この作品は、RMへの国民の健康と医療研究センター（NHMRC）プロジェクトの助成金によってサポートされていました

ここで説明する全ての実験手順は、UNSWオーストラリアの動物実験倫理委員会を遵守し、国民健康と動物実験のための医学研究評議会、オーストラリアの規制に準拠して実施しました。このプロトコルのすべての手順は、関連する動物実験倫理委員会の要求に応じて行われるべきです。 1.アセチルコリンエステラーゼ組織化学染色<ol><li>アセチルコリンエステラーゼの反応液を調製<ol><li> 0.1Mリン酸緩衝液（PB）200mlにアセチルチオコリンヨージド290mgの追加。 900 rpmで磁気攪拌機で混合します。 </li><li>連続的に攪拌しながら、グリシン600mgのを追加します。 </li><li>生成物が完全に溶解するまでゆっくりと連続的に攪拌しながら反応混合物に硫酸銅の420ミリグラムを加えます。 </li></ol></li><li>動物の死体の皮膚を削除切開を行うことで、（組織の共有を介して得られます）灌流ラットまたはマウスの皮膚へ、首の領域から肌を把握し、その足を過ぎてそれを引っ張ります。各筋肉を覆う筋膜が除去されたか、大幅に反応液に筋線維の十分な曝露を確実にするために穿孔のいずれかであることを確認してください。 </li><li>反応混合物に関心の全体または手足を浸し、4℃でO / Nインキュベート。 </li><li>蒸留水で2分間の死体を洗ってください。注：この段階では、筋肉は、青色の着色を示し、運動終板（のMEP）が白い点として見ることができます。 </li><li> 3-5秒間10％の硫化アンモニウム溶液に死体を公開します。 注：筋線維は、急速に褐色に変わり、MEPが黒い斑点ドットとして観察可能になります。反応があまりにも急速に発生し、筋線維が議員と筋線維を区別するために暗すぎる染色されている場合は硫化アンモニウム溶液（ 例えば 5％）のより低い濃度を使用してみてください。反応時間は、取得します議員と筋線維の間の最適なコントラストは、一つのサンプルから他に変化します。したがって、試薬に正確な露光時間を規定することは困難です。コントラストが十分なものとみなされたときの反応は、厳密に監視して停止する必要があります。 </li><li>蒸留水に攪拌しながら、カーカスを2回洗浄し、穏やかにカーカスドライバッチリ。 </li><li>関心のあるすべての筋肉のためのMEPが捕捉されることを保証する写真四肢の両側と内側側面、。 </li></ol> 2.筋肉内注射モーターエンドプレートで<ol><li>マイクロピペットプラーとガラスマイクロピペットを引き出します（プランジャとの傾斜マイクロピペットの使用を推奨します）。解剖顕微鏡の助けを借りて、マイクロピペットの内腔の内径は約0.5mmであるように、ピンセットでマイクロピペットの先端を破ります。 </li><li>使用されているすべての手術器具は、新たにオートクレーブ処理されていることを確認し、目手術領域で無菌です。 </li><li>フルオロゴールド（蒸留水中5％）でマイクロピペットを埋めます。 </li><li>イソフルオラン（O 2中4％）で誘導チャンバ内に動物において麻酔をかけるを誘導します。立ち直り反射を確認し、導入室から取り出す前に、その不在を確認してください。ラットの鼻の上にノーズコーンを固定し、麻酔の維持のためにイソフルオラン（O 2中2％）を提供します。動物の足指をつまむ、ゆっくりペダルの撤退と角膜反射の両方が存在しないことを保証するために、動物の眼に触れます。注：ケタミンおよびxylazilの混合物も使用することができる（80および10mg / kgでそれぞれ、腹腔内送達）。ケタミンは、スケジュール8（「制御」）は、薬物とに接着する必要があります薬の購入、使用、保管、廃棄に関連する必要なプロトコルです。 </li><li>手順の過程で目の乾燥を防ぐために、眼の潤滑剤を適用します。 </li><li> Tを剃りますargeted手足三クロルヘキシジンの交互スクラブと70％のアルコールで剃毛面積を拭くためにガーゼを使用。手術領域に動物を転送します。 </li><li>きれいなアンダーパッドに動物を置き、目標と筋肉（複数可）への良好なアクセスを確保するために適切に配​​置します。 </li><li>離れて下にある筋肉組織からの標的筋肉上の皮膚を持ち上げ、手術用ハサミで皮膚を切開を行うために、歯のグリップをピンセットを使用してください。切開部が完全に興味のある筋肉（複数可）を露出するのに十分な大きさであることを確認してください。筋膜の中断を最小限に抑えがあることを確認します。 </li><li>精神的に筋肉（複数可）にMEP領域の位置と形状を転置するMEPの写真を使用してください。 注：ファインフェルトマーカーは、目的の筋肉（複数可）に写真からMEP地域を再生するために支援することができます。 </li><li>各s 1-2μLの3〜4回の注射、フルオロ金（MEP領域の全長に沿って複数回の注射を行いますhould）十分です。静かに任意の漏出を除去するために、筋肉（複数可）を拭きます。 </li><li>鈍鉗子で互いに近接切開皮膚の両端を持って、外科手術用クリップで傷口を閉じます。傷の全スパンに沿って0.1ミリリットルブピバカイン（水中0.5％）（または他の局所麻酔薬）を潜入。 </li><li>それは完全に麻酔から回復されるまで、麻酔器の電源をオフにして、動物を監視します。 </li><li>筋肉内注射の投与や動物の灌流の間に14日間待ってください。 </li></ol> 3.潅流<ol><li>腹腔内注射によって動物に、ペントバルビトンナトリウム溶液の致死量（150 mgの/ kgの例えば Lethabarb）を管理します。 <ol><li>ペダルの撤退と角膜反射の欠如によって確認されるように、麻酔の深いレベルは、到達するまで密接に動物を監視します。 </li></ol></li><li> perfusio上に配置された解剖ボード上の背中に動物を置きnは沈みます。 </li><li>胸骨の基部を覆っている皮膚を持ち上げるために、歯のグリップをピンセットを使用してください。すぐに胸骨下の強い手術用ハサミで小さな皮膚切開を行い、その後、グリップに胸骨の剣状突起軟骨をピンセットを使用しています。剣状軟骨を保持しながら、胸骨から脇の下に、胸腔の両側に切開を拡大します。 </li><li>心臓を露出させるために、振動板をカットします。 <ol><li>血液の凝固を防ぐために、直接心臓の頂点にヘパリンの0.mlを注入します。 </li><li>左心室へのカニューレの挿入を可能にするために頂部を切断し、その後速やかに止血を用いて適所にカニューレをクランプ。 </li><li>細かいハサミで右心房の切開を行い、すぐに蠕動ポンプを起動します。心房から流出する液体が血液のほぼ自由であり、肝臓の色は淡褐色になるまで、0.1M PBで灌流。そして、ソルと灌流動物の体全体まで、パラホルムアルデヒド（0.1 M PB中4％）の化は、剛性になります。 </li></ol></li></ol> 4.頸髄解剖と組織学のための準備<ol><li>その腹部に動物の死体を置きます。 </li><li>メスで身体の正中線の皮膚をカットし、腸骨のレベルに頭蓋底からそれを反映しています。 </li><li>カットスルーと脊柱の背側面を露出させるために傍脊柱筋を反映しています。 </li><li>アトラス、第二頚椎のセグメント（ すなわち 、C2）の骨棘突起を特定し、対応する基礎となる後根を見つけるために、外科用鉗子やピンセットでそれを削除します。 <ol><li>永久フェルトマーカーでそれを着色し、右C2のルートを特定します。 </li><li> 1によって次の椎骨1つを削除して、色を交互に右後根をマーク（ すなわち 、C2、C4、C6、及びC8は、緑とC3に着色することができる、C5、C7、T1はCOLすることができます青で）論理和。 </li></ol></li><li>静かに脊髄の下端を覆う硬膜を貫通する小手術針（ 例えば 、30 Gゲージ針）を使用します。縦スリットを作るために吻方針を移動させながら上向きに針のベベルで、コードから離れて硬膜を持ち上げます。 <ol><li>硬膜を反映しています。 </li></ol></li><li>新しいメスの刃で1つまたは2つのセグメントブロックに脊髄横断をカットします。 <ol><li>慎重に隣接する二つの根の間のメスの刃途中で各ブロックの左側に小さな基準マークを作る、ブロックごとに、その場での脊髄セグメントのままにしておきます。基準マークは、ブロックの腹側面から見えるようにするように組織を通る十分な深さであることを確認してください。解剖後の組織セグメントの向きを支援するために、動物の解剖学的構造に関していずれか前方または後方に向い、約45°の角度で基準マークを作成します。 </li></ol></li><li>パラホルムアルデヒド（0.1 M PB中4％）の溶液を含む小さな、明確に表示ボトルに、個々のブロックを収集し、RT O / Nで残します。 </li><li>ショ糖（0.1 M PB中30％）の溶液を含むクリーン、明確に表示ボトルにブロックを転送し、少なくとも2日間4℃で維持。 </li><li>クライオ金型内のセグメントを配置し、組織凍結培地でそれらをカバーしました。縦組織学的調製のために、上向きに背側面でブロックを配向させ、低温金型内のブロックを配向させるために基準マークを使用しています。 </li><li> -20℃の低温金型を凍結し、50ミクロンの厚さの切片に低温保持装置で切断しました。注：セクションに直接接着顕微鏡スライド上にマウントし、O / Nを乾燥させるために残すことができます。代替的に、切片を0.1 M PBで満たさ48ウェルプレートに浮遊することができ、その後、スライド上の組織切片を配向する基準マークを使用してマウント。 </li></ol> 5.腰椎共同RD解剖と組織学のための準備<ol><li>それは背中に動物の死体を置きます。 </li><li>動物の腹部に沿って正中切開を行い、内臓を取り除きます。脊柱の腹側面を露出させるために後部腹壁の筋肉を解剖。 </li><li> T13前根が骨を出る短い尾最リブとその隣接するT13の椎骨の位置を確認します。 <ol><li>連続して腹側コードの腹側面のエントリのその時点までのT13腹ルートを追跡するために、微細手術用骨鉗子でT13（ すなわち 、T12、T11と、必要に応じて、T10）に一つずつ二、三の椎骨吻側を削除し、永久フェルトマーカーでマークします。 </li><li>この時点から、色を交互にして着色、L1、L2、L3、L4、L5、L6およびS1用前根のエントリポイントの位置を特定するために同じ手順を繰り返します。 </li></ol></li><li> LUMについては、セクション4.5から4.10に記載したのと同じ手順に従ってください脊髄切開をバー。 </li></ol>

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C., Zurn, A. D., Aebischer, P., B&#252;eler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2.">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li><li>Lepore, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study.">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li><li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb:+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin.">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li><li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb.">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li><li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons.">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58 (2013).</li><li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li><li>Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection.">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

神経筋条件の実験的治療のための筋肉内ターゲティングおよび対応するα運動ニューロンへの治療導入遺伝子のその後の逆行性伝達は、新戦略ではありません。例えば、この送達方法は、SOD1マウスおよびラット1,9-12ならびにSMA 13とマウスにおいてALS進行の異なる段階での神経筋変性を遅延させるために使用されてきました。有望一方、これらの遺伝子治療のシナリオの有効性...

このような運動ニューロン疾患などの神経学的状態から生じる随意運動の制御の喪失とspinal-ならびにデュシェンヌ型筋萎縮症は、罹患者の毎日の生活に高く、長期的な影響を与える衰弱状態です。過去10年間、停止または少なくともこれらの神経筋疾患の有害な影響を遅らせることを目指して研究努力は、世界中の多くの臨床医と科学者のための優先事項となっています。この点で、これらの神経筋疾患を模倣する動物モデルの最近の発生は、これらの条件1-13の発生および進行の根底にある生理学的メカニズムに基本的な洞察を得ることに尽力されています。これらの神経筋疾患の治療は、脊髄への直接アクセスを必要とし、脊髄注射14,15によって達成することができます。遺伝子治療の最近の進歩は、上部の横紋筋肉を標的としていると脊髄1,9-13の前角内に配置され、対応するα運動ニューロンへのシャトル治療遺伝子に下肢。しかし、このかつて有望な戦略は、これらの神経学的状態の結果を改善するために失敗しました。それは、これらの予後不良があり得ることを結論する公正であるが、少なくとも部分的に、これらの保護の遺伝子の低い有効性に起因する、1は、これらの遺伝子送達方法の低い有効性を除外することはできません。 モーターエンドプレート（議員）は、α運動ニューロンから発信大きな末梢運動線維の軸索末端でインデントされた骨格筋線維の専門領域です。一緒に、末梢神経線維終末とのMEPは、神経筋接合部、 すなわち 、シナプスインパルスは、神経伝達物質の順行性遊離、アセチルコリンによってトリガーされる部位を形成します。重要なことは、末梢神経線維とのMEPとの関係は、二DIRECです的な、別のモータが離れてニューロン細胞体16-18から向かってだけでなく、分子や細胞小器官の輸送に関与しているが。これらの解剖学的考慮事項に照らして、MEPが対応する運動ニューロンへの送達および遺伝物質のその後の逆行性輸送のための選択の標的であることが表示されます。この文脈では、運動ニューロンの形質導入の成功は非常にウイルスベクターおよび筋肉の19-20のMEPの筋肉内注射との間の距離に依存することは驚くべきことではありません。しかし、驚くべきことに、実験用ラットとマウスの筋線維のMEPゾーンの正確な位置は、選択の2種が神経筋疾患をモデル化するために、最近まで利用できませんでした。 我々は、ラットおよびマウス21-22でいくつかの前肢の筋肉のためのMEP領域の総合的なマップを生成しています。最近では、我々はMEP rの組織の詳細を示していますマウス後肢23のいくつかの筋肉のためのegion、我々は現在、ラットの後肢上のMEPの特徴を分析しています。私たちの手では、これらの筋肉全体MEPゾーンに向かう逆行性トレーサーの筋肉内注射は、以前に報告されたよりも多くの脊髄セグメントをスパニングしている以上の標識運動ニューロンを生じさせました。ここでは、外部表面上のMEPの位置だけでなく、マウスおよびラットの両方における後肢と前肢の筋肉の深さ全体を明らかにするために、ここ数年にわたって開発されたプロトコルを提示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

脊髄運動ニューロンの完全性に影響を及ぼす疾患は、最も衰弱性の神経学的状態の間です。過去数十年にわたり、これらの神経筋障害のいくつかの動物モデルの開発は、これらの条件の進行を遅延または逆転を狙っ異なる治療シナリオを科学コミュニティを提供しています。ニューロンの逆行性機構を利用することにより、これらのアプローチの一つは、脊髄運動ニューロンに対応するシャトル治療遺伝子のために、骨格筋を標的とするようになっています。一度有望が、このような遺伝子送達アプローチの成功は、これまでに得示した形質導入運動ニューロンのサブ最適数によって妨げられてきました。運動終板（のMEP）は、運動ニューロンα脊髄へ直接シナプス接触している骨格筋で高度に専門領域です。この点において、それは、これまで、努力は逆行することに注意することが重要です運動ニューロンへの転送遺伝子は、対象となる筋肉のMEP領域の位置を参照することなく行われました。ここでは、単純なプロトコル1）骨格筋の表面上のMEPの正確な位置を明らかにし、2）運動ニューロンへの筋肉内送達および逆行性トレーサーのその後の最適な逆行性輸送を案内するために、この情報を使用することが記載されています。我々は、欧州議会議員のターゲティングを介して脊髄運動ニューロンへの治療遺伝子の逆行性輸送を調査へのさらなる研究において、これらのトレース実験からの結果を利用したいと考えています。

アセチルコリンエステラーゼ組織化学的染色は、筋肉の幅にわたってモータのエンドプレートの位置を明らかにした。 図1は、全体のラットの前肢で行わかかる染色の結果を示します。これは、硫化アンモニウム溶液の濃度を最適化するために提案されている（ 例えば 、5〜7％の代わりに10％）だけでなく、試料を溶液中に浸漬する時間としては、筋肉繊維上の非特異的バ...

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K ビュー.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

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Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

神経科学

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

ラット視神経への注入のための低侵襲テクニック

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

内視鏡内視鏡下鼻内のトランス蝶アプローチ: 下垂体腺腫に対する低侵襲手術

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

発達中の脳における運動皮質の非侵襲的変調とロボットマッピング

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

三次元運動神経オルガノイド発生

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...