Name: generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology
Uploaded: 2017-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
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The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

ポツダム大学（ポツダム、ドイツ）での我々の繁殖コロニーからのBalb / CまたはNMRIマウス（ ハツカネズミ）は、モノクローナル抗体の産生のために使用しました。動物の作業は関連する国内および国際的なガイドラインに従って行いました。研究はブランデンブルク環境省、健康、および消費者保護（参照番号V3-2347-A16-4-2012）によって承認されました。 免疫複合体の調製<ol><li>担体に抗原を結合するための、アミノ末端を介して、標準的なカップリングプロトコルを使用して、カルボキシ、またはグルタルアルデヒドなどによるスルホ基、N - （3-ジメチルアミノプロピル） - Nエチルカルボジイミド（EDC）、またはN - [Y-マレイミド]スクシンイミドエステル（スルホ-GMBS）。 </li><li> 1の比率：カップリング（ 例えば、グルタルアルデヒド）13については、1で標的タンパク質またはペプチドと担体（オボアルブミン、ウシ血清アルブミン、またはキーホールリンペットヘモシアニン）を使用します。広報目標を希釈oteinまたはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び50mMのNaHCO 3緩衝液中の担体タンパク質中のペプチド。ボリュームと予防接種のために必要な量の濃度に適応させます。 <ol><li>両方の溶液を混合し、1.25％グルタルアルデヒドを追加します。室温（RT）で4時間サンプルを混合し、インキュベートします。ハイブリドーマ細胞を選択するために、同一の免疫複合体を作るが、他のキャリアと、非特異的キャリアバインダーの選択を回避するために。 </li></ol></li><li>商業粗樹脂（ 例えば 、セファデックスG25）で高速透析を行うことによって、結合サンプルを透析。 <ol><li>中空針で1.5 mLの反応バイアルの底を穿孔し、15 mLチューブに入れてください。封止用の底にガラスウールを入れて、（0.5ミリリットルのキャリブレーションマークに）粗樹脂の300ミリグラムでそれをカバーしています。 </li><li>慎重に、1.5 mLの反応管に1mLのPBSの滴下を入れて、ガラスウールがまだ穿孔を密閉していることを確認します。粗樹脂のをしてみましょうウェルおよび2分間、500×gでカラムを遠心します。そのようなカラムは、結合サンプル200μLを透析するために使用することができます。高いボリュームの場合、複数の列を作ります。 </li><li>チューブを変更し、膨潤し、粗樹脂上にカップリング溶液をドロップします。 2分間、500×gで再び遠心分離。チューブから溶離液を取り出して、免疫のためにそれを使用しています。 </li></ol></li></ol>動物の2.予防接種<ol><li>免疫のための2つまたは3 6〜12週齢のBalb / cマウスを選択してください。 </li><li> 1動物のために、150準備 - PBSの200μLで免疫複合体の200μgのを、完全Freund&#39;sアジュバント（CFA）の100μLと混ぜます。 1-mLシリンジに短くて細い針（直径0.6mm）を用いて、溶液を3回混ぜます。マウスの腹腔内にソリューションを注入します。 </li><li> 6週間後に免疫複合体の同量のブースター注射を与えるが、CFAなし。 （後眼窩洞のうち）7日後に血液を取り、prepa室温（RT）で4時間 - 3のための血液をインキュベートすることにより、血清再。 <ol><li> 5分間、3000×gで混合物を遠心分離します。血清上清を取り、新しいチューブにそれを転送します。 -20℃で保管してください。ペレットを捨てます。 </li></ol></li><li> ELISA により血清を分析し、融合のためのステップ3で説明したように、最も高い血清力価を有するマウスを選択します。 </li><li>わずか4日間融合する前に、アジュバントなしのPBS 300μLで免疫複合体の200μgの - 細胞融合の準備のために、150でマウスを高めます。 </li></ol> 3. ELISA <ol><li> PBS中5μg/ mLの濃度で抗原溶液を調製し、96ウェルプレートの各ウェルELISAに50μLを移します。 </li><li>湿潤チャンバーにおいて37℃で、または一晩、4℃で2時間、プレートをインキュベート。 </li><li>水道水でプレートを3回洗浄。湿ったCHに室温で1時間ウェル当たりPBS / 5％新生仔ウシ血清（NCS）の80μLでウェルをブロックアンバー。午前1時50分で始まる5シリーズ：1での血清希釈液を調製します。細胞培養の分析のために、希釈されていない培養上清を使用します。 </li><li>水道水でプレートを3回洗浄。ウェル当たりのサンプルのピペット50μL及び湿潤チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG抗体の5,000希釈：1で二次抗体溶液を調製します。 </li><li>水道水でプレートを3回洗浄し、ウェル当たり二次抗体溶液50μLを追加します。湿潤チャンバーにおいて室温で45分間インキュベートします。 </li><li>新鮮な基質溶液を準備します。 0.1 MのNaH 2 PO 4、0.1％過酸化水素のストック溶液を作ります。 5部のNaH 2 PO 4、4部の過酸化水素と、新鮮な基質溶液1部のテトラメチルベンジジンを取ります。 <ol><li>水道水でプレートを10回洗浄します。ピペットで50ウェルに新鮮な基質溶液のμLと5インキュベート - で10分ダーク。 </li></ol></li><li> 50μL1 MH 2 SO 4ウェルあたりで反応を停止させます。プレートリーダーを用いて、630 nmの参照波長を用いて450nmで光学密度を測定します。 </li></ol>骨髄腫細胞培養の4準備<ol><li>今から、無菌条件下ですべての作業を行います。 </li><li>細胞培養のための新鮮な培養培地を準備します。 10％ウシ胎児血清（50 mL）を、2mMのL-グルタミン（5 mL）を加え、50μMメルカプトエタノール（5 mL）でRPMI1640 500mLのを補います。 7日ごとにグルタミンを代入します。 </li><li>温水中でネズミSP2 / 0細胞のバイアルを解凍します。 200×gで10分間、新鮮な培養培地と遠心分離機を10mLに細胞溶液を移します。上清を捨て、新鮮な培養培地1mLにペレットを再懸濁。 </li><li>インキュベーターで25 cm 2のフラスコ中に細胞を移し、37℃でそれらをインキュベートし、5％CO 2。 2 75-メートル2フラスコBEFに細胞を拡大鉱石融合。ステップ7で説明したように、長期保存のためにアリコートを節約します。 </li></ol>フィーダー細胞の5準備<ol><li> （国や機関のガイドラインによると、 例えば、CO 2吸入によって）12週齢のNMRIマウスを生け贄に捧げます。毛皮を削除し、70％エタノールで腹部をきれいに。 </li><li> 、腹部に氷冷RPMI培地の5ミリリットルを注入しピンセットで腹部をマッサージし、フィーダー細胞懸濁液を吸引。空の50 mLチューブに細胞を配置します。もう一度この手順を実行します。フィーダー細胞懸濁液の7〜10 mLを取り出さなければなりません。 </li><li>完全な細胞培養液の90ミリリットル（RPMI 1640,10％ウシ胎児血清、2mMグルタミン、および50μMメルカプトエタノール）を添加することによって100mLのフィーダー細胞懸濁液を調製します。それを混合し、10×96ウェル細胞培養プレートに100μL/ウェルを転送します。一晩インキュベーター内で37℃、5％CO 2で培養します。 </li></ol> 6.細胞融合<ol><li>頸椎脱臼またはCO 2吸入によって免疫したマウスを犠牲にし、脾臓14を切り出します。 ELISAで陽性対照として、ステップ2.3で説明したように、心臓から追加の血を取り、血清を準備します。 </li><li>セルストレーナーを通して脾臓を押すことにより脾臓細胞懸濁液を準備します。完全な細胞培養培地で20 mLに埋めます。遠心分離（200×gで、10分間、4℃）で50-mLチューブ中の細胞を収穫。上清を捨てます。 </li><li>細胞培養フラスコをリンスし、遠心分離により骨髄腫細胞を採取する（200×gで、10分間、4℃）、上清を捨てます。 </li><li> 20平衡塩緩衝液のML（BSS）に細胞ペレットを再懸濁し（125ミリモルのNaCl、5mMのKClを、4ミリモルのCaCl 2、2.5のMgCl 2、および5mMのTris-HCl、pH7.4）で遠心分離を再び。洗浄を3回ステップを繰り返します。 </li><li>脾細胞調整する：骨髄腫細胞の割合を、モミによって第2の洗浄工程の後に細胞を計数BSSバッファー1mLにペレットを再懸濁セント。 1:10希釈を行い、細胞計数室に10μLを移します。細胞をカウントし、1 mLの細胞濃度を決定します。 </li><li> 1 mLの最終容量で三部品脾細胞と一部品骨髄腫細胞をBSS緩衝液中の細胞数を調整します。細胞懸濁液200μLを取り、PEG8000の200μL（BSS緩衝液4mL中1グラム）と混ぜます。 2ミリメートルの直径を有するエレクトロポレーションキュベットに400μLを移し、パルス設定（600から650 Vと25ミリ秒）。 <ol><li>パルス後、キュベット中で3分間室温で細胞を培養します。細胞を除去し、それらをHAT培地100ml（RPMI 1640、10％FCS、2mMグルタミン、50μMのメルカプトエタノール、100μMのヒポキサンチン、5.8μMアザセリン、および16μMチミジン）との三角フラスコに滴下して入れました。 </li><li> 1-mLのバッチが費やされるまで融合を4回繰り返します。 37℃、5％CO 2で3時間、三角フラスコをインキュベートインキュベーターインチ</li></ol></li><li>フィーダー層上に細胞をプレーティングする前に、ヒポキサンチン、アザセリン、およびチミジンを再び細胞懸濁液を補います。 （インキュベーター内で）フィーダー層プレートにウェル当たり100μLの細胞懸濁液を加え、37℃でプレートをインキュベートし、5％のCO 2。ウェル内の最終濃度は、100μMヒポキサンチン、5.8μMアザセリン、および16μMチミジンをすべきです。 </li><li>ウェルは、モノ - またはポリクローナルであるかどうかを判断するために、7日後のプレートの各ウェル中のクローン増殖のために：顕微鏡分析（10X対物レンズ、10X接眼倍率）を実行します。モノクローナル細胞は、1つの単一細胞に由来する細胞の1クラスタです。ポリクローナル細胞は、1つのウェル中の細胞の複数のクラスタです。 7日後に完全なメディアを変更し、HAT培地中で7日間再びインキュベートします。 </li><li> HAT培地を変更して、完全な細胞培養培地中で細胞を培養。 Eを実行するために上清を使用して、LISAは、ステップに記載されるように3陽性ハイブリドーマ細胞は、特異的抗体の産生のための試験によれば、24ウェルプレートに拡張しなければなりません。細胞がポリクローナルである場合は、限界希釈（ステップ8を参照）を実行しなければなりません。 </li></ol>ハイブリドーマの7.凍結保存<ol><li>長期保存のための正のモノおよびポリクローナルハイブリドーマをCryoconserve。遠心分離により&gt; 60％のコンフルエンスで24ウェルプレートから細胞を採取（200×gで、10分間、4℃）。 </li><li>完全な細胞培養培地の500μLにペレットを再懸濁し、クライオチューブにそれを転送します。 、凍結培地の500μL（RPMI 1640、20％FCS、および15％のジメチルスルホキシド）を追加し、それを混合し、発泡スチロールの箱や特殊な冷凍ボックスの中に入れます。 3日間-80℃で保管してください。 3日後、クライオチューブは、長期保存のために液体窒素に移すことができます。 </li></ol> 8.ポリクローナルハイブリドーマの限界希釈法<ol><li>マックステップ7.1で説明したように、ステップ5ハーベスト陽性のポリクローナル細胞に記載されているように、EAフィーダー層培養物。ステップ6.5で説明したように、細胞を計数し、96ウェルプレートのために10 mLの最終容量で、10 6細胞/ mLに細胞数を調整します。フィーダー層上に100μL/ウェルを追加します。 </li><li> 37℃で7日間インキュベートし、顕微鏡（倍率：10倍対物レンズ、10Xアイピース）のクローン性増殖を分析。ステップ3で説明したように、培養上清のELISAを行い、大量培養のための適切なモノクローナルハイブリドーマを同定。 </li></ol> 9.大衆文化およびモノクローナル抗体の精製<ol><li> 25cm 2のまたは75cm 2のフラスコに、適切なELISAシグナルを有するモノクローナルハイブリドーマを移し、培養上清の500 mLに、最大収集します。特異的抗体産生のための培養毎週をテストし、3節約 - ステップ7で説明したように、長期保存のためのハイブリドーマあたり5アリコートを。 </li><li&gt;遠心分離機15分間4900×gで4℃で培養上清および0.45μmのフィルターを通してそれをフィルタリングします。 1の比率：3でバッファ（4 M NaClおよび2 MグリシンのNaOH、pHは8.9）を結合して、上清を混ぜます。 </li><li> （：のdH 2 Oで3結合緩衝液1を希釈）洗浄バッファーでそれを洗浄することにより、タンパク質をカラムを準備します。カラム上でステップ9.2から上清をパスし、フロースルーを収集します。 0.1 Mクエン酸、pHが3.5と結合した抗体を溶出し、トリス塩酸の500μL、pHは9.0ですぐにpH値を中和します。 </li><li> SDS-PAGE、ウエスタンブロット、およびELISAによって溶出した抗体を特徴付け、そして最終的なアプリケーションのためにそれを検証します。 <ol><li> 4×SDSサンプルローディングバッファー（8％SDS、20％2-メルカプトエタノール、40％のグリセリン、および0.015の5μLを追加し、レーンあたり精製された抗体溶液（20μLのサンプル）の5μgの - SDS-PAGEのために、3を取ります％ブロモフェノール、還元）、および95℃で5分間、プローブを加熱します。対照として、精製されたAと同じサンプルを使用同じアイソタイプが、無関係な特異性のntibody。 </li><li> 、12.5％SDSゲル上でサンプルをロードし、追加のレーンに未染色タンパク質ラダーの5μLを配置し、電気泳動によりそれらを分離。クマシーブリリアントブルーでゲルを染色し、結果を文書化します。基本的なSDSプロトコルは、1970年15でレムリによって設立されました。 </li></ol></li></ol>

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The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

ハイブリドーマ技術によってモノクローナル抗体の生成は、抗体が標的を認識しなければならないときに、特に最終的なアプリケーションに関しては、強烈かつ詳細なエピトープ分析を必要とします。これは、多くの場合、ユーザーが過小評価と弱いパフォーマンスには抗体につながります。融合プロセスは、特定のハイブリドーマの結果は、この時点で細胞比および活力に大きく依存する?...

このプロトコルで提示されたハイブリドーマ技術は、最初のいくつかの技術的な改良を除いて、主な手順は最後の40年2の間に劇的に変化していない、1975年にケーラーとミルスタイン1によって説明しました。このプロトコルの目的は、より適切な免疫戦略、モノクローナル抗体の生成のための標準的な方法、および検証法（ELISA）のための一例を説明することです。 抗体は、信じられないほどのツールであり、そのようなフローサイトメトリー、磁気細胞選別、または免疫蛍光などの技術的アプローチ、の広い範囲、ならびに疾患のモニタリングおよび処置の3のための診断と治療法の選択肢に貢献しています。希望するターゲットのためのモノクローナル抗体の商業的利用可能性は、抗体または抗体関連製品4のほぼ無数の量と24以上の異なるウェブデータベースの存在によって証明されます。 2015年には、ntibody分子は、市販の抗体の適切な検証および特性評価に深刻な問題に起因する国際的な議論5-7の一部でした。 標的抗原に特異的な抗体を見つけることは困難かつ高価であり、多くの場合、それらは、親和性または特異性が必要ありません。抗体を生成することはまだ時間がかかり、かもしれない、より良いものを購入するよりも、個別の抗体を産生する、開発し、抗体を検証するために熟練した人材を必要としますが。 抗体産生は、時間がかかると経験を必要とするという事実のために、結合分子の産生のための代替的な方法は、これらの問題を克服するために開発されました。最も一般的に使用される別の方法は、ファージディスプレイを介して、単鎖抗体の組換え産生です。可変結合領域の遺伝子は、細胞から抽出されたファージの被覆タンパク質と組み合わされます。のイングル鎖は、次いで、バクテリオファージの表面に発現され、いくつかのパニングの工程8にスクリーニングされます。単鎖抗体の産生が少し高速であるが、それはまた、熟練した実験者を必要とします。いくつかの組換え単鎖抗体の欠点は、低い安定性およびインビトロ診断のための適合性の欠如です。ほとんどの診断テストでは、検出のためのFc受容体は、その後、組換え一本鎖抗体に付加する必要がある、必要です。再び、これは時間がかかり、ハイブリドーマ技術よりもさらに複雑です。 インビトロ診断では、完全長モノクローナルマウスおよびウサギ抗体が最良の選択であることが実証されています。 免疫複合体の設計を：研究室での作業を開始する前に、モノクローナル抗体を生成する際の主要なステップの一つが行われなければなりません。対処する必要のある質問は以下のとおりです。ターゲットの物理的組成物は、最終的なアプリケーションシートで何ですかイオン、及びその行列が存在していますか？どの濃度目標は、アプリケーションを持っているのだろうか？最終的なアプリケーションは何か、そして抗体が満たさなければならない要件は何ですか？ 常に線形ペプチド断片が使用される場合、それはまた、選択の対象で最終エピトープに線形でなければならないことを考慮に入れます。そうしないと、抗体が結合しないであろう。もちろん、スクリーニング方法とは無関係に、抗体は、異なる用途における異なる抗原フォーマットを認識するように選択することができるが、これは非常に正確に検証されなければなりません。これらは、抗体開発と検証は、このような野心的なプロセスである理由です。 免疫のための抗原フォーマットの選択は、抗体開発のための基本であり、このプロセスの成功または失敗を決定します。マウスは、関連する抗体力価を発現した後、脾臓細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合させます。以下のための最も一般的な骨髄腫細胞株マウスモノクローナル抗体の開発は、X63-Agの8.653 9およびBALB / cマウス株由来のSp2 / 0-Agの14 10です。細胞は、悪性B細胞リンパ腫から降りると、彼らは自分の重鎖または軽鎖のいずれかを分泌しないため、選択されました。 1（骨髄腫細胞対脾臓細胞）：細胞を1:10と10との間の比に適合させることができます。 Stoichevaとホイ11によれば、1及びポリエチレングリコール（PEG）及び電気融合により融合した。このプロトコールでは、細胞を3の比に適合させました。 B細胞とミエローマ細胞との融合は、ランダムなプロセスです。したがって、2つのBリンパ球または2骨髄腫細胞のハイブリッドを生成することができるが、これらの雑種は、培養中の長時間生存することができないだろう。細胞は、融合されたハイブリドーマ細胞を伴うピリミジン合成のデノボ経路を使用する可能性を生き残ることが可能なヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（HAT）選択を受けます。月の世代のためにoclonal抗体は、一つの母細胞に由来する細胞株を得ることが必要です。モノクローナル性希釈技術および細胞成長の顕微鏡分析を制限することによって保証されます。ハイブリドーマ培養上清は、主にELISAによって、特異的抗体産生についてスクリーニングまたはフローサイトメトリー、および最高の結合剤が選択されています。大量培養および精製の後、抗体分子は、最終的に特徴付けることができ、所望の用途のための検証します。

<table><tbody><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>keyhole limpet hemocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>reaction vials, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>hollow needle</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>glass wool</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 coarse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&amp;acute;s adjuvant, complete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA plates, 96 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>neonatal calf serum</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 200 &amp;micro;L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylbenzidine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>peroxide/urea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulphuric acid</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation cuvette, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaserine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>unstained protein ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant blue R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

図1は、実験室で実行される1つの免疫化のための抗原特異的血清力価の例を示す図です。未処置マウスの血清と比較して5,000,000：この図では、免疫血清のA及びB 1:50から1に滴定しました。抗原は、固相上に被覆し、そして特異的な抗体をPODコンジュゲートヤギ抗マウスIg抗体を用いて検出しました。免疫したマウスの両方の血清はナイーブマウスと比較し?...

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Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.4K ビュー.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

に対するモノクローナル抗体の受動的な管理 H. capsulatumとその他の真菌病原体

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

免疫・感染学

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の作製

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

抗体生成:ハイブリドーマを用いたモノクローナル抗体の産生

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Education

JoVE Science Education

高等生物学

免疫学

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

哺乳類細胞培養物からの組換えモノクローナル抗体の作製

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

抗体ベースの技術

製造と精製

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

メタロペプチダーゼに対するモノクローナル抗体作製ハイブリドーマ技術

All animal model procedures have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Animal ...

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

抗原特異的B細胞からモノクローナル抗体を作製する技術

1. Production of mAbs

	The day before the transfection, seed 15,000 Human embryonic kidney 293A (HEK 293A) cells in 200 &#181;L of Dulbecco&#39;s ...

Hybridoma Technology

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or epitope. Such antibodies are used in research, diagnostics, and disease therapy. The hybridoma technology established in 1975 by Georges K&#246;hler and Cesar Milstein was awarded the Nobel Prize in Medicine in 1984 for revolutionizing research and therapy.
Hybridoma Selection
Commonly used fusion techniques &#8212; electroporation, polyethylene glycol (PEG) mediated fusion, and the use of fusogenic viruses &#8212; generally produce hybridomas at a very low frequency. Fusion products thus have a high ratio of self-fused B-cells and myeloma cells, or unfused cells, with a low number of hybrid cells.
The hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used to select hybridomas by selectively allowing their growth. The aminopterin blocks the default nucleotide synthesis in cells. However, cells can utilize hypoxanthine and thymidine from the medium to synthesize nucleotides via the salvage pathway.
Myeloma cells deficient in the HGPRT enzyme cannot synthesize nucleotides via this pathway and thus, do not grow in HAT medium. Although B-cells produce functional HGPRT enzymes, they cannot divide indefinitely. Thus, only the hybrid cells with functional HGPT from the B-cells and immortality from the myeloma line can grow on the HAT selection medium. Such a culture of hybrid cells is called a hybridoma, which can be screened for monoclonal antibody production.
Hybridoma Screening
Hybridoma cultures from the HAT selection are plated onto a 96-well plate; each well containing only one cell. Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), each cell is screened for the production of antibodies specific to the epitope of interest. Cells that test positive are then selected and grown in a larger culture vessel to establish hybridoma cell lines. These cell lines are a permanent source of unlimited monoclonal antibodies. Thus hybridoma technology is a convenient and cost-effective method for mass production of monoclonal antibodies.

ハイブリドーマテクノロジー

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or ...