウイルスを生成するために適切なプラスミド調製を持つことが不可欠です。細胞株（293TとMDCK）の適切な維持管理が成功したウイルスの救助のための非常に重要です。伝統的に、遺伝?...

細胞株 293T（カタログ番号CRL - 11268）およびMDCK（カタログ番号CCL - 34）の細胞株をDMEM 10％FBS、1％PSで、5％CO 2で37℃のインキュベーター中で維持されます。細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、10801ユニバーシティブールバード、マナッサス、バージニア州。20110〜2209、アメリカ）利用可能なフォームです。 孵化鶏卵孵化10日齢の鶏の卵は、チャールズリバー研究所、特定の病原体手数料鳥サプライ（SPAFAS）鳥製品とサービスから得ることができる。フランクリンコモンズ、106ルート32、ノースフランクリン、CT 06254、米国。卵は、° C前後のウイルス感染後に37℃でインキュベートする。ウイルス感染前と後、卵は、胚の生存性を決定するためにcandledされています。それは、ウイルス感染前と後に死んだ卵を探すことが非常に重要です。感染する前に死んだ卵は、簡単に血管の欠如だけでなく、胚の移動性の欠如を見破ることができます。 candledときは、ライブ胚が移動する。ウイルス感染後に死んだ卵は、（おそらくインフルエンザウイルスの感染に関係する）簡単に尿膜腔液の小さい方と流血の量によって見られるように卵の外観不良が発見されます。感染の卵は、二重オートクレーブバッグに破棄され、標準的な手順は、次のオートクレーブ処理されています。 ニワトリ赤血球（RBC） ニワトリ赤血球はTruslowファーム、201バレーロード、チェスター、MD 21620から購入することができます。 4℃で保存します。 HAアッセイのために、50 ml遠心チューブにPBS 1X 45mlのチキンRBC 5 mlを洗う。 1000年のrpm、室温で5分間、遠心します。注意深く上清を捨て、PBS 1Xでペレット化RBC（0.5-1.0％RBCの最終濃度）の1:1000希釈を使用してください。 組織培養上清や尿液 、組織培養上清や尿液の両方を4℃で短期間保存することができる。ウイルスの救助を確認した後、細胞上清や尿膜液からのウイルスは、-80℃で保存されていますプラスミドすべてのプラスミドは、メーカーの推奨に従ってプラスミドマキシキットを用いて調製されています。すべてのプラスミドは、のddH 2 Oで1μg/ mlの濃度で分注しており、-20℃で保存短期記憶のために、プラスミドは4で維持することができます℃を精製プラスミドDNAの濃度は純度が260:280 nmの比を用いて推定されていると、260 nmでの分光光度法により決定されます。 1.8から2.0 260:280 nmの比率を持つ準備がウイルスの救助の目的のために充当とみなされます。さらに、プラスミド濃度および純度は、アガロースゲルクロマトグラフィーで確認してください。 Ambisense PDZプラスミド（6）8つのインフルエンザA/PR/8/34ウイルス遺伝子（7）を含む、図2に示します。 ウイルスインフルエンザA/PR/8/34を救出するために記述されているプロトコルは、バイオセーフティーレベル（BSL）2の条件下で行うことができます。組織培養上清および孵化卵を含む汚染物質は、廃棄前に滅菌する必要があります。他のインフルエンザウイルスの救助は、より高いBSL条件を必要とし、従って、特別な条件/セキュリティ測定が続いする必要があります。 組織培養培地およびソリューション DMEM 10％FBS 1パーセントPS：445ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）を50ml、および100Xペニシリン/ストレプトマイシン（PS）5mlの。 4℃で保存します。このメディアは、トランスフェクションのためだけでなく、293TとMDCK細胞を維持するために使用されます。 DMEM 0.3％BA 1パーセントPS：DMEMの495.7ミリリットル、35％ウシアルブミン（BA）の4.3ミリリットル。 4℃で保存します。使用直前に、1μg/ mlの終濃度にTPCK処理されたトリプシンを追加する。感染媒体。 塩化ナトリウム80gの、塩化カリウム2gを、のNa 2 HPO 4 · 7H 2 O、KH 2 2gのPO 4の11.5グラム：10Xリン酸緩衝食塩水（PBS）。最大1リットルのddH 2 Oを追加。 7.3にpHを調整する。オートクレーブで滅菌。室温で保管してください。 1X PBS：のddH 2 Oで希釈し、10 × PBS午前1時10分室温でオートクレーブや店舗によって滅菌する。

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

インフルエンザ研究グループの数による努力はインフルエンザウイルスの逆遺伝学の発展と向上に極めて重要なされている。もともと1999年に設立さ<sup&gt; 1,2</sup具体的な質問は、遺伝子組み換え、感染症、組換えインフルエンザウイルスによって応答されているため、組換えウイルスを生成するために&gt;プラスミドベースの逆遺伝学的手法では、インフルエンザの研究分野に革命をもたらしています。このような研究は、ウイルス複製、ウイルスタンパク質の機能、ウイルスの複製および/または病原性のウイルスタンパク質に特異的変異の寄与と、また、外来タンパク質を発現する組換えインフルエンザウイルスを用いてウイルスベクターが含まれています<sup&gt; 3</sup&gt;。

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

30.2K ビュー.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

免疫・感染学

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

鶏卵卵におけるインフルエンザウイルスの伝播

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

豚からのインフルエンザAウイルスの検出および単離のための鼻ワイプ

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...