我々のプロトコルを用いて、生きた麻酔をかけられたマウスの運動ニューロンおよび感覚ニューロンから軸索内のエンドソームおよびミトコンドリアのシグナル伝達のダイナミクスを視覚化し、定量的に評価することができる。この方法は、生体内の軸索の基礎生理学を理解し、疾患のマウスモデルにおける末梢神経変性を駆動する重要な病態機構を明らかにするために使用することができる。私たちの技術は、生運動および感覚ニューロンにおける軸索輸送に対する薬理学的薬剤および遺伝子療法などの潜在的な治療の効果を評価するために使用することができる。
この技術は、特定の末梢神経軸索における異なる細胞小器官を同時に画像化し、運動疾患モデルならびに老化の研究を中継するために使用することができる。より小さな筋肉への最適な筋肉内注射のために段階的なガラスマイクロピペットを引っ張って準備を始める。手術の場合は、滅菌した手術用ドレープを37°Cに設定したヒートマットに固定し、手術用顕微鏡の位置と焦点を合わせます。
次に、原稿に記載されているように、必要なすべての手術器具と器具を開梱します。準備が完了したら、麻酔をかけたマウスを手術スペースの別の領域にあるマウスピースに移し、毛皮を外科領域から剃る前に角膜とペダルの両方の離脱反射がないことを確認してください。次に、サージカルテープの粘着性のある側を使用して、剃毛した毛皮をマウスから取り外します。
次に、マウスを体重計の上に置き、手術前の体重を記録します。次に、綿棒を使用して眼の潤滑剤を塗布し、マウスとマウスピースを手術領域に移します。前脛骨筋(TA筋)を注射するには、マウスを背中に置き、正中線から10度で後肢を伸ばします。
後肢が正しい位置にある場合は、足に外科用テープを置きます。70%エタノールまたは同等の溶液を用いて剃毛した領域を殺菌する。破傷風、神経毒、またはHcT溶液の働く無毒断片を、引っ張ったガラスのマイクロピペットに引き出します。
次に、モーターおよびプレート領域に対応する領域の関心のある筋肉の上に小さな切開を行う。そうしたら。筋肉に外筋膜を突き刺してHcTを注入し、マイクロピペットを5〜10秒間所定の位置に置いてからゆっくりと引き抜きます。
注射を後、1〜2本のステッチで切開部を閉じます。次いで、マウスを単離回収ケージに移し、30分間観察した。手術器具や器具を手術領域の周りに配置して、坐骨神経を露出させる準備をします。
パラフィルムを幅1センチメートルの狭い長方形に切断し、先端が斜めにしてウェッジを作成し、イメージングプロセスを支援します。準備が完了したら、マウスを手術領域のマウスピースに移し、サージカルテープを使用して頭をマウスピースに固定します。ターゲットの後肢を正中線から45度に伸ばして、サージカルテープで固定します。
角膜やペダル離脱反射がない場合は、はさみで坐骨神経の上にある皮膚を切ってください。次に、坐骨神経および血管を損傷することなく、上層部の上腕二頭筋および筋肉組織または結合組織を除去する。無傷の坐骨神経が十分に露出したら、乾燥を防ぐために坐骨神経の周囲に予め温めた滅菌生理食塩水を塗布する。
次に、湾曲した鉗子を使用して、深く横たわる結合組織を破壊し、事前に準備されたパラフィルムウェッジを神経の下に置きます。生理食塩水を浸したコットンウールを露出した領域に置き、ヒートマットの上にマウスをイソフルランと酸素で満たされた誘導チャンバーに移動させます。イメージングのために、カスタマイズされた顕微鏡ステージ上に22×64ミリメートルのカバーガラスを置き、カバーガラスの位置をテープで固定します。
対物レンズに浸漬油を塗布した後、顕微鏡ステージを倒立顕微鏡に接続し、油浸対物レンズをゆっくりと持ち上げてカバーガラスに接触させます。セットアップの準備ができたら、麻酔薬マウスピースをテープを使用して顕微鏡ステージに固定します。次に、坐骨神経からコットンウールを取り出し、露出した神経をカバーガラスに向けるようにしてマウスを誘導チャンバーからマウスピースに移します。
マウスの頭をマウスピースに固定し、適切な最低レベルの麻酔を維持しながら、マウスの尾をそっと持ち上げて、露出した坐骨神経の近くのカバースリップに滅菌生理食塩水を加えます。眼の助けを借りて、坐骨神経を見つけて最適な焦点を決定し、運動性軸索小器官を含む関心領域を選択する。次に、[取得]ボタンをクリックし、関心のある領域を選択して、コンピュータソフトウェアに切り替えます。
デジタルズームを使用して倍率を 80 倍にし、選択した領域を回転させて軸索を水平方向に視覚化します [領域] ボックスをクリックして、関心のある長方形の領域を選択します。集録モードで、フレームサイズを 1024 x 1024 ピクセル以上に設定し、100 ~ 1,000 フレームのタイムラプス取得を開始します。マウス1匹あたり3つの軸索から最低10個の運動性貨物を捕獲する。
この研究では、インビボモーター軸索特異的標識がトランスジェニックマウスを用いて達成された。コリン作動性運動軸索において増強された緑色蛍光タンパク質、またはeGFP発現を、生きた麻酔処理ChATから観察した。eGFPマウス。
代替法では、ChATから摘出したばかりの神経でtdTomato発現する。tdTomatoマウスは、追加の組織処理なしで達成された。さらに、軸索は、eGFPをコードするHcTまたはアデノウイルスなどのトレーサーまたはマーカーを骨格筋に注入することによって同定された。
代表的な解析は、HB9の生運動ニューロンにおけるシグナル伝達エンドソームのインビボ軸索輸送を表すタイムラプス画像系列を実証する。GFPマウス。GFPはHB9でより細かいパターンを持っていた。
GFP軸索。水戸の繁殖。ChATを有するCFPマウス。
tdTomatoマウスは、運動軸索におけるミトコンドリアの可視化を可能にした。さらに、ランヴィエのノードも識別できた。水戸の筋肉へのHcT注射。
CFPマウスは、インビボで同じ軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの同時可視化を可能にした。順行性および逆行的に動く細胞小器官、ならびに失速した小器官が観察された。画像化プロセス中の麻酔の減少は、大きな呼吸アーチファクトの影響を制限し、したがって軸索輸送の追跡および分析を簡素化することができるので有利である。
坐骨神経は、RNAおよびタンパク質分析において、細胞小器官のダイナミクスを、モータータンパク質や貨物固有のアダプターなどの軸索輸送機構の主要コンポーネントと相関させるのに有益であり得る。
