The work was funded by the Leukemia and Lymphoma Society of the USA (6105-08), a Cancer Council NSW grant (13-02), an NHMRC Senior Research Fellowship (LJB) (1042305) and project grant (1041614).

ここで説明するプロトコルは、急性リンパ芽球性白血病細胞株NALM6を使用するが、他の細胞型に適用することができます。 1.ソリューションおよび試薬<ol><li>完全RPMI <ol><li> 56ミリリットルのウシ胎児血清（FCS）およびRPMI-1640培地500mlボトルに5.5ミリリットルの200mMのL-グルタミンを追加します。 </li></ol></li><li> BrdUの原液<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で32.5 mMのBrdUを（10mg / ml）を準備します。 </li></ol></li><li> BrdUを完全RPMI <ol><li>完全RPMIの10mlまでのBrdUストック溶液6.2μlを添加します。 </li></ol></li><li> DNase溶液<ol><li> 1mgのDNアーゼ/​​ DPBSでミリリットルを準備します。 </li></ol></li><li>染色緩衝液<ol><li> DPBSで3％の熱不活性化FCSおよび0.09％アジ化ナトリウムを準備します。 </li></ol></li><li>固定バッファ、透過処理用緩衝液および洗浄用緩衝液の定義については、物質一覧を参照してください。 </li></ol> 2.細胞いいえTE：細胞はより大きい6ヶ月間培養しませんでした。この方法は、細胞密度および培養培地の調整と非付着性細胞株に直接適用可能です。実験の開始時に指数関数的に増殖している細胞を使用してください。 <ol><li>完全RPMI中のT-75培養フラスコ中NALM6細胞を維持します。クラスII安全キャビネットを使用して、無菌条件下で、すべての手順を実行します。 <ol><li>週に3回文化を分割して、1ml当たり1〜2×10 6個の細胞間NALM6細胞を維持します。 </li><li>大気中のCO 2、5％、37℃でインキュベートします。 </li></ol></li></ol> BrdUで細胞の3パルス標識注意：それは潜在的な変異原と催奇形物質であるように注意したBrdUを処理します。 <ol><li> 5分間、150×gで遠心分離した細胞。注：新鮮な培地に細胞を転送すると、結果の再現性を向上させます。 </li><li> 2×10 6℃での完全RPMI中の細胞数および再懸濁細胞を行いますells / mlの。 </li><li> BrdUの完全RPMIに1×10 6細胞/ mlの最終細胞濃度を産生して細胞を2 1に希釈します。 </li><li>その後、完全RPMIで10のセル1を希釈し、45分間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。遠心セル5分間150×gで、慎重に上清をすべて廃棄します。 </li><li>完全RPMIの少量（〜100μL）中で再懸濁した細胞は、細胞計数を行い、1×10 6細胞/ mlに調整します。 </li><li>ピペット48ウェルプレートのウェルへの細胞の1ミリリットル。ピペットより再現性のある結果を得るために、未使用のウェルにDPBSの1ミリリットル。 </li><li>所望ここ時点、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、空気中5％CO 2中で37℃でインキュベートします、18、19、20、21、22、23、及び24時間。注意：時間の長さは、実験計画を測定することを目的とするものに依存します。 </li><li>ピペットを用いてFACSチューブにすべてのセルを転送します。 1ミリリットルvoluとよく順次をすすぎます5ミリリットルの最終全容量のPBS MES。 </li><li> 5分間150×gで遠心分離し、慎重にすべての上清を除去します。細胞は、染色のための準備ができているすぐにこの（セクション4）を行います。 </li></ol> 4.細胞染色注：細胞表面染色が必要な場合は、細胞が全体に4℃に保たれることを確実に定着する前にそれを行います。 <ol><li>染色緩衝液100μl中に再懸濁細胞（任意の表面染色のためには、表面抗原と4℃で30分間インキュベートし、抗体の推奨量を追加します）。 </li><li> 、染色緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。 注記：特定の抗体濃度、インキュベーション時間等は、特定の実験の目的に応じて変化します。 </li><li>固定および透過処理<ol><li>固定緩衝液100μl中に細胞を再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。 </li><li> 1ミリリットルOを追加F洗浄バッファー、150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。 </li><li>透過化緩衝液100μlで細胞を再懸濁し、氷上で10分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 、洗浄緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。 </li><li>チューブあたり固定緩衝液100μl中に細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。 </li><li> 、洗浄緩衝液1mlを加え150×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。 注：必要に応じてプロトコルは、ここで一時停止することができます。染色緩衝液中に再懸濁させた場合に固定された細胞は、4℃で数日間安定です。先に進む前に、遠心分離後染色バッファーを削除します。 </li></ol></li><li> DNase処理<ol><li> DNase溶液100μl中に再懸濁細胞（30μgの6 DNアーゼ/ 10の細胞）および37℃で1時間、細胞を培養します。 </li><li> 、洗浄緩衝液1mlを加え5分間、150×gで遠心分離し、上清を捨てます。 </LI&gt; </ol></li><li>抗体染色 注：BrdUの以外の細胞内マーカーについて染色BrdU染色と同時に行うことができます。 <ol><li>重要：それぞれの単一の蛍光色素で標識された未染色の細胞と細胞か​​らなる補償コントロールを準備します。理想的には、実験チューブに使用されるもののような補償のコントロールに同じ抗体を使用しています。これが不可能な場合には、高度に発現される抗原に対する代替抗体は、同一の蛍光色素にコンジュゲート。 </li><li>洗浄緩衝液50μl中に細胞を再懸濁し、1μL/ BrdU抗体の10 6個の細胞を追加します。注：他の特定の細胞内抗原に直接結合した抗体を添加することもできます。 注：セリン10上でリン酸化ヒストンH3に対する抗体は、G2中の細胞を区別するために使用することができ、M、ヒストンH3のセリン10、有糸分裂の間にリン酸化されるTyr15がリン酸化CDC2に対する10抗体は、HAV細胞を検出するために使用することができます。E有糸分裂にコミット。11 </li><li>室温で20分間細胞をインキュベートします。 </li><li> 、洗浄緩衝液1mlを加え5分間、150×gで遠心分離細胞と上清を捨てます。 </li></ol></li></ol><ol start="6"><li>細胞周期分析のための染色DNA <ol><li>ペレットを緩め、7-AAD溶液（0.25μgの）の20μlを添加します。注：これは、7-AAD /セルの一定量を使用することが重要です。 </li><li>染色緩衝液1mlで細胞を再懸濁します。 </li></ol></li></ol>フローサイトメトリーデータの5集注：必要なマシンが使用する蛍光色素の数と性質に依存します。 <ol><li>リニアスケールのFSC-A、SSC-A、FSC-H（FSC-Wの代わりにFSC-Hを用いることができる）と7-AAD蛍光：次のパラメータを収集します。対数スケール上のAPCチャネルを収集します。対数スケールを用いて表面や内部のラベルの評価のために必要な追加のチャネルを収集します。 </li><li> COMを行いますサンプルを分析する前に、異なる蛍光色素との間で観察された発光スペクトルの信号の重複pensation。注：ほとんどのフローサイトメーターは、これを自動的に実行します。 </li><li>各サンプルの少なくとも10,000個のイベントを収集します。 </li></ol>フローサイトメトリーデータの分析6. 注：FlowJoソフトは、フローサイトメトリーデータ分析のために、本研究で使用したが、他のソフトウェアパッケージを使用することもできます。ゲーティング戦略は、図1に示されています。 <ol><li> FSC-AおよびSSC-Aのパラメータを使用して、生細胞集団を特定します。 </li><li>この集団内ダブレットと（もここで用いることができるFSC-W）FSC-AおよびFSC-Hを用いて凝集体を除外します。 </li><li>この集団内でのy軸上のx軸とのBrdU-APCに7-AADを用いたドットプロットを設定します。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" width="700" /> 図1：ゲーティング戦略左PA。ネル：非ゲートの細胞は、SSCドットプロット対FCS-Aに示されています。生存可能な細胞集団を示したゲートによって識別されます。センターパネル：左パネルからゲート細胞は、FSC-Hドットプロット対FSC-A（FSC-Wの代わりに高さを使用することができます）に表示されます。ダブレットと凝集体が同定され、示されたゲートで除外されています。右パネル：中央のパネルで二重排除日からゲート細胞は、APC-ドットプロット対7-AADに表示されます。 BrdU抗体は、APCをパルス標識中のBrdUを取り込んだ細胞の同定を可能に標識されています。 7-AADは、DNA含有量についての情報を提供します。上部ゲートは、BrdUのための陽性細胞を定義するため、S期でのBrdUパルスの時に、左下のゲート、G 0/1のセルと右下のゲートGのもの2 / M。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig1highres.jpg" target="_blank">表示するにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。</a> <ol start="4"><li>細胞周期A<html> nalysis <ol><li>ダブレット排除ゲート内の細胞の最初のデータ·ファイルとゲートを開きます。 </li><li> （FloJoソフトウェアのプラットフォームの下に位置する）は、細胞周期分布のために、この集団を分析し、ディーン·ジェット·フォックスモデルを使用します。 </li><li>ゲートを作成し使用してG 0/1およびG 2 / Mピークの位置を取得します。 </li><li> BrdU陽性細胞と被写体上のゲートと同じ細胞周期分析にこの集団。 </li><li>作成ゲートから同じゲートを適用し、G 0/1およびG 2 / Mピークの位置について（作成したゲートを使用）制約を設定することにより、G 0/1およびG 2 / Mピークの位置を提供します。これは、 図2の第2のパネルに示されています。 注：他のソフトウェアは、データを分析するために使用されてもよく、命令は、それに応じて変化するであろう。 </li></ol></li></ol>840 / 52840fig2highres.jpg &quot;幅=&quot; 700 &quot;/&gt; 図2：細胞周期の進行最初のパネル（全細胞）を二重排除ゲートによって定義された細胞集団にゲートされます。この集団は、X軸上の7-AADとヒストグラムで表示しました。 G 0/1ピークのピークが軸の下の矢印で示されています。 図1に示すように、後続のパネルでのBrdU陽性細胞にゲートされている。得られたG 0/1位置の値を二重排除ゲートのゲートは、FlowJoソフト細胞周期ソフトウェア内のBrdU陽性のゲート細胞に適用した場合。 図1および第2のパネルに示すように、全体の人口を分析したときに得られる値に基づいて、G 0/1ピークの位置に示すように後続の各パネルには、BrdU陽性集団にゲートをしました。同じSAMPでのBrdU陽性細胞のためのG 0/1集団の位置を特定するためのBrdU陰性画分を使用しましたルは、サンプル間のDNA染色の強度のわずかな違いを制御します。各パネルに表示される数は、BrdUのパルスが終了してからの時間を表しています。計算された細胞周期相は日陰緑色で示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52840/52840fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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The authors have nothing to disclose.

細胞周期を分析する能力は、癌生物学および細胞増殖と成長に影響を与える両薬物および遺伝子の作用機序を理解するために重要です。報告によると、細胞増殖を測定するアッセイの多数がありますが、大半は単に本数細胞を示す尺度を提供します。これらは、直接可視化、カウント、代謝活性またはATP濃度によって細胞数を測定するアッセイが含まれます。これらの方法の多くの主な利点?...

細胞周期の進行の間に細胞内で起こる細胞周期の機能と変更点の評価は、生物学の多くの側面、特に癌の生物学を理解するための基本です。悪性腫瘍の治療のために開発中の多​​くの薬剤は、細胞周期の進行に大きな影響を持っているか、細胞周期依存性の機構を介して、細胞死を誘導します。細胞周期の特定の期における細胞周期動態または細胞を研究するためには、細胞を同期させることが一般的です。しかし、同期化方法は、潜在的に得られた結果を混乱させる、研究された細胞に有害な影響を有し得る。1近年、細胞周期の特定の段階でのみ存在する蛍光タグ付きタンパク質の使用は、時間をかけて、単一細胞における細胞周期進行の分析を可能にしました2、ただし細胞は遺伝的にこれを読み取ることができるシステムへの使用を制限する、これらの標識タンパク質を発現するように操作する必要性を検討しますILY達成。 細胞周期は、2つのアクティブフェーズで構成されています細胞分裂が起こる合成DNAが複製される（S）相、有糸分裂（M）を。これらの相は3ギャップ相、G 0、G 1及びG 2で分離されています。 G 0または休止は、細胞は、細胞が前のDNA複製および細胞増殖は、DNA複製の完了との間が、細胞分裂の前に続けてG 2のサイズの増加ここで、G 1は 、周期を離れた休止期です。細胞周期の進行は、チェックポイントの数によって制御されます。環境条件がDNA合成の支援ではなく、S期への進入を防止するときG 1チェックポイントが活性化されます。イントラS期チェックポイントまたは遅延は、停止した複製フォークで生じ得るDNA損傷によって誘発することができます。 G 2の間、複製されたDNAの忠実性が確認され、損傷をG 2、検出された場合</サブ&gt;チェックポイントは、前の細胞分裂にDNA修復を可能にする活性化されます。有糸分裂の間の最終的なチェックポイントは、細胞分裂が正常に完了することができるように、染色分が正常に分裂プレートに整列されていることを保証します。これらのチェックポイントの3活性化は、一般的に細胞集団を同期するために使用されます。細胞周期チェックポイントは、多くの要因によって活性化することができるが、癌生物学において最も一般的には、DNA損傷の検出です。 DNA損傷応答はPI3キナーゼ様キナーゼ毛細血管拡張性運動失調およびRAD3関連（ATR）は、それぞれ、下流のエフェクターキナーゼのChk1およびChk2での活性化血管拡張性失調症変異した（ATM）によって開始される。3イベントの範囲は、ストールを含めたChk1を活性化させます複製フォーク、DNAの架橋、および紫外線損傷はChk2では、主に二本鎖切断によって活性化されます。 細胞周期iの長さに変更された条件の影響を研究するための通常の方法細胞周期の特定の段階において細胞を同期させるための1本は、いくつかの方法を介して達成することができます。細胞は、物理的サイズ、密度、側方散乱（粒度）、および細胞表面マーカーの発現に基づいて分離することができます。具体的には、細胞は、化学的手段によって同期させることができます。チミジン、ヒドロキシ尿素及びシトシンアラビノシドのようないくつかの薬剤は、薬剤が除去された後に循環を続けるS期における細胞の蓄積を生じ、細胞周期のS期におけるDNA合成を阻害するために使用することができます。またはM期のDNA含量-有糸分裂紡錘体、G 2と逮捕の形成を防止するノコダゾール、で処理した細胞。 G 0期の細胞の蓄積培地結果から血清の排除。培養血清中の栄養素の再添加は、細胞の正常な循環を再起動します。しかし、これらの同期方法の全ては、細胞の正常な循環と成長を妨害することが可能とresul有意な細胞死でT。 急性リンパ芽球性白血病細胞の同期は特に困難であり、これらの細胞は、遺伝子操作に適していません。ここで説明する方法は、細胞周期動態の評価と、従来の同期または遺伝子改変することなく、細胞周期の特定の段階にある細胞の研究を可能にします。この方法は、遺伝子改変し、従来の同期手順は容易に達成されていない他の細胞型のために有用であり得ます。この方法は、細胞の短期の成長および増殖にはほとんど影響を与えブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込み、長い確立使用に基づいている。4設立のBrdUプロトコルはS期の間に新たに合成されたDNAへのBrdUの取り込みを利用します。これは恒久的にBrdU露光中、S期にあったように、細胞をマークします。この集団は、BrdUのincorporために染色することにより、後の時点で識別することができエーション、それにより追跡し、細胞周期の通過に対する薬物効果の研究を可能にする時間をかけて評価することができる同期集団として機能します。 BrdUを通常DNアーゼまたは酸処理した後の達成、前抗体染色にさらされる必要がある。6,7取り込まれたBrdUは、追加のマーカーを含めることができ検出するために、フローサイトメトリーを使用しました。最も重要なのは、試験の開始時にS期にあった細胞の細胞周期分布の評価を可能にする、DNA含有量を測定するための色素の使用である。8さらに、追加の表面または細胞内抗原はまた、研究することができる。9、これらなどのKi67として、またはそのような切断されたカスパーゼ3のようなアポトーシスマーカーとしての一見無関係な細胞機能への細胞周期のイベントに関連してもよいです。潜在的な用途は、研究者の想像力によって制限されています。

<table><tbody><tr><td>APC BrdU Flow Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>552598</td><td>Contains BrdU antibody, 7-AAD and BD Cytofix/Cytoperm&lt;br/&gt; Buffer (referred to as Fixation Buffer)</td></tr><tr><td>BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>561651</td><td>Referred to as Permeabilization buffer</td></tr><tr><td>BD Perm/Wash Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Referred to as Wash buffer</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D-4513</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12 x 75&amp;nbsp;mm FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR FORTESSA flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FORTESSA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman</td><td>Gilson</td><td>P2, P20, P100, P1000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 ml</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>FisherBiotec</td><td>FBS-7100113</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&amp;prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>B5002-1G</td><td></td></tr><tr><td>Falcon TC 150&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; vented Flasks</td><td>BD Biosciences</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes 25&amp;nbsp;ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Interpath</td><td>24700</td><td></td></tr><tr><td>Aersol Pipettes 1&amp;nbsp;ml</td><td>Interpath</td><td>24800</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Spintron</td><td>GT-175R</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Binder</td><td>C 150</td><td></td></tr><tr><td>AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) Antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>9708S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2197S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling</td><td>2348S</td><td></td></tr><tr><td>NALM6&amp;nbsp;</td><td>DSMZ</td><td>ACC-128</td><td></td></tr></tbody></table>

temporal tracking of cell cycle progression using flow cytometry without the need for synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

この方法は、情報の範囲を得るために使用することができます。いくつかのアプリケーションは、ここで概説されています。 細胞周期の継続時間の評価細胞周期を介して通過する細胞のために必要な時間を決定するために、細胞を、BrdUのパルス後の種々の時点で採取します。評価の間隔は、分析される特定の細胞に適応させることができます。造血...

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同期を必要としないフローサイトメトリーを使用した細胞周期進行の時間的追跡 |生物学 |ビデオ

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

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19.1K ビュー.  Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney. このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。 

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Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

遺伝学

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer treatments as used in clinical oncology. It enables a quantitative and longitudinal analysis of the DNA damage response after genotoxic stress, as induced by radiotherapy and a multitude of anti-cancer drugs. The method covers all stages of the DNA damage response, providing endpoints for induction and repair of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle arrest and cell death by apoptosis in case of repair failure. Combining these measurements provides information about cell cycle-dependent treatment effects and thus allows an in-depth study of the interplay between cellular proliferation and coping mechanisms against DNA damage. As the effect of many cancer therapeutics including chemotherapeutic agents and ionizing radiation is limited to or strongly varies according to specific cell cycle phases, correlative analyses rely on a robust and feasible method to assess the treatment effects on the DNA in a cell cycle-specific manner. This is not possible with single-endpoint assays and an important advantage of the presented method. The method is not restricted to any particular cell line and has been thoroughly tested in a multitude of tumor and normal tissue cell lines. It can be widely applied as a comprehensive genotoxicity assay in many fields of oncology besides radio-oncology, including environmental risk factor assessment, drug screening and evaluation of genetic instability in tumor cells.

The presented method combines the quantitative analysis of DNA double-strand breaks (DSBs), cell cycle distribution and apoptosis to enable cell cycle-specific evaluation of DSB induction and repair as well as the consequences of repair failure.

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

がん研究

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, senescence is a fundamentally different machinery restraining&#160;propagation of cancer cells. Decades of scientific studies have revealed the complex pathological effects of senescent cancer cells in tumors and microenvironments that modulate cancer cells and stromal cells. New evidence suggests that senescence is a potent prognostic factor during cancer treatment, and therefore rapid and accurate detection of senescent cells in cancer samples is essential. This paper presents a method to visualize and detect therapy-induced senescence (TIS) in cancer cells. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cell lines were treated with mafosfamide (MAF) or daunorubicin (DN) and examined for the senescence marker, senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the DNA synthesis marker 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU), and the DNA damage marker gamma-H2AX (&#947;H2AX). Flow cytometer imaging can help generate high-resolution single-cell images in a short period of time to simultaneously visualize and quantify the three markers in cancer cells.

Here we present a flow cytometry-based method for visualization and quantification of multiple senescence-associated markers in single cells.

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

生物学

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

免疫・感染学

実験間の比較のための同期時系列データのアライメント

Alignment of Synchronized Time-Series Data Using the Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony Model for Cross-Experiment Comparisons

Investigating the cell cycle often depends on synchronizing cell populations to measure various parameters in a time series as the cells traverse the cell cycle. However, even under similar conditions, replicate experiments display differences in the time required to recover from synchrony and to traverse the cell cycle, thus preventing direct comparisons at each time point. The problem of comparing dynamic measurements across experiments is exacerbated in mutant populations or in alternative growth conditions that affect the synchrony recovery time and/or the cell-cycle period. 
We have previously published a parametric mathematical model named Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) that monitors how synchronous populations of cells release from synchrony and progress through the cell cycle. The learned parameters from the model can then be used to convert experimental time points from synchronized time-series experiments into a normalized time scale (lifeline points). Rather than representing the elapsed time in minutes from the start of the experiment, the lifeline scale represents the progression from synchrony to cell-cycle entry and then through the phases of the cell cycle. Since lifeline points correspond to the phase of the average cell within the synchronized population, this normalized time scale allows for direct comparisons between experiments, including those with varying periods and recovery times. Furthermore, the model has been used to align cell-cycle experiments between different species (e.g., Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe), thus enabling direct comparison of cell-cycle measurements, which may reveal evolutionary similarities and differences.

著者スポットライト:Cross-Experiment Comparisonsのための細胞周期同期モデルの特性評価損失を使用した同期時系列データのアラインメント  

One challenge of analyzing synchronized time-series experiments is that the experiments often differ in the length of recovery from synchrony and the cell-cycle period. Thus, the measurements from different experiments cannot be analyzed in aggregate or readily compared. Here, we describe a method for aligning experiments to allow for phase-specific comparisons.

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

Investigating the cell cycle often depends on synchronizing cell populations to measure various parameters in a time series as the cells traverse the cell ...

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

要約

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この動画の章

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

フローサイトメトリーによる造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

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2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

実験間比較のための細胞周期同期喪失モデルを用いた同期時系列データのアライメント

フローサイトメトリーによる造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価