We thank Amanda Fair, the CMI, and Kathy Sweet and the ORL at UM for assistance with &#181;CT imaging and analysis. Funding: BL Funded by 1K08GM109105-01 and Plastic Surgery Foundation National Endowment Award.

倫理文：実験動物研究所から第八版（ILAR、2011）とした：全ての動物手順は、実験動物の使用およびケアのためのガイドで提供されるガイドラインで定義されているように、良好な動物の練習に厳密に従って実施しましたミシガン大学（PRO0001553）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.マウスの外科的処置注：使用8-10週齢のC57BL / 6マウス。他の年齢、背景、およびマウスの系統は、異なる条件または遺伝的構成をテストするために使用することができます。手続きの腱切除部分については、フェイスマスク、ヘアボンネット、および滅菌ガウン、手袋、および器具を使用して無菌状態を維持します。手術部位は無菌ポビドンヨード及び滅菌ドレープで準備する必要があります。獣医の加熱パッドを使用し、前administraに37℃に蘇生ソリューションを加温することにより低体温を避けまする。 <ol><li> 2.5％吸入イソフルランを用いてマウスを麻酔。簡単にアクセス背と後肢を残すためにノーズコーンを使用してください。粘膜の適切な呼吸数や着色を維持し、筋緊張、つま先のピンチ、および角膜反射をチェックすることにより、麻酔を確実にするために、イソフルランの投与速度を調整します。手順中にドライアイの怪我を防止するために、マウスの目に当たり障りのない眼軟膏を適用します。手術野の下の獣医の加熱パッドや温水循環装置を使用して、適切な体温を維持。 </li><li>鎮痛のための手術の皮下直前に、ブプレノルフィン、0.1ミリグラム/ kgで投与します。 </li><li>密接膝にかかとからバリカンを使用して、左後足に手術部位を剃ります。 </li><li>密接に背骨の上に始まり、背側正中線の左に剃毛領域を拡張する、火傷に対応するために、地域に少なくとも2cm×3cmをクリアし、マウスの背部を剃ります。 </li><li>3交流ポビドンヨードスクラブを使用して、膝に後足を含め、手術部位を準備します。 </li><li>左アキレス腱の内側面に沿って縦切開を行います。アキレス腱を容易に可視化することができるように、切開部を拡張します。約0.5センチメートル。 </li><li>シャープ組織ハサミで中点で腱の鋭い解剖とアキレス腱切除術を行います。腱の下に組織面での組織のはさみの刃を挿入し、ブレードが腱中間点になるまで平面に沿って詳細に分析。急激腱を切断するはさみの刃を閉じます。 注：腓腹筋、ヒラメ筋、および足底腱を含むすべての事後腱を含めることを確認してください。 </li><li>滅菌ガーゼで圧力をかけて止血を達成（最小限の出血があるはずです）と5-0ビクリルステッチで皮膚切開を閉じます。 </li><li>おおよそのmeasuremenで35グラムの重さのアルミニウムブロックと背部分層熱傷を行いますTS 2センチメートル×2センチ×3センチメートル17秒間マウスの剃毛背部に適用される水浴中で60℃に加熱しました。 注：ブロックの表面領域全体がマウスに接触している、しかし、ブロックに追加の圧力をかけることを避けることを確認して、麻酔したマウスの上にブロックを休んすることにより、適切な火傷の深さを実現、 すなわち、重力があることを可能にします所定の位置にブロックを保持する唯一の力。ブロックの一方の側に取り付けられた薄いプラスチック製のハンドルは、操作、安定化、および湯浴からの検索に便利です。これは、8〜10週齢のC57BL / 6マウスでは約30％、全体表面積の熱傷を作成します。この接触燃焼が原因で傷の上に火傷の深さの均一性と動物の間の再現に他の方法（火炎や熱傷熱傷）が選択されています。 </li><li>ガーゼで熱傷部位を乾燥さテガダームドレッシングを適用します。 </li><li>温め蘇生液を投与：乳酸リンゲル液1ミリリットルを腹腔内注射0.5mlの皮下注射。蘇生のこの1回投与は、火傷や腱切除からの回復のために十分です。 注：マウスを完全に回復するまでの監視の下できれいなケージに個別に、他のマウスと住宅ケージに家を麻酔したマウスを返さないでください。典型的な回復は、1-6時間以内に発生します。熱傷部位は、一般的に2〜4週間以内に治癒するときれいな住宅環境で守ればめったに創傷感染によって複雑にされていません。 </li><li>ブプレノルフィンを0.1mg / kgの皮下注射を手順、次の3日間ごとに12時間を管理します。適切な間隔でシリアルμCTスキャンとHOの成長を監視します。異所性骨の成長は、μCTによって術後3週間の周りに最初は明らかです。 注：HO開発の大部分は術後9週までに完了しています。私たちは繰り返しμCTとHOボリュームまたは場所の違いは、シングルエンドポイントは15週でスキャンμCTに比べて15週間にわたって隔週をスキャン確認されていません。実験の終了時に、施設のガイドラインに従ってCO 2吸入で全てのマウスを安楽死させると、10分後に頚椎脱臼で死亡を確認。 </li></ol> 2.μCT取得および分析<ol><li>腹臥位でスキャナベッドに麻酔をかけたマウスを固定します。呼吸モーションアーチファクトを防ぐために、しっかりと床に後肢をテープで固定します。イメージキャリブレーションのためのマウスの下にファントムを含む空気、水、およびヒドロキシアパタイトを含みます。 </li><li>骨解析ソフトウェアを開き、遠位後肢の先端に近位に股関節から後肢の両方を含む関心領域（ROI）を定義します。以下のパラメータを使用して、画像取得します。80 kVで、500μAと1300ミリ秒露光、48ミクロンのボクセルサイズを14,15 </li><li> 3ファントム室の各々にROIを描画するとの適切なフィールドに平均濃度を入力することにより、ハンスフィールド単位（HU）に画像のキャリブレーションソフトウェア。 </li><li>左後肢の脛骨が同所皮質骨構造の描写とHOのための明確な解剖学的ビューを可能にするために、Z軸に沿って平行になるように、ソフトウェアで「グラバー」ツールを使用して、再配向画像。 </li><li> HOが発生するまで、膝で始まり、画像スライスを通って遠位方向にスクロールします。マニュアルスプラインツールを使用して、足を介して、またはHOが突破されるまで、遠位に継続ごとに5 回目のスライス上に異所性骨の周りにROIを行います。すべてのHOを含むものROIにまとめたROIを拡張し、ステッチする外挿ツールを使用します。 </li><li> 3D ROIを作成し、分析メニューを選択します。最高の骨窓を示す下側および上側の閾値を設定することにより骨量を計算します。すべてのスキャンに同じ固定しきい値を使用してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Leblanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP-9-induced+muscle+heterotopic+ossification+requires+changes+to+the+skeletal+muscle+microenvironment.">BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment.</a> J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).</li><li>Shore, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoinductive+signals+and+heterotopic+ossification.">Osteoinductive signals and heterotopic ossification.</a> J Bone Miner Res. 26 (6), 1163-1165 (2011).</li><li>Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+progenitors+resident+in+the+skeletal+muscle+interstitium+exhibit+robust+BMP-dependent+osteogenic+activity+and+mediate+heterotopic+ossification.">Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification.</a> J Bone Miner Res. 27 (5), 1004-1017 (2012).</li><li>Potter, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+following+combat-related+trauma.">Heterotopic ossification following combat-related trauma.</a> J Bone Joint Surg Am. 92, 74-89 (2010).</li><li>Van den Bossche, L., Vanderstraeten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification:+a+review.">Heterotopic ossification: a review.</a> J Rehabil Med. 37 (3), 129-136 (2005).</li><li>Chakkalakal, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Acvr1+R206H+knock-in+mouse+has+fibrodysplasia+ossificans+progressiva.">An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva.</a> J Bone Miner Res. 27 (8), 1746-1756 (2012).</li><li>Yu, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+type+I+receptor+inhibition+reduces+heterotopic+[corrected]+ossification.">BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic [corrected] ossification.</a> Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).</li><li>Culbert, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alk2+regulates+early+chondrogenic+fate+in+fibrodysplasia+ossificans+progressiva+heterotopic+endochondral+ossification.">Alk2 regulates early chondrogenic fate in fibrodysplasia ossificans progressiva heterotopic endochondral ossification.</a> Stem Cells. 32 (5), 1289-1300 (2014).</li><li>Dinther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK2+R206H+mutation+linked+to+fibrodysplasia+ossificans+progressiva+confers+constitutive+activity+to+the+BMP+type+I+receptor+and+sensitizes+mesenchymal+cells+to+BMP-induced+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">ALK2 R206H mutation linked to fibrodysplasia ossificans progressiva confers constitutive activity to the BMP type I receptor and sensitizes mesenchymal cells to BMP-induced osteoblast differentiation and bone formation.</a> J Bone Miner Res. 25 (6), 1208-1215 (1359).</li><li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burn+injury+enhances+bone+formation+in+heterotopic+ossification+model.">Burn injury enhances bone formation in heterotopic ossification model.</a> Ann Surg. 259 (5), 993-998 (2014).</li><li>Scott, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+review+of+models+of+ectopic+bone+formation.">Brief review of models of ectopic bone formation.</a> Stem Cells Dev. 21 (5), 655-667 (2012).</li><li>Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+after+extremity+blast+amputation+in+a+Sprague-Dawley+rat+animal+model.">Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model.</a> J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).</li><li>Tannous, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+bone+formation+about+the+hip+undergoes+endochondral+ossification:+a+rabbit+model.">Heterotopic bone formation about the hip undergoes endochondral ossification: a rabbit model.</a> Clin Orthop Relat Res. 471 (5), 1584-1592 (2013).</li><li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+heterotopic+ossification+through+remote+ATP+hydrolysis.">Treatment of heterotopic ossification through remote ATP hydrolysis.</a> Sci Transl Med. 6 (255), 255ra132 (2014).</li><li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+of+burn+induced+heterotopic+ossification+using+transcutaneous+Raman+spectroscopy.">Early detection of burn induced heterotopic ossification using transcutaneous Raman spectroscopy.</a> Bone. 54 (1), 28-34 (2013).</li><li>Perosky, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+of+heterotopic+ossification+using+near-infrared+optical+imaging+reveals+dynamic+turnover+and+progression+of+mineralization+following+Achilles+tenotomy+and+burn+injury.">Early detection of heterotopic ossification using near-infrared optical imaging reveals dynamic turnover and progression of mineralization following Achilles tenotomy and burn injury.</a> J Orthop Res. 32 (11), 1416-1423 (2014).</li><li>Peterson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aging+on+Osteogenic+Response+and+Heterotopic+Ossification+Following+Burn+Injury+in+Mice.">Effects of Aging on Osteogenic Response and Heterotopic Ossification Following Burn Injury in Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li><li>Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast+injuries+and+heterotopic+ossification.">Blast injuries and heterotopic ossification.</a> Bone and Joint Research. 1 (8), 174-179 (2012).</li><li>Hunt, J. L., Arnoldo, B. D., Kowalske, K., Helm, P., Purdue, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopic+ossification+revisited:+a+21-year+surgical+experience.">Heterotopic ossification revisited: a 21-year surgical experience.</a> J Burn Care Res. 27 (4), 535-540 (2006).</li><li>Ring, D., Jupiter, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operative+release+of+ankylosis+of+the+elbow+due+to+heterotopic+ossification.+Surgical+technique.">Operative release of ankylosis of the elbow due to heterotopic ossification. Surgical technique.</a> J Bone Joint Surg Am. 86-A, 2-10 (2004).</li><li>Crane, N. J., Polfer, E., Elster, E. A., Potter, B. K., Forsberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+spectroscopic+analysis+of+combat-related+heterotopic+ossification.">Raman spectroscopic analysis of combat-related heterotopic ossification.</a> Bone. 57 (2), 335-342 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Heterotopic ossification represents a major functional impairment faced by patients that sustain trauma, burns, and invasive musculoskeletal procedures. The most at-risk population are soldiers in modern conflicts with major blast injuries from mechanisms such as improvised explosive devices (IED).18 Improved body armor and forward positioned medical units allows for improved survival of major extremity injury. After initial stabilization and repair of their extremity injury, these patients are at high risk...

Heterotopic ossification (HO) is the formation of ectopic bone in which osteo-potent cells are aberrantly induced to form endochondral bone outside of the skeleton. While the details of the HO formation pathway are still largely unknown, an accepted paradigm includes three key factors: an inflammatory inciting incident, a permissive niche, and mesenchymal stem cells capable of forming bone.1-3 HO is a common comorbidity complicating over 60% of major burn injuries, 65% of combat-related injuries, and 10% of invasive orthopaedic surgery cases.4,5 However, it is often difficult to predict where HO will form because it can occur at sites of local injury or at distant locations that may be otherwise uninjured. This variability in location makes it difficult to intervene prophylactically to prevent reactive bone formation in a locally targeted manner. There are also congenital forms of HO such as fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) in which patients are prone to the development of robust HO in response to minor trauma or inflammatory insult. Powerful animal models using transgenic mice have reproduced this phenotype and provided insight to the molecular pathways that may also be important in trauma induced HO.6-9 Translational research into the pathogenesis of non-congenital HO has used a wide variety of constructs ranging from injury alone to the implantation of exogenous osteo-inductive materials and/or cells.10-13
In our prior work we have validated a simple and reliable model of HO formation in mice which does not require the administration of any exogenous material.14-17 This model created two key conditions to initiate HO: local trauma and global inflammation. This was achieved through the use of an Achilles tenotomy (local trauma) combined with a distant burn injury (global inflammation). Mice received both treatments concurrently and were found to develop a robust amount of HO that could be analyzed by histologic, radiologic, and molecular means. Interestingly, concurrent burn injury significantly increased the amount of HO that formed and accelerated its developmental time-course.14-16 HO developed at predictable sites around the calcaneus, ankle joint, and tibia/fibula of the limb that received the tenotomy. The reliability of HO development at a known location allowed for focused examination of molecular and histologic features in the early stages of ectopic ossification.14,17 To date, 100% of mice (over 50 animals) with a tenotomy and concurrent burn injury have developed HO. Additionally, longitudinal 2D and 3D imaging and spectroscopic analysis were conducted to examine the growth pattern and biochemical make-up of HO.15,16

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td align="right">664</td>
			<td>8-10 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane &#8211; Fluriso</td>
			<td>VET one, Boise, ID</td>
			<td>V1 501017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine &#8211; Buprenex</td>
			<td>Reckitt Benckiser Healthcare</td>
			<td>NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.3 mg/ml solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Owens and Minor, Mechanicsville, VA</td>
			<td>2047PVP202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Vicryl sutures</td>
			<td>Ethicon, Summerville, NJ</td>
			<td>J493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm Film, 6cm x 7cm</td>
			<td>3M</td>
			<td>1624W</td>
			<td>Cut in half to properly cover burn site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;CT - GE eXplore Locus SP</td>
			<td>GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application</td>
			<td>GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct mouse trauma/burn model of heterotopic ossification

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical procedures. The majority of animal models used to study HO rely on the application of exogenous substances, such as bone morphogenetic protein (BMP), exogenous cell constructs, or genetic mutations in BMP signaling. While these models are useful they do not accurately reproduce the inflammatory states that cause the majority of cases of HO. Here we describe a burn/tenotomy model in mice that reliably produces focused HO. This protocol involves creating a 30% total body surface area partial thickness contact burn on the dorsal skin as well as division of the Achilles tendon at its midpoint. Relying solely on traumatic injury to induce HO at a predictable location allows for time-course study of endochondral heterotopic bone formation from intrinsic physiologic processes and environment only. This method could prove instrumental in understanding the inflammatory and osteogenic pathways involved in trauma-induced HO. Furthermore, because HO develops in a predictable location and time-course in this model, it allows for research to improve early imaging strategies and treatment modalities to prevent HO formation.

この本研究では、プロトコルは、外傷/火傷誘発されるHOの以前に公開されたマウスモデルに記載されている。14-17これはアキレス腱切除術と部分層熱傷を持つグローバル炎症侮辱と同時に、ローカライズ筋骨格傷害の作成 ​​が含まれます。これは、シリアル·イメージングで追跡することができる腱切除部位での反応性骨を確実に形成されます。現在までに、アキレス腱切除術の両...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification at JoVE.com

Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification

An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.

直接マウストラウマ/異所性骨化のモデルバーン

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical ...

direct-mouse-traumaburn-model-of-heterotopic-ossification

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K ビュー.  University of Michigan Medical School. An Achilles tenotomy and burn injury model of heterotopic ossification allows for the reliable study of trauma induced ectopic bone formation without the application of exogenous factors.