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背の基板1の製造<ol><li>溶媒キャスティングによるPLLAのフラットフィルムの製造。 <ol><li>完全に溶解するまで（約3時間）、室温（RT）で攪拌し、クロロホルム中の2％（w / v）のPLLA（100mLのクロロホルム中の2gのPLLA）の溶液を調製し、ドラフト中で作業。 </li><li>ガラスシャーレ上にワッシャーを配置します。 注：（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径で使用ステンレス鋼ワッシャをワッシャが腹側基板の上に配置されるようになっています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）またはガラス洗濯機のような他の材料も同様に使用することができます。 </li><li>洗濯機でPLLA溶液200μlを加え、室温で30分間ゆっくりと蒸発させます。溶媒をゆっくり蒸発を可能にするために、いくつかの穴を持つアルミホイルでペトリ皿を閉じ。 </li><li>溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。 </li><li>サンプルはクールやってみましょうRTでWN。 </li><li>サンプルは（30分程度）まで冷却した後、ペトリ皿中·cmの水18.2MΩで覆い、室温で8分間インキュベートします。 注：サンプルを完全に冷却されていない場合は、·cmの水18.2MΩを取るとゴム状態を採用することができます。さらに、8未満分·cmの水18.2MΩでインキュベートして、不適切な脱離で、ワッシャから離脱以上の8分なることがあります。 </li><li>かみそりの刃で、ペトリ皿を、それらを剥離するワッシャを取り外します。 </li><li>ピンセットでワッシャの端から任意の欠陥を除去し、試料は空気乾燥してみましょう。 </li><li> PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。 </li></ol></li><li>エレクトロスピニングによるPLLA繊維の製造。 <ol><li> stirrによりヘキサフルオロイソプロパノール中の（w / v）のPLLA（100ミリリットルヘキサ8グラムPLLA）8％の溶液を調製し、ヒュームフード内で作業完全に溶解するまで（約3時間）は室温でる。 </li><li>それぞれランダムまたは整列した繊維を得るために、アルミニウムシート上に、またはエレクトロスピニングのためのドラムにポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、洗濯機を置きます。 注：使用し、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ワッシャー（腹サンプル直径よりわずかに小さい）10.5ミリメートルの内径を有するワッシャを腹側基板の上に配置されるようになっています。例えば、ステンレス鋼又はガラスワッシャーのような他の材料も同様に使用することができます。ドラムは、整列した繊維を得るためには160.7秒-1（半径= 7センチ）の角速度で回転させるべきです。遅い速度は、繊維配向と壊れた繊維になります高速化は発生しません。 </li><li>ポリマー溶液と注射器をロードして、シリンジポンプの上に置きます。 </li><li> 30キロボルトの電圧を0.9ミリリットル/時間の流速及び12cmのコレクタ距離を用いてPLLA溶液をエレクトロスピニング。 </li><li>エレクトロスピニング法の後方を停止ER 20〜30分、（細胞は、同時に複数の繊維と相互作用する必要があるため）一度良好な繊維密度が達成されます。 </li><li>溶媒の痕跡を蒸発させるために5分間120℃で試料を加熱します。 </li><li> PLLAは、加水分解により分解可能であるため、実験日まで、真空デシケーター（80ミリバール）でサンプルを保管してください。 </li></ol></li></ol> 2.サンドイッチ文化<ol><li>細胞は腹側2D基板に接着されるとサンドイッチ状文化を組み立てます。 <ol><li>培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。 </li><li>特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa 2+およびMg 2+（200μL/秒を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベート1時間）十分。 注：溶剤キャストフィルムとエレクトロ繊維は洗濯機の側面の一方に取り付けられているためにより製造工程に、背側基板は、指定された上部と下部の側面を持っています。この辺は、したがって、細胞（ 図3）に対向するものです。 <ol><li>タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa 2+およびMg 2+を含む使用DPBS。 </li></ol></li><li>ガラスの種子細胞は13をカバースリップ。 注：サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているように、細胞播種は、2Dサンプル上と同様に行われます。例えば、C2C12筋芽は-1分化実験およびNIH3T3線維芽細胞のためには、7,000℃で播種された17,500個の細胞で播種し、ellsの-1細胞形態との密着性を研究するために、単離された培養物について。 </li><li> 5％CO 2で37℃のインキュベーターでサンプルを置き、細胞が3時間腹基板に接着することができます。 </li><li> （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートの新しいウェル内腹シードの基板を配置します。 注：新しい十分にサンドイッチ状文化を組み立てることは、これらの栄養素を消費し、内の培養細胞に影響を与える増殖因子および廃棄物を分泌するため、播種後ウェルの底に付着した細胞を取り除くために一つの方法ですサンドイッチのようなシステム。これは、サンドイッチのような環境内で培養した細胞のみを溶解するために、また、細胞抽出のための絶対必要です。 </li><li>慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO 2、37℃でインキュベートします。 注意：ワッシャーの重量は背側のサブを防ぐことができますフローティングからstrate。 </li><li>標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。これは細胞の損傷につながる可能性があるので、背側基板を移動しないでください。 </li></ol></li><li>ちょうど細胞播種後にサンドイッチ状文化を組み立てます。 <ol><li>培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。 </li><li>特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、のCa 2+およびMg 2+を 1時間（200μL/サンプル）を含むDPBSに溶解フィブロネクチンの20 / mlの中でサンプルをインキュベートします。 <ol><li>タンパク質コーティングの後、過剰なタンパク質を除去するためにDPBSで二回サンプルを洗浄します。そして、これはタンパク質の変性を引き起こすため、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。のCa 2+およびMgを含む使用DPBS <s二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節するので2+&gt;まで。 </li></ol></li><li> （ワッシャーが収まら）12マルチウェルプレートのウェル中のガラスカバースリップ上にシード細胞。これを行うには、背側基板を敷設した後、細胞の損失を回避するために、高度に濃縮された細胞懸濁液を使用しています。 </li><li>慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイ。培地（1ml）で補充し、5％CO 2、37℃でインキュベートします。 注意：ワッシャーの重量はフローティングから背側基板を防ぐことができます。 </li><li>標準的な2D培養のように1週間に2回培地を変更します。 注：これは、細胞損傷をもたらす可能性があるので、背側基板を移動しないでください。 </li></ol></li></ol> 3.分析注：サンドイッチ状培養物を2D基板に基づいており、そのため一般に、既に標準2D培養のために開発された手順によって分析することができます。例えば、PLLAは透明とセル画であるため、LSは、xy平面内で移動するように拘束され、顕微鏡検査は2D基板上のように行われます。細胞移動は、従って、実験および画像解析を簡素化し、3D培養の場合と同様に、z軸に細胞を追跡する必要性なしに、2D培養の場合と同様に分析することができます。スクラッチアッセイによってアッセイ創傷治癒を研究するため、このプロトコルは、次のとおりです。 <ol><li>サンドイッチ状の培養内の研究細胞の移動（創傷治癒アッセイ）。 <ol><li>培養フード中で作業は、無菌状態を確保し、30分間UV照射して、すべての材料（カバーガラス、背面基板、ピンセットなど ） を滅菌します。 </li><li>特異的細胞タンパク質付着を指示するために、コートフィブロネクチンと腹側と背側の基板を。これを行うには、1時間2+のCa 2+およびMgを含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中に溶解し、フィブロネクチン20μg/ mlの中でサンプルをインキュベートします。 <ol><li>タンパク質コーティングの後、DPBSで二回サンプルを洗浄過剰なタンパク質を除去するためです。そして、これはタンパク質の変性を引き起こす可能性があるので、乾燥なってからサンプルを防ぐためにそれらを使用するまでDPBSでサンプルをインキュベートします。二価の陽イオンは、タンパク質の折り畳みを調節することからのCa 2+およびMg 2+を含む使用DPBS。 </li></ol></li><li>高密度13でガラスカバースリップ上の細胞をシード。 </li><li> 5％CO 2で37℃のインキュベーター内でサンプルを置き、細胞がコンフルエンスを達成することを可能にします。 </li><li>ギャップによって分離2細胞集団を得るために細胞単層を傷つけピペットチップを使用してください。 </li><li>タイムラプス取得のための新しい同様に適切で腹シードの基板を配置し、背側の基板（ すなわち 12マルチウェルプレート）を取り付けてあります。 </li><li>慎重にピンセットの助けを借りて、細胞の背側基板をオーバーレイしてから（12マルチウェルプレートには1 ml）を培地に補充します。 注意：ワッシャーの重量はTを防ぐことができます彼は、フローティングから基板を背側。 </li><li> （37℃、5％CO 2に設定）タイムラプス顕微鏡でサンプルを置き、隙間閉鎖の画像ごとに20分を取ります。 </li><li>このようなImageJのプラグインからのMiToBoとして、特定のソフトウェアを使用して、隙間閉鎖を分析します。14 </li></ol></li></ol>注：タンパク質および核酸抽出を2次元基板上と同様に行われます。抽出効率を向上させるために細胞に直接、溶解緩衝液を添加することがサンドイッチ状培養物を分解することからなる唯一の余分なステップがあります。例えば、mRNA抽出のために： <ol start="2"><li>サンドイッチ状の培養からmRNAを抽出します<ol><li>製造業者の説明書に従って市販のキットからすべてのバッファを準備します。 </li><li>インキュベーターからサンドイッチ状文化を取り出します。 </li><li>サンプルから培地を除去します。 </li><li>カルシウムを含むDPBSで一度サンプルを洗います2+およびMg 2+（1ml）およびすべてのソリューションを削除します。 </li><li>ピンセットの助けを借りて、背側基板を除去し、腹側基板に溶解バッファー（350μl）を追加します。また、背側基板に付着した細胞を溶解するために、再び腹基板上に背側基板をオーバーレイ。 </li><li>溶解液を分離するために背側基板を取り外します。 </li><li>のmRNAを取得するには、製造元の指示に従ってください。 </li></ol></li></ol>注：タンパク質の免疫検出はまた、2D基板上のように行うことができます。サンドイッチ状の文化が、抗体および緩衝液の正確な拡散を妨げる可能性があるため、インキュベーション時間を増やす必要があります。また、サンドイッチは、染色プロトコルを開始する前に分解することができるが、後者の場合には、いくつかの細胞が背側基板と腹側の基板にはいくつかに付着したままになります。 <ol start="3"><li>サンドイッチ状文化内Immunodetectタンパク質<ol&gt; <li> DPBSで一度サンプルを洗浄し、4℃で20分間、PBS中の4％ホルムアルデヒドで固定します。 注：背側基板は、拡散の問題が回避されるように、固定プロセスの間に除去することができます。 </li><li> DPBS（1ml）ですすぎ、次いで室温で5分間、DPBS中0.5％トリトンX-100（1 ml）で透過性。 </li><li> RTで30分間、DPBS中の1％アルブミン（1mL）で非特異的結合部位をブロックします。 </li><li>一次抗体とインキュベート（2 / mlの、1ミリリットル）を室温で3時間ブロッキング溶液中で。 </li><li> DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。 </li><li>室温で溶液（1 ml）を遮断する二次抗体（2μg/ ml）および1 / mlのDAPIで2時間インキュベートします。 </li><li> DPBSで10分/ 0.5％のTween 20（1ミリリットル）のために3回洗浄します。 </li><li> DPBSで洗浄します。 注：サンプルは、ベクタシールドでスライド上にマウントし、背側基板は、従来の免疫削除されたときにマニキュアで封止することができます。 </li><li>蛍光マイクロ下で観察します標準の2D基板用としてスコープ。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate.">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions:+effect+on+cell+morphology.">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments.">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li><li>Gla&#223;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Analysis:+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines.">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. 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The authors have nothing to disclose.

現在、3D培養は、癌および幹細胞を含む医薬品やバイオテクノロジーの業界だけでなく、細胞生物学の研究のための重要なトピックです。結果として、いくつかの3D培養系が開発されています。残念ながら、3Dシステムの違いは、通常、細胞の運命の理解を妨げ、別の細胞の挙動をもたらします。また、実験手順は、通常の2D培養システムのためのほど簡単ではありません。したがって、これ?...

インビボ細胞微小環境の大部分は3次元（3D）の性質を持っているのに伝統的に、細胞培養物は、二次元（2D）基板上で行われています。この不自然な2D環境では、フラット世界に自己適応の方法として、細胞の挙動の変化をトリガし、これに直接影響を与える細胞の運命1,2。したがって、2D細胞培養に得られた結果は、 生体内で常に再現性がありません。これは、任意の次元に依存する生物学的メカニズムの3,4へのさらなる洞察を得るために、より生理的に似た条件を提供しようとしている新しい関連する培養システムの開発を奨励してきました。 2Dおよび3D培養における生体内環境との間の主な違いの1つは、細胞外マトリックス（ECM）に固定細胞受容体の分布である：2Dに細胞が腹側に付着する基質に対して、 インビボでの細胞の大部分は、完全にECMに囲まれているとこのように、CELLの接着は、受容体の三次元分布を介して行われます。これにより、細胞増殖、細胞分化および遺伝子発現のような重要なプロセスを調節する別の細胞接着シグナル伝達経路を誘発します。その変動性と複雑さは、一般的な細胞培養手順での標準化を妨げるのに、最後の十年の間に、多くの異なる三次元培養系は、5-8を確立されています。また3Dシステムは、通常、取り扱いが容易ではなく、2D基板上に現在の実験手順は、簡単に3Dの文化のために確立することはできません。さらに、文献はほとんどこれらのモデルにおける細胞の挙動の適切な理解を妨げ、同等の2D条件や他の3Dシステムと3Dの文化を比較しません。 一度2D基板上に付着した細胞を持つ、背側の受容体の励起 - 新材料（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ねることでは - 似た3D環境の細胞応答を誘発することができます。 REAこの背後にある息子は背側と腹側の受容体付着およびサンドイッチ環境内で拡散する（ 図1）9,10の両方の同時活性化です。結果として、細胞は、2D培養物11,12に対する重要な変更を受けます。背側刺激が重要な細胞経路の変化をトリガするのでこのように、細胞の運命は、理由サンドイッチ文化の組み立て中に決定されます。したがって、細胞の運命は非常にサンドイッチ状培養11を組み立てられた時点で決定されます。 によるシステムの性質上、サンドイッチ状文化は両方腹と背側部で、このような化学、地形、剛性およびタンパク質のコーティングなどの細胞/材料の相互作用における異なるパラメータの研究を可能にする、シンプルで汎用性の高いツールです。これは、幅の広いVの独立した背と腹の組み合わせに他の3Dシステム（ 図2）に比べて汎用性の高い学位を提供しています表面状態のariety。また、サンドイッチ状培養を組み立てるために、異なる細胞株および異なる時間での可能性の広いスペクトルを増加させる、研究することができます。 サンドイッチ様培養の標準プロトコルは、タンパク質コーティングなどの腹側基板およびフィブロネクチンのような背側基板としてカバーガラスをポリ-L-乳酸（PLLA）エレクトロ繊維またはフィルムのいずれかを用いて以下に詳述します。サンドイッチ状の文化だけで、細胞播種後または2D培養3時間後に組み立てました。しかし、他の材料系およびタンパク質を使用できることに注意。同様にサンドイッチ状培養を異なる時点で組み立てることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ploy(lactic acid)</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (12 mm&#216;)</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>631-0666</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>CL0200</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105228</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010-200V0</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE1000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage DC Power Supply</td>
			<td>Glassman High Voltage</td>
			<td>Series FC</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hucoa-Herl&#246;s</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow&#160; hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>AV30/70</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

細胞培養物は、伝統的に、細胞が生体材料の表面に腹受容体を使用して接着する二次元（2D）基板上で行われています。しかしながら、インビボで 、細胞のほとんどは完全に受容体の三次元（3D）分布をもたらす、細胞外マトリックス（ECM）によって囲まれています。これは、シグナル伝達経路における外、したがって細胞の挙動での違いをトリガすることができます。 この記事では、すでに新素材（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ね合わせることによって、2D基板に付着した細胞の背側の受容体を刺激すると、標準の2D文化に対する重要な変更をトリガーすることを示しています。また、腹側と背側の受容体の同時励起が近い3D環境で見られるものと細胞の挙動をシフトします。また、原因システムの性質上、サンドイッチ状の培養は、細胞/材料INTEで異なるパラメータの研究を可能にする汎用性の高いツールです。ractions、 例えば 、地形、剛性との両方の腹と背側面に異なるタンパク質コーティング。サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているので、最終的に、既に標準的な2D培養のために開発され、いくつかの分析手順は、3Dシステムのために必要な、より複雑な手順を克服し、正常に使用することができます。

サンドイッチ状の培養内の背側の受容体の刺激は、細胞形態の変化、細胞接着および細胞内シグナル伝達経路（ 例えば、焦点接着キナーゼ、FAK）10〜12をトリガーします。他の3Dの文化15,16のために観察されるような例として、サンドイッチ状システム内で培養した線維芽細胞は、2Dと比較して、α5インテグリンサブユニットを過剰発現しました。 <p class="jove_...

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K ビュー.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツール<em&gt;インビボ</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

生体分子相互作用を検出する β-ラクタマーゼによる伝導度バイオ センサー法の使用

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...