The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.

지느러미 기판 1. 생산 <ol><li> 용매 캐스팅에 의해 PLLA의 평면 필름의 생산. <ol><li> 실온 완전히 (약 3 시간)에 용해 될 때까지 (RT)에서 교반하여 2 % 용액을 클로로포름 (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 클로로포름에 2g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작업. </li><li> 유리 페트리 접시에 와셔를 놓습니다. 주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 스테인레스 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 또는 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다. </li><li> 세탁기에서 PLLA 용액 200 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 천천히 증발 할 수 있습니다. 용매의 느린 증발을 허용하기 위해, 몇 개의 구멍을 알루미늄 호일로 페트리 접시를 닫는다. </li><li> 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다. </li><li> 샘플 할 식지실온에서 WN. </li><li> 샘플 (30 분 정도) 냉각 한 후, 페트리 접시 · CM 물 18.2 MΩ 커버하고 실온에서 8 분 동안 품어. 참고 : 샘플이 완전히 냉각되지 않으면, 그들이 · 최대 CM 물을 18.2 MΩ을 가지고 고무 상태를 채택 할 수있다. 또한,보다 8 분 · CM 물 18.2 MΩ에서 배양하는 것은 부적절한 분리, 그리고 세탁기에서 분리 이상 8 분 동안 발생할 수 있습니다. </li><li> 면도날로, 페트리 접시를 벗겨 와셔를 들어 올립니다. </li><li> 핀셋 세탁기의 가장자리에서 모든 결함을 제거하고 샘플을 자연 건조 할 수 있습니다. </li><li> PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관. </li></ol></li><li> 전기 방사에 의한 PLLA 섬유의 제조. <ol><li> stirr하여 헥사 플루오로 이소프로판올 용액의 8 % (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 헥사 플루오로 이소프로판올 8g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작동완전히 용해 될 때까지 실온에서 보내고 (3 시간 정도). </li><li> 각각 랜덤 또는 정렬 된 섬유를 얻기 위해서 알루미늄 판 또는 전기 방사를위한 드럼 상에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔를 놓는다. 주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 스테인리스 강이나 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다. 드럼 정렬 된 섬유를 얻기 위해서는 160.7 초 -1 (반경 = 7cm)의 각속도로 회전한다. 느린 속도는 섬유 정렬을 유발하지 않을 수 있습니다 및 빠른 속도를 절단 섬유 발생합니다. </li><li> 고분자 용액을 주사기를로드하고 주사기 펌프에 놓습니다. </li><li> 30 kV의 전압의 12 cm의 컬렉터 거리 0.9 ㎖ / 시간의 유속을 사용 PLLA 용액 Electrospin. </li><li> 전기 방사 공정 후방 정지ER 20-30 분, (셀이 동시에 여러 섬유와 상호 작용이 있기 때문에) 회 좋은 섬유 밀도가 달성된다. </li><li> 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다. </li><li> PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관. </li></ol></li></ol> 2. 샌드위치 문화 <ol><li> 세포가 복부 2D 기판에 부착되면 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다. <ol><li> 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다. </li><li> 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, 둘 베코의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 2 + Mg를 2 + (200 μL / S에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어1 시간 동안) 충분한. 주 : 용매 캐스트 필름과 전기 방사 섬유가 세탁기의 측면 중 하나에 부착하므로 인해 제조 공정에, 등쪽 기판 지정된 상부 및 하부면을 갖는다. 이 측면 따라서 세포 (그림 3)에 직면 하나입니다. <ol><li> 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 가의 양이온 이후 2 + 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다. </li></ol></li><li> 유리에 종자 세포는 13 된 커버. 참고 : 샌드위치 같은 문화가 2D 기판을 기반으로, 휴대 시드 유사하게 2D 샘플로 수행됩니다. 예를 들어,의 C2C12 근육 모세포가 분화 cm -1 실험 및 NIH3T3 섬유 아세포에 대한 7,000 C에서 시딩 17,500 세포로 시딩ELL 학생 센티미터 -1 고립 된 문화가 세포 형태 및 접착 성을 연구하기 위해. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 셀 3 시간 동안 복부 기판에 부착 할 수있다. </li><li> (와셔 맞는 경우) 12 멀티 웰 플레이트의 새로운 우물에 복부 시드 기판을 놓습니다. 참고 : 새로운 잘 샌드위치와 같은 문화를 조립하는 것은 이러한 영양소를 소비하고 내에서 배양 된 세포에 영향을 미치는 성장 인자 및 폐기물을 분비하기 때문에 잘 파종 후 하단에 부착 한 세포를 제거하는 방법 중 하나입니다 샌드위치 같은 시스템. 이것은 또한 샌드위치 형 환경 내에서만 배양 세포를 용균시키기 위하여 세포 추출을위한 필요한 것이다. </li><li> 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 참고 : 세탁기의 무게는 등의 서브를 방지 할 수 있습니다부동에서 strate. </li><li> 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 이 세포가 손상 될 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오. </li></ol></li><li> 단지 세포 파종 후 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다. <ol><li> 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다. </li><li> 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, 칼슘 및 마그네슘 2 + 1 시간 동안 (200 μL / 샘플)를 포함 DPBS에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어. <ol><li> 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS <s&gt; 2+까지 가의 양이온은 단백질 접힘을 조절하기 때문이다. </li></ol></li><li> (와셔에 맞게) 12 멀티 웰 플레이트의 잘 커버 글라스에 씨앗 세포. 이를 위해, 등쪽 기판 누워 후 세포의 손실을 방지하기 위해 고농도의 세포 현탁액을 사용한다. </li><li> 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 참고 : 세탁기의 무게는 부동에서 지느러미 기판을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 참고 :이 세포 손상을 초래할 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오. </li></ol></li></ol> 3. 분석 주 : 샌드위치 형 2D 배양 기질에 기초하고 있으며, 그래서 일반적으로 이미 표준 2D 배양을 위해 개발 과정에 의해 분석 될 수있다. 예를 들어, 이후 PLLA는 투명하고 CEL입니다LS가 xy 평면 내에서 이동 제한됩니다, 현미경은 2D 기판에로 이루어집니다. 세포 이동 따라서 실험 및 이미지 분석을 단순화 3D 배양 용으로서 Z 축에서 트래킹 셀의 필요없이, 2 차원 배양 용으로 분석 될 수있다. 스크래치 분석에 의해 상처 치유 분석을 연구하려면이 프로토콜을 따르 <ol><li> 샌드위치 같은 문화 내에서 연구 세포 이동 (상처 치유 분석). <ol><li> 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다. </li><li> 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면 1 시간 동안 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 2 + Mg를 2 +에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어. <ol><li> 단백질 코팅 후 DPBS 두 번 샘플을 씻어순서를 초과하는 단백질을 제거합니다. 이어서 단백질 변성을 일으킬 수이 때문에 건조 샘플을 얻는 것을 방지하기 위해, 이들의 사용까지 DPBS에서 샘플을 배양. 가의 양이온 이후 2 + 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다. </li></ol></li><li> 고밀도 (13)에 커버 글라스에 종자 세포. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 세포가 합류를 달성 할 수있다. </li><li> 간격으로 구분이 세포 인구를 얻기 위해 세포 단일 층을 긁어 피펫 팁을 사용합니다. </li><li> 시간 경과 수집을위한 새로운 잘 적합한에서 복부 시드 기판을 놓고 등의 기판 (즉, 12 멀티 웰 플레이트)을 맞게한다. </li><li> 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이하고 (12 멀티 웰 플레이트 1 ㎖) 매체 리필. 주 : 세탁기의 중량을 방지 할 t그는 부동에서 기판을 지느러미. </li><li> 시간 경과 현미경에서 샘플을 배치 (37 ° C로 설정하고, 5 % CO 2)와 갭 폐쇄 매 20 분의 이미지를 가져 가라. </li><li> 같은 ImageJ에에서 플러그인 MiToBo로 특정 소프트웨어를 사용하여 갭 폐쇄를 분석한다. (14) </li></ol></li></ol> 주 : 단백질 및 핵산 추출은 기판 상에 2 차원으로 유사하게 수행된다. 추출 효율을 증가시키기 위해 세포에 직접 용해 완충액을 추가 샌드위치 형 배양 분해로 이루어져 하나의 추가 단계가있다. 예를 들어, mRNA의 추출 : <ol start="2"><li> 샌드위치 같은 문화에서의 mRNA를 추출 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 상업용 키트에서 모든 버퍼를 준비한다. </li><li> 인큐베이터에서 밖으로 샌드위치와 같은 문화를 가지고. </li><li> 샘플에서 배양 배지를 제거합니다. </li><li> DPBS이 칼슘을 함유 한 번 샘플을 씻으십시오Mg를 2+ 2+ (1 mL) 및 모든 용액을 제거한다. </li><li> 핀셋의 도움으로, 등의 기판을 제거하고 복부 기판에 용해 버퍼 (350 μL)를 추가합니다. 또한 지느러미 기판에 부착 세포를 용균시키기 위해 다시 복부 기판 지느러미 기판 오버레이. </li><li> 분해 용액을 분리하는 등의 기판을 제거합니다. </li><li> 의 mRNA를 얻기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li></ol> 참고 : 단백질의 면역 적 또한 2D 기판에로 수행 할 수 있습니다. 샌드위치 같은 문화가 항체와 버퍼의 올바른 확산을 방해 할 수 있기 때문에, 배양 시간이 증가한다. 또한, 샌드위치 염색 프로토콜을 시작하기 전에 분해 될 수 있지만, 후자의 경우 일부 셀은 등쪽 기판 및 기판에 대한 일부 복부에 부착 된 상태를 유지한다. <ol start="3"><li> 샌드위치 같은 문화 내에서 Immunodetect 단백질 <ol&gt; <li> DPBS 한 번 샘플을 세척하고 4 ℃에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 포름 알데히드로 고정한다. 주 : 도설 기판 확산 문제를 회피되도록 정착 과정에서 제거 될 수있다. </li><li> DPBS (1 ml)으로 헹군 후, RT에서 5 분 동안 0.5 % DPBS에서 트리톤 X-100 (1 ml)로 Permeabilize 하시려면. </li><li> RT에서 30 분 동안 1 % DPBS 알부민 (1 mL)로 비특이적 결합 부위를 차단. </li><li> 일차 항체와 함께 품어 (2 μg의 / ㎖ 1 ml)을 실온에서 3 시간 동안 솔루션을 차단한다. </li><li> DPBS 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다. </li><li> 실온에서 용액 (1 ml)에 차단하는 이차 항체 (2 μg의 / ㎖) 및 1 μg의 / ㎖ DAPI와 2 시간을 품어. </li><li> DPBS에서 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다. </li><li> DPBS에 씻으십시오. 참고 : 시료는 Vectashield와 슬라이드에 장착 등의 기판 전에 면역을 제거 할 때 매니큐어로 밀봉 할 수있다. </li><li> 형광 마이크로 하에서 관찰표준 2D 기판 용으로 범위. </li></ol></li></ol>

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	<li>Baker, B. M., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+the+third+dimension:+how+3D+culture+microenvironments+alter+cellular+cues.">Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).</li><li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).</li><li>Ruffner, H., Lichtenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture+systems--towards+primary+drug+discovery+platforms:+an+interview+with+Heinz+Ruffner+(Novartis)+and+Jan+Lichtenberg+(InSphero).">3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero).</a> Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).</li><li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs.">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li><li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration:+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis.">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).</li><li>Schor, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+'sandwich'+assay+for+quantifying+chemo-regulated+cell+migration+within+3-dimensional+matrices:+wound+healing+cytokines+exhibit+distinct+motogenic+activities+compared+to+the+transmembrane+assay.">A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).</li><li>Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+system+for+the+assessment+of+cell+migration+on+3D+micropatterned+substrates.">Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).</li><li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis.">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+sandwich-like+microenvironments.+Effect+on+cell+differentiation.">Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation.</a> Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-matrix+sandwich-like+microenvironments+to+manipulate+cell+fate.">Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate.</a> Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+and+ventral+stimuli+in+cell-material+interactions:+effect+on+cell+morphology.">Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology.</a> Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).</li><li>Ballester-Beltr&#225;n, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmer&#243;n-S&#225;nchez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+within+confined+sandwich-like+nanoenvironments.">Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments.</a> Nanomedicine. , (2015).</li><li>Gla&#223;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration+Analysis:+Segmenting+Scratch+Assay+Images+with+Level+Sets+and+Support+Vector+Machines.">Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines.</a> Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+traction-mediated+manipulation+of+the+cell/matrix+interface+to+control+stem-cell+fate.">Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate.</a> Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulatory+effects+of+a+three-dimensional+microenvironment+on+cell-mediated+fibronectin+fibrillogenesis.">Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

요즘, 3D 문화는 암을 포함한 세포 생물학에서 중요한 제약 및 생명 공학 산업을위한 주제뿐만 아니라 연구이고, 줄기 세포. 결과적으로 여러 3 차원 배양 시스템이 개발되어왔다. 불행히도, 3D 시스템 간의 차이는 일반적으로 세포의 운명 이해를 방해하는 다른 셀 동작이 발생할. 또한, 실험 절차는 일반적으로 2D 문화 시스템처럼 간단하지 않다. 따라서, 이들 단점 중 일부는 매우 중요하다 극복하?...

생체 세포의 미세 환경의 대부분은 3 차원 (3D) 성질을 가지고 있지만 전통적으로, 세포 배양 물은 바이 - 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 이 부 자연스러운 2D 환경은 평평한 세계에 스스로 적응하는 방법으로 세포의 행동 변화를 유발하는 직접적인 영향을 세포 운명 1,2. 따라서, 2 차원 세포 배양에서 얻어진 결과는 항상 생체 내에서 재현 할 수 없습니다. 이것은 모든 사이즈 의존성 생물학적기구 3,4-으로 더 통찰력을 얻기 위해 더 많은 생리 같은 조건을 제공하고자하는 새로운 비즈니스 배양 시스템의 개발을 장려하고있다. 2D는 세포 복부 부착 기판 상에 반해 생체 내에서 세포의 대부분이 완전히 ECM에 의해 둘러싸여있다 : 2 차원 배양 및 생체 환경에서 3D 간의 주된 차이점들 중 하나는 세포 외 기질 (ECM)에 고정 세포 수용체의 분포 따라서 CELL 밀착성이 수용체의 3 차원 분포를 통해 발생한다. 이것에 의해 이러한 세포 성장, 세포 분화 및 유전자 발현에 중요한 프로세스를 변조 다른 세포 접착 신호 전달 경로를 트리거한다. 그들의 변동 및 복잡성이 일반적인 세포 배양 과정에서의 표준화를 방해하지만 지난 수십 년 동안, 다양한 3 차원 배양 시스템은 5-8 확립되었다. 또한 3D 시스템은 일반적으로 처리 할 수​​ 및 2D 기판에 현재의 실험 절차는 쉽게 3D 문화 확립 할 수 없습니다 쉽지 않다. 또한, 문헌은 거의 이러한 모델에서 세포 행동의 적절한 이해를 방해하고, 동등한 조건 2D 또는 3D 다른 시스템과 3 차원 배양을 비교하지 않는다. 일단 2D 기판 등의 수용체의 자극에 부착 된 세포를 가진 - 신소재 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 - 셀 모두 응답 3D 환경을 트리거 할 수 있습니다. REA이 뒤에 아들은 지느러미와 복부 수용체 준수와 샌드위치 환경 내에서 확산 (그림 1) 9, 10 두의 동시 활성화입니다. 결과적으로, 세포는 배양 11,12 2D에 대해서 중요한 변화를 겪는다. 등의 자극이 키 세포 경로의 변화를 유발하기 때문에 따라서, 세포의 운명은, 때문에 샌드위치 문화의 조립시 결정됩니다. 따라서, 세포의 운명은 고도로 샌드위치 형 배양 11 조립 시간에 의해 결정된다. 인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 모두 복부 및 등쪽 측면에 같은 화학, 지형, 강성 및 단백질 코팅 같은 셀 / 재료 상호 상이한 파라미터들의 연구를 허용 간단하고 다양한 도구이다. 이는 넓은 V의 독립적 지느러미와 복부 조합에 다른 3D 시스템 (그림 2)에 비해 다양한 기능의 높은 수준을 제공합니다표면 상태의 ariety. 부가 적으로, 다른 세포주 및 배양 샌드위치 형 조립 상이한 시간은 가능성의 넓은 스펙트럼을 증가​​ 연구 될 수있다. 샌드위치 같은 문화의 표준 프로토콜을 사용하여 아래에 자세히 설명되어 하나 등의 기판, 단백질 코팅으로 복부 기판과 피브로넥틴 등의 유리 커버 슬립과 같은 산 (PLLA) 전기 방사 섬유 또는 필름-L-유산 폴리. 샌드위치 같은 문화는 세포 파종 후 또는 2D 문화의 3 시간 후 조립했다. 그러나, 다른 재료 시스템 및 단백질이 사용될 수 있음에 유의 마찬가지로 샌드위치 형상의 배양은 상이한 시점에서 조립 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ploy(lactic acid)</td>
			<td>NatureWorks</td>
			<td>4042D</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glasses (12 mm&#216;)</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>631-0666</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Scharlab</td>
			<td>CL0200</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>105228</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4010-200V0</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump Systems</td>
			<td>NE1000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Voltage DC Power Supply</td>
			<td>Glassman High Voltage</td>
			<td>Series FC</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hucoa-Herl&#246;s</td>
			<td>3111</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow&#160; hood</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>AV30/70</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74004</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMI 6000</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7409</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2287</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sandwich-like microenvironments to harness cell/material interactions

세포 배양은 전통적 세포가 생체 복부 표면 수용체를 사용하여 부착 BI 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 그러나, 생체 내에서, 대부분의 셀이 완전히 수용체의 3 차원 분포의 결과로, 세포 외 기질 (ECM)에 의해 둘러싸여있다. 이 신호 전달 경로에 외부-따라서 세포 행동의 차이를 유발 할 수 있습니다. 이 문서에서는 이미 새로운 물질 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 2D 기판에 부착 된 세포의 지느러미 수용체를 자극하는 표준 2D 문화에 대한 중요한 변경 사항을 트리거 보여줍니다. 또한, 복부와 지느러미 수용체의 동시 여기 가까이 3D 환경에서 발견에 셀 동작을 이동합니다. 또한 인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 세포 / 재료 INTE 상이한 파라미터들의 연구를 허용 다용도 공구이다ractions, 예를 들어, 지형, 강성과 모두 복부와 등의 측면에서 다른 단백질 코팅. 샌드위치 형 배양액 2D 기판에 기초하기 때문에 최종적으로, 여러 분석 절차는 이미 3D 시스템에 필요한 더 복잡한 절차를 극복 정상적으로 사용할 수있는 표준 2D 배양을 위해 개발.

샌드위치 형 배양 내 등쪽 수용체의 자극은 세포 형태학, 세포 부착 및 세포 내 신호 전달 경로 (예, 국소 유착 키나제, FAK) 10-12의 변화를 트리거한다. 다른 3D 배양 15,16 관찰로서 예를 들어, 샌드위치 형 시스템 내에서의 배양 섬유 아세포는 2D에 비해 5 인테그린 α 서브 유닛을 과발현. 셀 운명은 하이드로 겔과 같은 다른 3D 시스템에서 발생하는...

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Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

Cell culture has been traditionally carried out on bi-dimensional (2D) substrates where cells adhere using ventral receptors to the biomaterial surface. ...

sandwich-like-microenvironments-to-harness-cellmaterial-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.5K 조회수.  Universitat Politècnica de València. The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.

비디오: Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematologic 질환의 Microvascular 상호 작용 유학을위한 Endothelialized Microfluidics

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

태반의 맞은 편에 생체이 물과 나노 물질의 전송 속도의 결정을 사용하여<em&gt; 생체</em&gt; 인간 태반 관류 모델

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

세포 물질의 상호 작용 연구를위한 나노 기공 골드 패턴의 미세

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구<em&gt; 생체</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...