このプロトコルは、ヒトドナーの免疫レパートリーを尋問して、希少な抗原特異的B細胞を同定するために使用できるため、重要である。この技術は、私たちは、迅速にクローン化することができ、ネイティブペアの重鎖と軽鎖を取得し、その後、目的の抗原または抗原に対して直接テストすることができます。手順を実証することは、私たちの研究室の技術者であるマイク・モートンです。
解凍および回復後少なくとも1時間は、遠心分離によりドナーPBMCを収集する。そして、カウントのための氷冷MESバッファーの50ミリリットルで細胞を再中断します。ペレット細胞を別の遠心分離により、CD22陽性B細胞を標準的なプロトコルに従ってCD22マイクロビーズで正選択して単離した。
ビーズ単離CD22陽性細胞を遠心分離により回収し、Vax緩衝液濃度の1ミリリットル当たり7番目の細胞に4倍10回で細胞を再懸濁する。優しい混合でメーカーの希釈勧告に従ってIgG CD19 CD27抗体カクテルを細胞に加え、アリコート10を第7細胞に1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに加え、陰性対照を行います。二重標識されたビオチンステタビジン四量体を、PEおよびAPCを有する36ナノモルの最終濃度でネガティブコントロールチューブに加え、並べ替えチューブ内のペプチドの数を掛けます。
各チューブの最終容積を新鮮なVaxバッファーで2.5ミリリットルに持ち込み、各PEとAPCの36ナノモルでペプチド四量体をチューブソートに加えます。遠心分離後、細胞をTBS濃度の100マイクロリットルあたり10倍から6分に2倍にし、暗闇の中で摂氏4度、回転させます。インキュベーションの終わりに、個々の5ミリリットルフィルターキャップチューブにサンプルを緊張させる前に、洗浄ごとに新鮮なTBSバッファーで細胞を2回洗浄します。
細胞膜完全性のマーカーとして、DAPIの0.3マイクロモル最終濃度でサンプルを染色します。また、セルソーターで負のコントロール全体を実行して、単一細胞のソートに適した細胞集団を分離するためのフローサイトメトリーゲートを設定します。抗原PE対抗原APCをプロットし、R8ゲートを抗原PE陽性に設定し、APC陽性のクアドラントを二重陽性ゲートでイベント数が少ない。
次いで、シングルCD19陽性CD27陽性抗原PE陽性、抗原APC陽性細胞をマスターミックスの個々のウェルに選別し、96ウェルプレートを調製した。種類の最後に、アルミニウムテープパッドでプレートを覆い、マイナス80度の貯蔵前に400倍gで1分間遠心分離します。逆転写酵素反応を行うために、氷上でソートされたB細胞を2分間解凍してから、プレートを3300回gで2分間回転させ、開封前にウェル内容物をプレートの底に引っ張ります。
適切な酵素マスターミックスで細胞を処理した後、各PCR反応のテンプレートとして2.5マイクロリットルの無料DNAを添加し、各反応に1マイクロモルの最終濃度にプライマーを加えます。次に、各ウェルに2倍濃度の10倍のポリメラーゼバッファーを加え、反応ごとに最終体積を25マイクロリットルにします。そして、50サイクルの重鎖および軽鎖PCR反応をそれぞれ実行します。
反応の最後に、1%アガロースゲルでサンプルを実行し、陽性増幅ヒットを可視化します。ゲル抽出を介して同じ細胞から対にした重鎖と軽い連鎖反応の両方を分離します。正確なライゲーションミックス計算のために60までの光学濃度でDNA断片濃度を決定する。
回収した重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントをリンカーフラグメントと発現ベクター骨格と組み合わせ、メーカーの指示に従って4フラグメントライゲーション反応を行います。そして、製造業者の指示に従って、ライゲーション反応を化学的に有能な細菌に変換します。抗生物質プレートにメッキを施したら、抗生物質を含む4ミリリットルの成長培地を、毎分250回転で摂氏37度で一晩インキュベーションするための残りの変質培地に加える。
翌朝、製造者の指示に従って一晩のライゲーションミックス培養物からミニプレップDNAを調製し、得られたプラスミドDNA濃度を決定する。単離された抗体の抗原特異性を確認するために、293細胞の10ミリリットルの懸濁液中のカチオン性脂質塩基試薬を用いて10マイクログラムの小型準備DNAをトランスフェクトする。細胞培養物を摂氏37度、8%の二酸化炭素、1分間に125回転で3~4日間インキュベートします。
インキュベーション終了時、培養物を1000倍gで10分間遠心し、清浄化培地を回収する。プロテインAに対する親和性を介して上清中のIgG濃度を測定し、ELISAによる1ミリリットル濃度あたり25マイクログラムの上清中の各抗体を、標準ELISAプロトコルに従ってソートに使用される個々のペプチドに対してテストします。次に、IgG上清の希釈を用いて追加のELISAでスクリーン陽性ヒットを確認し、1ミリリットル当たり20マイクロリットルから始まり、第一画面ELISAに反応性を示す各抗原の光学密度に対してプロットした濃度曲線を生成する。
抗原特異的抗体をヒトドナーから単離するために、一連のサイトメトリーゲートを考案して標的記憶B細胞を単離することができる。リンパ球は、前方および側面散乱を用いて、細胞の大きさと粒度に基づいて単離される。ダブレットおよび死細胞の排除に続いて、表向きマーカーはIgG陽性CD19陽性B細胞およびCD27陽性記憶B細胞の分離を可能にする。
単一細胞クローニングの最初の読み出しは、それぞれの重鎖および軽い可変鎖の増幅の確認である。ここで、PCR後に42%対回収した24個の単一細胞からの非常に効率的な増幅の例が示される。IgGクローニング後、IgG発現ベクターはヒト胚性腎臓293細胞にトランスペッキングされる。
回収された抗体は、ELISAによって反応性について採点されたタウペプチドの元のパネルに対してスクリーニングされる。その後、第一画面で同定されたペプチドに対して同一の組換え抗体サンプルの濃度曲線を用いて追加の確認が完了する。陽性ヒットごとに、個々のプラスミドクローンを変換されたプールから分離し、同じELISA法によって再確認することができる。
目標は単一細胞からの増幅配列であるため、覚えておくべきことは、この手順のPCR部分で汚染が増幅されることです。この手順は、ヒト組換え抗体をそのまま生成し、生成したいだけ多くの抗体の精製と機能特性を可能にします。
