我々は、喉頭手術技術を教えるため、神戸大学、日本の博士俊夫寺島に感謝し、PRV-バーサを供給するためのプリンストン大学のDr.リンEnquist。研究は、エーリッヒ・D・ジャービスとグスタボ・アリアガにNSF大学院研究フェローシップ賞にNIHのパイオニア賞DP1 OD000448によってサポートされていました。適切に入金前作からフィギュアは、ジャーナルの編集方針に従ってPLoSのONEオープンアクセスクリエイティブ・コモンズ・ライセンス（CC-BY）の下で使用されています。

注：すべての動物の手順を見直し、デューク大学施設内動物管理と使用委員会により承認されています。 1.保存仮性狂犬病ウイルス<ol><li>私たちは、1×10 9 PFU /メートルの力価でプリンストン大学で博士リンEnquistの研究室から生ウイルス（PRV152）を得ました。ウイルスを生成するためのプロトコルは、2を公開されています。 </li><li>適切なバイオセーフティ条件の下で-80℃でBSL-2バイオセーフティキャビネットや店舗内チューブあたり20μlのでウイルスを等分。 </li><li>注入の直前にPRVのアリコートを解凍します。 </li></ol>筋肉内に注射するための2外科の準備<ol><li>ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。 </li><li>眼用軟膏で角膜を保護します。 </li><li>トンを準備彼の髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互に手術部位を消毒することにより、無菌技術による手術部位。外科的領域をカバーするために、滅菌ドレープを使用してください。手順を通して無菌技術に準拠していることを確認してください。 </li><li>皮膚切開を行い、目的の筋肉を明らかにしました。例えば、輪状甲状喉頭筋にアクセスするためには、まず胸骨筋の上に重なる部分を除去する必要があります。 </li><li> VetBond組織接着剤を用いて任意の離断筋肉をシール。 </li></ol>筋肉にPRVの3インジェクション<ol><li> 34 Gステンレス鋼針を取り付け、解凍したてのPRV溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。 </li><li>ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロチップを出ることを確認します。 bioharzard廃棄物などの流体捨てます。 </li><li>定位micropを使用ositioningデバイスは慎重に興味のある筋肉にマイクロチップを配置し、わずかな腫脹が表示されるまで、ゆっくりと筋肉を埋めます。注入速度は、注入されるべき筋肉とボリュームのサイズに依存して変化します。例えば、4 NL /秒の速度で200 NL（1μlの合計）の5回の注射は、輪状甲状筋を埋めるために同じサイトに1分間隔で行われるべきです。関心の次の筋肉に注射器（この場合は横方向の輪状披裂）を移動し、注入手順を繰り返します。一度だけ各筋肉を穿刺。 </li><li> 5分後にマイクロシリンジを撤回。 </li><li> VetBondの組織接着剤を使用して、筋膜の断線をシール。 </li><li>すべての注射が完了した後、VetBond組織接着剤を使用して創傷を閉じます。お近くのinstitional動物使用のガイドラインに応じて、縫合糸または創傷クリップを使用することができます。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、yで必要とされるケア当社の機関の動物の使用に関するガイドライン。 </li><li> （この場合、2 回目にラベルを付ける皮質ニューロンを注文する90時間）実験的に決定生存期間の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。 </li><li> 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。 </li><li>少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。 </li></ol> eGFPの4免疫化学的検出<ol><li>スライディングミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。取り付けられた切片を染色する際に薄肉部は、例えば、30μmとするために、使用されてもよいです。 </li><li>光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。 </li><li> VECTASTAINエリートキット（キットVE）から正常ヤギ血清、0.3％Tween20を含むPBSで30分間、切片中の非特異的抗原を遮断します。 </li><liRTで：&gt;インキュベートは（千1）ウサギ抗-EGFPで3.5時間のためのセクションをブロックされています。 </li><li>インクルードを室温でキットをVEから、その後ヤギ抗ウサギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベート、5分間のセクションをPBSで3回洗浄します。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li> 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後ザをRTでキットVEからABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。 </li><li> 0.05％DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）および0.015％のH 2 O 2を含有する 、10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。 </li><li>スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。 </li><li> 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。 </li><li>画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 DAB反応製品insidE細胞は茶色に表示されます。デジタル化された画像は色が細かいプロセスを強調するために反転させることができます。 </li></ol> PRVトレースによって検出された脳領域へのトレーサーの注射用5。外科の準備<ol><li>ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。 </li><li>眼用軟膏で角膜を保護します。 </li><li>適切な定位フレームに頭部を固定してください。 </li><li>髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互にサイトを消毒することにより、無菌技術による手術部位を準備します。 </li><li>頭皮の切開を行い、目的の脳領域上の皮膚を撤回。 </li><li>適切な定位座標で小開頭手術を行います。例えば、laryngeally接続運動皮質の座標はでPRVトレースによって識別n個の成体マウスは、1.2ミリメートル、横方向とブレグマに0.2ミリメートル吻側です。 </li></ol>脳へのビオチン化デキストランアミンの6インジェクション<ol><li>滅菌生理食塩水の333μlのBDA 25mgの（10,000 MW）を溶解することにより、7.5％のビオチン化デキストランアミン（BDA）を準備します。 </li><li>計画された注射用の十分なBDA溶液でNanoject IIマイクロピペットシステムをロードします。 </li><li>ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロピペットチップを出ていることを確認します。 </li><li>定位微細位置決め装置を使用して、慎重に関心のある脳領域にマイクロピペットの先端を下げ、ゆっくりBDAを注射します。領域の大きさに応じて、噴射率を標識するために調整します。例えば、4.6 NLの12注射は離れて0.2ミリメートル（吻側 - 尾側方向）は成体マウスでlaryngeally接続運動皮質をカバーするために、四つの異なる場所でも行われなければなりません。最終噴射量は、対象の脳領域の大きさに応じて調整されるべきです、ラベルは脳組織を通って、ラベルされたニューロンのプロセスに沿って拡散することにより、射出コアから広がる可能性があることを念頭に置いて。 </li><li>歯科用セメントを使用して開頭術を密封し、VetBond組織接着剤を使用して頭皮の傷を閉じます。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。 </li></ol>筋肉へのコレラ毒素サブユニットBの7インジェクション<ol><li>滅菌生理食塩水100μlのCTbを1mgを溶解させることによって、1％コレラ毒素サブユニットB（CTB）を準備します。 </li><li>六日の脳へのBDA注射後、筋肉にPRV注射のために上記のように外科手術の準備を行います。 </li><li> 34 Gステンレス鋼針を取り付け、CTbを溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。 </li><li>以前デとして関心の筋肉（複数可）にマイクロインジェクションを実行しますPRVのためのスクライブ。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。 </li><li>三日のCTB注射の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。 </li><li> 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。 </li><li>少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。 </li></ol>同じセクション内BDAとCTbを8.検出<ol><li>ミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。 </li><li>光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li>切片を5分間PBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。 </LI&gt; <li> 10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、0.05％DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）、0.015％のH 2 O 2、及び0.05％の塩化ニッケルを含有し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。細胞内でのDAB反応生成物は、黒表示されます。 </li><li> VECTASTAINエリートキットから正常ウサギ血清を0.3％Tween 20を含むPBS中で30分間ブロックセクション。 </li><li> RTで：インキュベートは、（10,000 1）ヤギ抗CTbをで2時間のセクションをブロックされています。 </li><li>セクション5分間PBS中で3回洗浄し、その後、インクルードをRTでキットをVEからウサギ抗ヤギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベートします。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li> 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で30分間、それらを反応させます。 </li><li> 0.05％DAB（3、3を含む、10分間のセクションをリン酸緩衝液で3回洗浄し、リン酸緩衝液中に最大8分、pHが7.4のために開発「-diaminobenzidine）と0.015％H 2 O 2。細胞内でのDAB反応生成物は茶色に表示されます。 </li><li>スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。 </li><li> 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。 </li><li>画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 </li></ol>

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	<li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).</li><li>Smith, B. N., Banfield, B. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density.">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li><li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits.">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li><li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

PRV152 4,21を用いた実験を計画する際に考慮に入れなければならない多くの問題があります。最も重要なのは、仮性狂犬病ウイルスは致命的です。前述したように、ヒトを含む大型類人猿は、感染に対して感受性ではなく、適切なケアは、他の動物を保護するために行使されなければなりません。成体マウスは通常、5〜7日間の弱毒PRV152株を接種​​した後に生き残ります。したがって...

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）、PRV-バーサは、最初1961 12に記載とりわけ弱毒株を利用して、げっ歯類の脳に使用されている。ここでは、特定の筋肉の運動皮質の表現を識別するためのプロトコルを提示強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子2を発現する組換え仮性狂犬病ウイルス株（PRV152）を使用して、または筋肉群。記載されている方法は、クロスシナプスが機能回路3,4,13内の他のニューロンに感染することは感染性の子孫を生み出す神経向性ウイルスの挙動を利用しています。 PRV-バーサと同質遺伝子であるPRV152は、唯一の&lt;離れ感染部位3,5からのシナプス結合の階層的なシーケンスを逆行性シナプスを横切ります/ SUP&gt;。正確感染末梢部位を制御することにより、運動ニューロンの特定のサブセットを介して脳へのウイルスの侵入を制限することができます。ウイルス順次接続されているニューロンのチェーンに感染したように、脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンのネットワークを解決します。 ニューラルトレースのウイルスを使用することのさらなる利点は、感染細胞内のレポータータンパク質（この場合はEGFP）の増幅です。この信号増幅も疎突起の検出を可能にする感度のレベルを提供します。例えば、ウィスカーを制御顔面運動ニューロンへの感覚毛の運動野からのスパース投影がウイルス発現緑色蛍光タンパク質14を用いて、ラットで発見されました。以前の研究は、レポーター遺伝子増幅11,15なしで古典的なトレーサーを使用して、この投影法を見つけることができませんでした。残念ながら、多くのウイルスベクターがトレース挙げ研究で使用したものと同様に、それによって多シナプス回路をトレースするためのそれらの使用を制限し、シナプスを横断しません。 モータ回路に参加した細胞のネットワークを識別するための明確な利点を提示しながら、PRV-152を使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な回路内の特定の接続を解釈することができます。したがって、我々は、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用して、二重標識によってPRV-152を使用して識別回路内の特定の接続を検証するための簡単​​な方法を提示します。 BDAとCTbをの併用は、ニューロン6-8,11の特定のセットの間の接続をトレースするための十分に確立された手法です。一緒に使用する場合、これらの二つのトレーサーは、2色DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）手順16を使用して同じ部分に可視化することができます。高分子量BDA（BDA10kDaは）それYので、このプロトコルを選択しました神経プロセス6,7,9の詳細なラベル付けをields。 BDA10kDaのさらなる利点は、以下のものがあります。それは、優先的に順行方向6-8に搬送されます。それは、イオン導入や圧力注入6-8で配信することができます。それは、単純なアビジン-ビオチン化HRP（ABC）の手順17で視覚化することができます。それは、光または電子顕微鏡6,7,18によって画像化することができます。それは、遠位樹状突起10,19を含む細胞プロセスを明らかにするのに有効であるため、ペルオキシダーゼおよびDABとCTbをの免疫化学的検出は、運動ニューロンの逆行性標識のために選ばれました。我々は最近、マウスでのボーカル運動経路を特定するために、以前に20存在しないと仮定した喉頭運動ニューロンへの一次運動野から疎な接続を明らかにするために、このアプローチを使用していました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）1を利用して脳内で使用されています。 PRVは、ヒトを含む大型類人猿を、感染していないので、それは、最も一般的に小型哺乳類、特にげっ歯類での研究で使用されています。仮性狂犬病株PRV152は、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子を発現し、逆行だけ離れた感染部位から2,3シナプス結合の階層的なシーケンスを機能的シナプスを横切ります。他のPRV株は、異なる微生物学的特性を有し、両方向（PRV-ベッカーとPRV-カプラン）4,5に搬送することができます。このプロトコルは、PRV152を独占的に扱います。筋肉のような末梢部位にウイルスを送達することによって、それがTへのウイルスの侵入を制限することが可能です神経細胞の特定のセットを通じ、彼は脳。脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンを解決します。仮性狂犬病ウイルスを使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な識別されたネットワーク内の特定の接続を解釈させるように、私たちは使用して識別されたセル間の接続を確認するために、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用する高感度かつ信頼性の高い方法を提示PRV152。彼らは、遠位樹状突起6-11を含む細胞プロセスを明らかにするのに効果的であるため、ペルオキシダーゼおよびDAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）とBDAとCTbをの免疫化学的検出を選択しました。

eGFPのための染色は、一次運動ニューロンの筋肉にPRV152を注入した後、約72時間の弱い信号を示す開始する必要があります。ウイルスの複製および経シナプス輸送はtiter-と時間依存4されています。約90時間の注入後、eGFPの染色は、2 番目の順に感染した細胞において強いシグナルを明らかにします。より長い生存期間は、3 回目を明らかにし、より高次の細胞が、生存?...

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Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K ビュー.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

神経科学

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

脳神経細胞の初代培養の確立が続く動物の急速なジェノタイピング

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...