著者らは、海馬スライス培養物の調製のためにマシューフィレンツェに感謝したいと思います。この作品は、米国国立老化研究所とNZGにアルツハイマー病協会からの補助金によって支えられている。

1。固定固定剤は発がん性がある、手袋を着用し、ドラフト内で固定剤を処理します。特に断りのない限り、すべてのインキュベーションは、氷の上で行われ、すべてのソリューションは、使用する前にフィルタリングする必要があります。電子顕微鏡グレードの試薬を使用しています。 1日目<ol><li class="jove_content">実験条件（ 例えば 、ウイルス注射、薬物治療）の後、氷冷した0.1Mリン酸緩衝液（ソレンセンのリン酸緩衝液）、pHが7.3を含む60×15 mmのポリスチレンシャーレに器官海馬スライスで膜を配置します。追加1 - 直接スライスの上に0.1Mリン酸緩衝液2mlはそれらを冷たくしておくように。 </li></ol> 重要なステップ： 常に作りたてのバッファと固定剤を使用しています。緩衝液のpHが所望の範囲内にあることを確認してください。そうしないと、障害が細胞構造を損傷する恐れがあります。 <ol start="2"><li>スライスのCA1サブフィールドを分離するには、使用CA1の細胞層（ 図1）と平行に、優しくDGに次のスライスを横断する使い捨てメス。その後垂直にCA3サブフィールドと海馬を除去するために、残りのスライスを切った。組織の上面を識別しやすいように、スライスのコーナーをカットします。 </li></ol> 注：目的のタンパク質のないウイルスの引渡しを要しない場合には、メディアが氷冷緩衝液のすすぎ穏やかに除去された後に、全体の組織切片を固定することができる。そして、これはCA1を切り出すが続いている。 重要なステップ： 後でグリッドを適切に区画するために、組織の上値を追跡する。 <ol start="3"><li>慎重にメスの裏面を使用して膜から組織を除去する。そっと0.1 Mリン酸緩衝液を含む12ウェルプレートに組織を転送するためにパスツールピペットを使用しています。 </li><li>プレートから井戸にバッファを削除し、500＆mを追加U;リットル - 次から成る氷冷固定液（pH7.3）を1mlの0.1％ピクリン酸、1％パラホルムアルデヒド、0.1 Mリン酸緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒド。 4℃で2時間インキュベート℃、 </li></ol> 注：乾燥したピクリン酸は爆発的かもしれません。それをしっかり閉めて容器内の水で湿らせておいてください。乾燥した換気の良い場所に保管してください。 <ol start="5"><li>井戸から固定を外して、0.1 Mリン酸緩衝液に試料3回（各20分）を洗う。 </li><li>の0.1Mマレイン酸緩衝液（pH6.0）中1％タンニン酸（w / v）の中で40分間インキュベートする。 </li><li> （20分ごと）マレイン酸バッファーで二回すすぎ。 </li><li>暗闇の中でマレイン酸緩衝液中の1％酢酸ウラニル（w / v）の中で40分間インキュベートする。酢酸ウラニルは、光に敏感であり、放射性である。溶解時にパラフィルムでビーカーをカバーし、4℃で暗所で使用されていないバッファを格納</li><li> （20分ごと）マレイン酸バッファーで二回すすぎ。 </li><li> 0.5％の白金塩素で20分間インキュベートマレイン酸塩緩衝液中のIDE（w / v）である。 </li><li> （20分ごと）マレイン酸バッファーで二回すすぎ。彼らはさらなる処理のための準備が整うまで4℃でサンプルを格納する。 </li></ol> 2。脱水と埋め込みプロピレンオキシドは、発ガン性がある。ドラフト内でそれを操作することで、蒸気を避けてください。水の痕跡が含まれていない絶対的な、100％純粋なエタノールを使用しています。脱水のために、異なる濃度を生成するために、この無水エタノールで希釈します。 2日目<ol><li> 50％エタノールで5分間インキュベートした後、70％エタノールで5分間。 </li><li> 70％エタノールで新たに調製した1％p-フェニレンジアミン（PPD）で15分間インキュベートする。 </li><li> 70％エタノールで3回すすいでください。 </li><li> 80％エタノールで5分間、その後95％エタノールで5分間インキュベートします。 </li><li> 100％エタノール中で回各5分間インキュベートします。 </li><li>スクリューキャップでガラスバイアルを準備し、それらを清潔にし、完全に乾燥していることを確認してください。ガラスバイアルにスライスを移し、単に、はっきりと各バイアルにラベルを付けます。 </li><li>プロピレンオキサイド：1:1エタノールで5分間インキュベートする。 </li><li> 100％プロピレンオキシドで二回各5分間インキュベートします。 </li><li>プロピレンオキシドとの1:1混合物を作るために各バイアルに樹脂（EPON）を追加します。ゆっくり2時間混ぜる。埋に干渉する可能性がある泡を防ぐために、あまりにも厳格にバイアルを振らないでください。 </li><li>プロピレンオキシド、および2時間ミックスと3:1混合物を作るために樹脂を追加します。 </li><li> 100％の樹脂とインキュベートO / Nへの転送</li></ol> 3日目<ol start="12"><li> 60℃で24時間ACLARプラスチックと治癒℃のストリップ間のサンドイッチサンプル</li></ol> 3。セクショニングとグリッドへの取り付け 4日目<ol><li>半薄い（0.5μm）でセクションをカットし、1％トルイジンブルー+のサンプルの正しい方向を決定するために、1％のホウ砂で染色。 </li><li>超薄切片（60 nm）をカットし、ニッケルグリッド、グリッドにつき1部にマウントします。 </li></ol>4。免疫組織化学すべてのバッファと水は使用前にフィルタリングする必要があります。 5日目<ol><li>平らな面の上にきれいにパラフィルム片の上の1％Tween-20/phosphateバッファ（T / PB）、pH7.5での電圧降下（約50μl）を置きます。そっとエッジでクリーン鉗子でグリッドを拾うと、バッファ上に浮く、セクションダウン、そして室温で10分間インキュベートする。 </li><li>紙をフィルタリングするためにセクション側を上に配置することにより、グリッドから余分な液体を排出し、その後室温で15分間のT / PB中の50mMグリシンに浮く。 </li></ol> 重要なステップ：避けるために過度の&quot;キャリーオーバー&quot; 1つのソリューション液滴からのインキュベーション中に次の解の、優しく、各ソリューションの変化との間の第1濾紙上にグ ​​リッドのエッジに触れることにより、余分な液体を排出します。また、EMの腕の間に閉じ込められた任意の溶液を除去優しく鉗子アーム間のろ紙のスライバーと吸い上げてグリッドを把持鉗子しばらくensuのセクションでは、完全に乾燥しない呼び出し音が鳴ります。 <ol start="3"><li>ろ紙でグリッドを乾燥し、次いで室温で30分間のT / PBの二次抗体の動物から2.5％BSAおよび2.5％の血清を含有する溶液をブロッキングに浮く。 </li><li> 4℃でRTまたはO / Nで一次抗体（T / PB中）でインキュベート最適な時間と温度のインキュベーション、ならびに抗体濃度は、実験的に決定する必要があります。 </li><li>グリッドをT / PBで3回（各2分）を洗浄します。 </li><li>室温で1時間二次抗体（10nmの金に結合された1時20分抗ウサギまたは抗マウス）でインキュベートする。 </li><li> T / PBで3回（各2分）を洗浄します。 </li><li> 5分間のT / PBの2％グルタルアルデヒドとPostfixの。 </li><li>その後、T / PBとろ過された水で三回（2分毎に）で3回（2分ごと）洗う。 </li><li> 10分間水中2％酢酸ウラニルでインキュベートする。 </li></ol>グリッドが染色されている間、placinによりCO 2フリー室の準備ガラスシャーレの中心にパラフィルムのG​​Aピース。その後、空気中のCO 2を吸収するためにパラフィルムの周り皿中のNaOHの4-6ペレットを配置します。数分間、上部は閉じておいてください。パスツールピペットを使用し、素早くガラスシャーレにパラフィルムにレイノルズクエン酸鉛の少量の溶液を移す。チャンバー内に、CO 2の再導入を最小限にするためにパスツールピペットを挿入するだけで十分な上部を開きます。 注：レイノルズクエン酸鉛溶液を作製するには、電子レンジで100mlの脱イオン水を沸騰させ、密閉容器に冷ます。ストッパーで50mlメスフラスコでは、ミックス1.33グラムの鉛硝酸、1分間激しく振盪することによって1.76グラムのクエン酸ナトリウム、ゆで水30ml。その後30分間断続的に振る。この濁った溶液に、1M水酸化ナトリウム8mlを追加し、徐々にフラスコを数回反転させる。溶液は透明になります。ゆでたワシントンで50mlの解決策をもたらすTER。密閉ソリューションを格納します。沈殿物が表示された場合は、破棄して新しいものを作る。 <ol start="11"><li>における3つの小さなビーカーは暖かく、新たに煮沸脱イオン水を準備します。第1のビーカーにグリッドを浸漬し、30秒間、周囲に優しくスワール、それをすることによって酢酸ウラニルを洗い落としてください。他の2つのビーカーに、この手順を繰り返します。 </li><li>レイノルズクエン酸鉛の溶液の液滴にグリッドを配置するだけで十分なガラスのペトリ皿の上部を開きます。可能であれば、クエン酸鉛で呼吸を回避するために、沈殿物の形成を防止するためにこれをしている間、マスクを着用してください。 10分間インキュベートする。 </li><li>グリッドを削除するだけで十分な上部を開きます。クエン酸鉛で吸入を避けること。暖かい、新たに煮沸した蒸留水で3ビーカーに順次浸漬してグリッドを3回洗浄します。ろ紙、セクションまで一枚のグリッドに乾かします。サンプルは現在、電子顕微鏡の準備ができています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Faulk, W. P., Taylor, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunocolloid+method+for+the+electron+microscope.">An immunocolloid method for the electron microscope.</a> Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-+and+affinity+probes+for+electron+microscopy:+a+review+of+labeling+and+preparation+techniques.">Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques.</a> J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).</li><li>Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+to+optimize+post-embedding+single+and+double+staining+for+amino+acid+neurotransmitters.">Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).</li><li>Berryman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tannic+acid+on+antigenicity+and+membrane+contrast+in+ultrastructural+immunocytochemistry.">Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).</li><li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methods+for+ultracryotomy+of+CNS+tissue+for+ultrastructural+and+immunogold+analyses.">Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses.</a> J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).</li><li>Stirling, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructual+localization+of+lysozyme+in+human+colon+eosinophils+using+the+protein+A-gold+technique:+effects+of+processing+on+probe+distribution.">Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution.</a> J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).</li><li>Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osmium-free+method+of+epon+embedment+that+preserves+both+ultrastructure+and+antigenicity+for+post-embedding+immunocytochemistry.">An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).</li><li>Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+enhances+synaptic+strength+through+its+interaction+with+calmodulin.">Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin.</a> Embo J. 28, 3027-3039 (2009).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li><li>Zhong, L., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+targets+calmodulin+and+lowers+the+threshold+for+the+induction+of+long-term+potentiation.">Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation.</a> PloS one. 7, e41275 (2012).</li><li>Horisberger, M., Vauthey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelling+of+colloidal+gold+with+protein.+A+quantitative+study+using+beta-lactoglobulin.">Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin.</a> Histochemistry. 80, 13-18 (1984).</li><li>Bendayan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+potential+and+versatility+of+colloidal+gold+cytochemical+labeling+for+molecular+morphology.">A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology.</a> Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).</li><li>Racz, B., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+coflin+in+dendritic+spines.">Spatial organization of coflin in dendritic spines.</a> J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).</li><li>Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Usefulness+of+the+immunogold+technique+in+quantitation+of+a+soluble+protein+in+ultra-thin+sections.">Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections.</a> J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).</li><li>Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+antigen,+one+gold?+A+quantitative+analysis+of+immunogold+labeling+of+plasma+membrane+5'-nucleotidase+in+frozen+thin+sections.">One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections.</a> Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .</li><li>Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=[Immunologic+analysis+of+families+with+complement+receptor+deficiency].">[Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency].</a> Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).</li><li>Kehle, T., Herzog, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+protein-gold+complexes+and+cell+surfaces:+a+method+for+precise+quantitation.">Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation.</a> Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).</li><li>Bozzola, J. R., Lonnie, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Electron Microscopy. 30, (1992).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSD-95+is+associated+with+the+postsynaptic+density+and+not+with+the+presynaptic+membrane+at+forebrain+synapses.">PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses.</a> J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).</li><li>Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+localization+of+B-50+phosphoprotein:+the+(ACTH)-sensitive+protein+kinase+substrate+involved+in+rat+brain+polyphosphoinositide+metabolism.">Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism.</a> Brain Research. 328, 381-385 (1985).</li><li>Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+phosphoprotein+B-50/GAP-43+in+neuronal+and+synaptic+plasticity.">Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity.</a> Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).</li><li>Maunsbach, A. A., Bjorn, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).</li></ol>

我々は、開示することは何もない。

このプロトコルでは、我々は、ラット海馬スライス培養における樹状突起棘を研究するために、脳や脊髄組織のためPhendおよびWeinberg法を採用しております。海馬CA3-CA1領域における樹状突起棘が神経機能の調節に重要な役割を果たすタンパク質の広大な様々なを含む繊細な構造になっています。提示された方法は合理的な標識効率及び脊椎内の特定の抗原の分布を特徴づけるための有用な良?...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>NAME OF REAGENT</td>
 <td>COMPANY</td>
 <td>CATALOG NUMBER</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 x 15 mm polystyrene Petri dish</td>
 <td>Falcon</td>
 <td>351007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disposable scalpel</td>
 <td>EXELINT</td>
 <td>29552</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell culture inserts</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>PICM03050</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 nm Goat-anti-rabbit gold</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>25108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Neurogranin antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AB5620</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100% Picric acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>19550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96% Paraformaldehyde</td>
 <td>Acros Organics</td>
 <td>AC41678-0030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25% Glutaraldehyde (EM grade)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uranyl acetate</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>22400</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>p-Phenylenediamine</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P6001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platinum (IV) chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>379840</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tannic acid</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>21710</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

post-embedding immunogold labeling of synaptic proteins in hippocampal slice cultures

免疫電子顕微鏡法は、細胞内レベルでの生体分子を研究するための強力なツールです。コロイド金として電子密度の高いマーカーに結合する抗体は、様々な組織1に特異的な抗原の局在や分布を明らかにすることができます。 2つの最も広く使用される技術は、事前埋め込みとポストエンベディング手法です。それが埋め込まれる前に事前に埋め込ん免疫金電子顕微鏡（EM）技術において、組織は、抗体の浸透を可能にするために透過処理されなければならない。これらの技術は、構造体を保持するための理想的であるが、抗体の貧しい浸透（多くの場合のみ、最初の数マイクロメートル）はかなりの欠点は2である。標識は抗原がより簡単にアクセス可能です固定さ​​れた組織の切片上で行われるため、ポスト埋め込み標識方法は、この問題を回避することができます。長年にわたり、多くの修正は、免疫反応を増強し、超微細構造を維持するために、ポスト埋め込み方法を改善している<suP&gt; 3-5。 組織固定は、EM研究の重要な部分です。固定剤は、化学的な場所に組織構造をロックするために高分子を架橋する。固定剤の選択は、構造上の保全だけでなく、抗原性とコントラストだけでなく、影響を与えます。四酸化オスミウム（OSO 4）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドは、中枢神経系（CNS）の化学的および物理的処理中に構造的な損傷に特に傾向がある組織も含めて、何十年も標準固定剤であった。残念なことに、OSO 4は反応性が高く、貧しいと不十分なラベルで、その結果、抗原6をマスクすることが示されている。化学固定を避けるための代替的なアプローチは、組織を凍結することが含まれる。しかし、これらの技術は、高価な機器を実行して、必要とすることは困難である。これらの問題のいくつかに対処し、CNS組織のラベリング、Phend らを改善することができます 。酢酸ウラニル（UA）とタンニンACIとOSO 4を置き換えD（TA）は、正常脳と脊髄組織7における抗原検出と構造保全の感度を改善するために追加の変更を導入しました。我々は、ラット脳組織にこのオスミウムフリーポスト埋め込み方法を採用してシナプス蛋白を検出し、研究するための免疫金標識技術を最適化しました。 我々はここでラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質の電顕的局在を決定する方法を提案する。私たちは、器官培養海馬スライスを使用。これらのスライスは、海馬のtrisynaptic回路を維持、したがってシナプス可塑性を研究するために特に有用であり、機構が広く、学習と記憶の根底にあると思った。生後5日目と6マウス/ラット仔から器官海馬スライスは、以前8記載のように調製し、そして急性ノックダウンまたは過剰発現する外来タンパク質に特に有用であることができます。我々は以前にchにこのプロトコルを使用しているニューロ（NG）、シナプス機能8,9を調節するのに重要な役割を持つ神経細胞に特異的なタンパク質をaracterize。我々はまた、カルモジュリン（CaM）とCa 2 + /カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）10の電顕的局在を特徴づけるためにそれを使用している。結果に示されるように、このプロトコルは、樹状突起棘と背骨8内での分布を特徴づけるのに役立つNGの効率的な標識の良い超微細構造保存することができます。また、ここで説明する手順では、ニューロンの機能に関与する他の多くのタンパク質の研究に広く適用することができます。

図2Bは、CA1海馬錐体細胞の樹状突起棘における内因ン分子の分布の例を示しています。海馬のCA1領域（ 図2（a）に見られるように）を含む極薄（60nm）の組織とニッケルグリッドを1％で覆われていた後、抗とのインキュベーションの前に2.5％BSAおよび血清2.5％のブロックのT / PB、50mMグリシン、 -NG抗体。 T / PBで洗浄した後、グリッドを10 nmの金に結合した抗ウサギ二?...

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Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質を研究し、特徴づけるために、CNS内の構造と抗原性を維持するために使用されている手順を採用しています。

海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

post-embedding-immunogold-labeling-synaptic-proteins-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K ビュー.  Medical College of Wisconsin. タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシ?...

ビデオ: Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

神経科学

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

神経損傷を調べるための器官型海馬スライス培養モデル

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

器官切片培養におけるプルキンエ細胞の樹状突起の形態分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...