NIH / NIDCD R01 DCでサポートされている011582.イメージング実験は大学で行ったのコロラドアンシュッツメディカルキャンパス高度な光学顕微鏡コアはNIH / NCRRコロラドCTSIグラント番号UL1 RR025780とロッキーマウンテンNeurlogical障害コアセンター助成NIH P30NS048154によって部分的にサポートされています。ソーク研究所から博士サシャ・デュ・ラックはGLYT2-GFPマウスを提供してくれました。

1.オプティカルジェノタイピングマウス子犬の1光学ジェノタイピング<ol><li>適切な励起波長のレーザポインタを使用してそれぞれの蛍光マーカーの発現を確認する（ここで説明した実験で405 nm）で励起波長を遮断するフィルタ眼鏡を対応するが、発光波長を通過させる（450 - ここで説明した実験で700 nm）の。ヘッドやマウスの仔の脊髄の背面にレーザーポインターを点（ 図1を参照）。目とレーザー光に対する皮膚の長い露出にレーザーを照射しないでください。 </li></ol>古い動物の2光ジェノタイピング<ol><li>深く腹腔内注射（120ミリグラム/ kg体重）を介して、ペントバルビタールの過剰摂取と（ここで説明した実験ではP138歳P14）は、マウスを麻酔。動物の反射神経をチェックして、適切な麻酔を確認してください（簡単番目の先端をつまみます電子耳や耳や足の後退反射を誘発するための後ろ足の1つ）。 </li><li>注意：動物はまだ理想的に生きているので、ペントバルビタールの過剰摂取の使用にもかかわらず（120ミリグラム/ kg体重）我々は、代わりに安楽死の「深麻酔」と注射手順を参照してください（ すなわち 、その心臓はまだ鼓動している）、時手術と灌流が開始されます。これは、脳を含む内臓のより効率的な灌流を保証します。 </li><li>動物は任意の反射を示していないならば、慎重に頭の後ろをカバーする皮膚の切開を作り、頭蓋骨の中央部に切断することにより頭蓋骨（ 図2A）を覆う皮膚を削除します。レーザー光に覆われていない頭蓋骨を露出させ、上記のようにフィルターゴーグルを通して蛍光を観察します。 GFP陽性シグナルが観察された場合、（第2 /私たちの次の安楽死の形を確保断頭を通じて動物を犠牲にし、いない場合は、ステップ2に進んでくださいIACUC規制）。 </li></ol>注：さらに古いマウスでは（&gt; 1ヶ月）の蛍光は、動物の目を通して観察することができます。 2. Transcardial灌流と脳の準備<ol><li>大部分から血液を除去するために、30gの注射針を使用して、氷冷リン酸緩衝食塩水（10mMの137 mMの、塩化カリウム：2.7ミリモル、KH 2 PO 4：1.76ミリモル、のNa 2 HPO 4のNaCl PBS）で経潅流動物。 <ol><li>まず、慎重に鋭いハサミで胸郭を開き、心臓の左心室に針を押し込みます。心臓や大動脈にPBSをポンプ起動し、すぐにこのステップが身体を終了し、血液を可能にするために、はさみで心臓の右心房を開き、次の。注：灌流5かかり - 動物のサイズに応じて10分。 </li></ol></li><li>灌流を介して放血した後、動物を刎ねる、ピンnにその頭を固定eedles（または30のG注射針）準備皿に目のソケットを介してそれらを貫通し、頭蓋骨から脳を削除することもできます。 <ol><li>ちょうど尾側動物の眼の側面にカットし、頭部の背側の正中線に沿って切断し、頭の後ろに小さな切開を行います。まず、頭蓋骨を重ねる肌を遮断するために、鋭いハサミを使用最後に、完全に頭の後ろの皮膚のフラップを除去するために、尾方向に切断。 </li><li>次に、頭蓋骨自体の同じカッティングパターンを繰り返し、これはかなり最終的に脳幹の除去を簡素化しますので、その過程で両方の蝸牛を取り外してください。この手順の後、脳の尾半分が完全に露出あるべきです。 </li><li>次のステップでは、小脳から約45°〜約2mmの吻側の角度で全前脳を切断するために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。 ABと脳の分離前半をかき出しますENTへら。 </li><li>その吻側端に脳の尾半分を高め、その後、まだ腹側脳幹に接続されている脳神経を切断するために、スパチュラを使用します。最終結果として、脳幹を含む脳の尾の半分は、準備された動物の頭の残りの部分から自由落下する必要があります。 </li><li> （ステップを参照してくださいその腹側を露出するために、脳の除去された尾の半分を反転し、台形体を含む腹側に位置する「電球」の（逆行注射用）ちょうど吻側（順行注射用）またはちょうど尾側前頭面に沿って切断2.3）。 <ol><li>常に組織に過度の機械的ストレスによる細胞死を最小限にするために切断手順のために鋭利なカミソリの刃またはメスを使用しています。最終結果として、長さが約1cmにまたがるし、他の脳領域に沿って完全な上オリーブ複合体を含む脳の外植が得られているはずです。 </li></ol></li></ol> &lt;/ LI&gt; </ol>注：このプロトコルは、聴性脳幹に位置台形本体内にトレーサーを注入するための手順を示しています。必要に応じて、切断面と注射部位の位置と向きを調整します。それらが同定され、脳を切断せずに注入することができるように、脳表面に十分に近い関心嘘の蛍光脳領域（ 図2Bを参照）場合、冠状切断工程を省略することができます。 <ol start="3"><li>台形体（VNTB）の腹側核を含む二腹目立つ「球根」と台形体を識別します。 </li></ol>注：これらの切断面のおおよその定位位置に関する更なる解剖学的参考のため、フランクリン＆Paxinos、2008年アトラスのパネル78、ブレグマ〜-5.7 mmは台形体（= MNTB）の内側核を示しているを参照してくださいTzを」と表示&quot;。パネル69は、台形BOの腹側核を示しています「MVPO」（medioventral periolivary核）19としてラベルDY（VNTB）。 3.順行/逆行トレース注：RT（25℃）で、次のすべての手順を実行します。 <ol><li> 125 mMの、のKCl：2.5mMの、のMgCl 2を1mM、のCaCl 2：0.1mMのグルコース切断した後、酸素（95％O 2、5％CO 2）解剖溶液（NaClを含む製剤皿に脳幹の外植片を配置：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25ミリモル、のNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mm）を、30gの注射針とそれを固定します。注射の面積が上を向いていることを確認します。 </li><li>ホウケイ酸ガラスから注入ピペットを引き、次の三つの解決策の一つでそれらを埋める：コレラトキシンサブユニットB PBS 12-13でアレクサフルオロフォア555に共役（主に逆行性輸送に使用される）、BのA）1.0 mg / mlのソリューション）1％-d万MWのデキストランTRITC 555の0.9％生理食塩水でのデキストラン（主に逆行性輸送に使用される3000メガワット）テトラメチルローダミン555またはc）1％-dilutionの0.9％生理食塩水でilution（主に）順行輸送に使用されます。 <ol><li> 4引っ張っサイクル - その注入ピペットの抵抗が2.5から3.5オームの範囲であり、それらが3で製造されていることを確認してください。ここに記載される実験のために、予めプログラムされたピペットプラー上でアルゴリズムを引っ張るを選択することによって、これを達成します。 </li></ol></li><li>適切な波長（;ここで説明した実験では、波長405nm、図3Aの項目番号2）の静的に取り付けられたレーザーポインタを使用して、脳の外植片を照らします。注射のためのガイドとしてのレーザーポインタを使用し、注入される蛍光標識された脳核または目的の細胞にレーザー光を目指しています。 </li><li> 70 - 互換性のあるフィルターゴーグル（450を装着したまま検索し、双眼顕微鏡を通して照射ターゲット領域を観察ここに記載した実験において0nmのバンドパスフィルタ）。関心領域にマイクロマニピュレーターを経由して注入電極を挿入します。 </li><li>トレーサー物質を注入します。脳切片内の関心領域（ROI）内に垂直に向け圧力噴射装置を用いて、50ミリ秒ごとに、15 psiで10圧力パルス - 注射は2から成ります。拡散する染料を可能にするために15秒 - 10の間隔で各圧力パルスを管理します。 </li><li>テトラメチルローダミン（TRITC）注射剤の場合には、付加的に（ここで記載した実験でMNTBとVNTB）関心のある脳領域に配置された電極をエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増強するために、電気的に刺激します。 <ol><li> 50ミリ秒パルス間の間隔で50ミリ秒、刺激によって駆動され、刺激分離ユニット（項目7号及び図3Bの 9）で55 Vに増幅するために8ボルトの8 TTLパルスを使用してください。このプロトコルの20回繰り返し、adminis - 10を使用してください数分7,8を介して結。適切に電極を接地していることを確認します - アース線は、浴溶液に接続する必要があります！ </li></ol></li><li>注射の成功のために確認してください。以来長い発光波長を有する蛍光トレーサーはまた、レーザーで領域を照射し、フィルターゴーグルを通して見ながら視覚的に注入された目標領域に色素取り込み/スプレッドをチェックし、より短い波長のレーザー励起により蛍光シグナルを発しています。 </li></ol> 4.インキュベーション<ol><li> 125 mMの、塩化カリウム：2.5 mMの、のMgCl 2：1 mMの、のCaCl 2：2 mMのグルコース：25mMの、のNaH 2 PO 4：1.25 mMの、塩化ナトリウム;注入後、酸素化人工脳脊髄液（ACSFでbrainstemsをインキュベートNaHCO 3、25mMのアスコルビン酸：0.4 mMの、ミオイノシトール：3mMの、ピルビン酸：2mMの、95％のO 2を通気-室温で5％のCO 2）1（RT、25℃） - 4時間、しばらく色素が輸送されています。バブル全体の潜伏期間中にソリューションを提供します。 </li><li>一晩（O / N）の後固定を可能にするために4℃でそれをし、インキュベートする;（PFA / PBS混合物のためにpH7の約100ml）で、続いて、PBSに溶解した4％パラホルムアルデヒド（PFA）でbrainstemsを転送します。 </li></ol> 5.組織スライスと取り付け<ol><li>次の日、PBSで3回（各洗浄工程のために5分に）脳幹を洗って、4％の寒天でそれをカバーして、50にカット - ビブラトーム上の80μmの厚さにスライス。ガラススライド、及びカバーガラスの取り付けメディアを使用してマウントスライス。 </li><li>必要に応じて、（：AB培地で100倍希釈で例えば青ニッスル）25分間蛍光ニッスルを持つセクションにラベルを付けます。 <ol><li> 、AB培地を調製0.2 Mリン酸緩衝液250mlを混合する（PB; 51 mMのKH 2 PO 4、150mMののNa 2 HPO 4）、15 mlの5 M NaClを、15 mlの10％のTriton-X、220ミリリットルのddH 2 Oそして5gのウシ血清アルブミン。 </li><li> PrecePBS中で3回の洗浄工程（10分毎）によるニッスル標識工程をデ、成功。 </li></ol></li></ol>注意：厚いセクションをマウントして分析する必要がある場合には（そのようなスライスここで説明した実験で100だった - より大きな距離での軸索の接続を維持するために、厚さ500ミクロン）、技術が組織のクリアと組み合わせることができます。我々はClearT2 12が成功した20であることが判明します。組織のクリアステップが含まれている場合には、セクションをマウントする前にそれを行います。

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我々は、開示することは何もありません。

、in vivoでのトレースの研究とは対照的に、in vitroでのトレーサーエレクトロポレーションの一般的な強さは、高価な定位（多くの場合、電気生理学）装置を必要としない、それは研究者に、したがって関心との脳領域へのより良いアクセスを与えることです。デキストランアミンとの他のトレーサーの使用に関する詳細なレビューを参照してください（in vivoでのトレー?...

特定の神経細胞（マイクロ）回路を定義するためには、言った回路、及びその接続パターンの多様な参加者を見つけることによって開始する必要があります。以来lesioning 1を介して神経解剖学的トレーシング技術の多種多様なトレースneurofiberについてウォーラーの出版物は、確立されています。これらの技術のいくつかは、1971 5-6の発見として、他は、生きたニューロン中の染料の能動輸送に依存して、固定された組織の死後2-4に適用することができます。後者はさらに、（与えられた投影の源 、 すなわちへの注入領域から。地域請求する突出しているニューロンの細胞体）アクティブな逆行性の利点を活かした方法とを区別する2つのグループに細分化することができ、アクティブな順行性（注入からの指定された投影の対象の領域、 すなわち軸索投射および標識された神経細胞の軸索端末）輸送。また、場合によっては、TRACER材料は、他の例では、外植脳が注入されている間、（ 生体内のトレーサー注射で ）数日または数週間の注射を生き残るためには、人工脳脊髄液中に注入した後、数時間インキュベート生きた動物に注入された（in vitroでのトレーサー注射を） 。 このプロトコルでは、我々 は 、in vitroエレクトロポレーション技術7-8に 、既存のトレース物質としてコレラトキシンサブユニット-Bおよびテトラメチルデキストランを使用して、順行と逆行追跡実験で、神経細胞体とプロセスにラベルを付けるように変更。このプロトコルの全体的な目標は、トレーサー注射の間に精度を標的に増加させるために使用可能なトランスジェニックマウス系統と基本光学機器を利用しながら、異なる脳核の間の神経接続のパターンを追跡するための効率的なツールを使用して神経科学を​​提供することです。順行と逆行トレースを使用する方法が、コレラ毒素およびデキストランアミンおよびそれらのそれぞれの蛍光標識複合体は、（ 例えば 、エレクトロポレーションの方法であるとして。ハースら 14）新しい9-13ではないが、脳組織のブロックを含むin vitroでの準備でエレクトロポレーションとトレーサー注射の組み合わせより最近の開発7です。生きた動物でのトレーサー染料の同じタイプを使用して、神経トレーシング技術上の主な利点があるため、染料がエレクトロニューロンによって取り込まされていると、より高い効率の増加標識強度です。実験者は、注入の対象領域上の視覚的制御を持っているので、追加の利点は、トレーサ注入中（染料の輸送に必要）を短く潜伏期間であり、その増加目標精度。後者はまた、高価な定位装置は、関心の核または脳の領域を見つけるために必要とされないことを意味します。 ADDIへtionally精度をターゲットに増加、我々は、ニューロン15と405 nmの波長と一致するバンドパスフィルタゴーグルのハンドヘルドレーザポインタ（450からなる基本的な光学機器のそのグリシン部分集団でGFPを発現するトランスジェニックマウス系統、利用しました- 700 nm）で。したがって、我々は、蛍光シグナルを介して注入領域を識別することによって精度を標的にし、土着のGFPシグナルとトレーサーとの間の相互作用の観察を通して注入領域内の色素の広がりを制御するための微細な方法を提供することによって、かなりの更なる増加を達成し蛍光。私たちの技術は、トレーサーを充填したもの（他のマウス系統または興奮）GFP陽性抑制性ニューロンを識別することにより、その接続性とともに、回路の機能性を明らかにすることができます。 要約すると、我々はさらに脊椎動物の脳のコネクトームを研究し、Tを評価するための強力な神経科学のツールを強化しました彼与えられたneurocircuitの異なる神経解剖学的特徴。安価で広く入手可能な光学機器と一緒にトランスジェニックマウスを使用することにより、我々は大幅に私たちの注射のターゲットと精度を高めることができました。さらに、トランスジェニックマウスは、聴覚脳幹における阻害マイクロ回路の機能を明らかに役立っている、私たちは、トレース接続の種類を識別することができました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

私たちは、処置中に対象となるレーザ照射と一致するフィルターゴーグルと脳の外植片にエレクトロポレーションを介して色素の取り込みを増加させるために、電気的および圧力一連のパルスを使用してin vitroでのトレーサー注入プロトコルを組み合わせた手法を提示します。それ自体でのin vitroエレクトロポレーションの記載された技術は、脳の特定の領域をターゲットするための比較的良好な視覚的なコントロールが得られます。レーザー蛍光遺伝子マーカーの励起とその読み出しバンド通過フィルタゴーグルを通して、遺伝的に標識された細胞/核と蛍光トレース色素の排出量を拾うことができ、研究者は、実質的に注射の精度を向上させることができるとそれを組み合わせることで関心領域を見つけ、はるかに効率的に注入領域における染料拡散/取り込みを制御することによって。また、レーザー照射技術はPROVによって与えneurocircuitの機能を研究することを可能にしますGFP発現は、神経細胞の亜集団によって発現される送信機の種類にリンクされている場合に、特定の領域に突出した神経細胞のタイプに関する情報をiding。

レーザーポインターとレーザーゴーグルは、迅速かつ安価にリターからのGFP陽性動物の遺伝子型を決定するために使用することができるか1および図2は図 。若いマウスの仔の例では、技術は、非侵襲的に頭蓋骨とその上の皮膚（ - D図1A）を介して動物の脳におけるGFPのラベルを識別するために使用することができます。放射された蛍光は、少なくともア?...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K ビュー.  University of Colorado School of Medicine. 我々は、in vitroでの調製物を用いて脳核に順行性または逆行性トレーサー注射を介して、神経細胞とそのプロセスを標識する技術が記載されています。我々 は 、nラベリング精度を高めるために、蛍光標識されたマウスの変異体および基本光学機器を利用して、トレーサーエレクトロ体 ​​外 I既存の方法を変更しました。 

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

神経科学

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

閉ループ神経のロボット実験は、神経回路網の計算特性を試験すること

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

慢性的な経頭蓋電気刺激およびラットの皮質内の記録

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

生体内ニューロン回路接続を模倣するためのインビトロウェッジスライスの準備

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...