We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1.ピーク発光とクロストーク決意（また図2を参照してください） <ol><li>ドナー（クマリン誘導体のV450）およびアクセプター（フルオレセイン）色素の間の発光ピークとのクロストークの量を決定するために、405 nmの励起での個々のフルオロフォアの両方で標識された細胞のスペクトルスキャンを実行します。 </li><li> （ここでは455から465 nmおよび525から535 nm）のドナーとアクセプターチャネルに使用​​される各色素のピーク内に10 nmの帯域幅を決定します。波長以上の正規化強度をプロットし、アクセプターチャネルとその逆でドナー色素のクロストークの平均割合（ 図2）を計算します。 </li></ol> Y.の調製細胞培養の感染のエンテロコリチカ株<ol><li>以下の株を使用してください：WA-314 PMK-OVAが及び（WA-314は17 PMK-BLAとPMK-OVA 17、それぞれプラスミドで形質転換）WA-314ΔYopEPMK-BLA（WA-プラスミドPMK-BLA 17で形質転換314ΔYopE） </li><li>感染ストリークYの前に少なくとも2日WA-314 PMK-BLAとWA-314 PMK-OVAに必要な抗生物質（カナマイシンを含むLB寒天プレート上のクライオストックから株WA-314 PMK-OVA、WA-314 PMK-BLAとWA-314ΔEPMK-BLA エンテロコリチカ ;カナマイシンおよびWA-314ΔEPMK-BLAのためのテトラサイクリン）と27℃でO / Nを育てます。その後、4℃で最大1週間のプレートを保ちます。 </li><li>感染前のある日は、それぞれの株の1コロニーを、必要な抗生物質を含むLB培地の3ミリリットルを接種し、180rpmで振とう機で27℃でO / Nインキュベートします。 </li><li>感染の日に、抗生物質を含まない新鮮なLB培地40ml中にO / N培養物を2mlに接種し、III型分泌系の発現を誘導するために180rpmで振盪器中で37℃で90分間インキュベートします。 </li><li>適切なチューブに培養液を移し、氷の上または4℃で培養物を維持します今後。 5,000×gで、4℃で10分間培養液を遠心します。 </li><li>氷2〜3mlの冷PBS中で細菌ペレットを再懸濁します。分光光度計を使用して、8×10 8 CFU / mlの濃度の細菌懸濁液を希釈します。個別に対応する光学密度を決定します。 HeLa細胞に感染するまで氷上でこの懸濁液を保管してください。 </li></ol> 3.メッキHela細胞<ol><li>一日、96ウェルプレートのウェル中で、10％熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）を含有する200μlのDMEMで感染シード1.5×10 4細胞 、HeLa細胞の前に、37℃で5％CO 2インキュベーター内で育てます。各株（三つの異なるインキュベーション時間）のための3つのウェルをシード。 </li></ol> 4. HeLa細胞の感染とCCF4を使用したロード<ol><li>培地に細菌懸濁液の3.5μLを追加することにより、HeLa細胞に感染し、そっと中を二回ピペッティングして混ぜます。細菌が上の沈降することを許可します細胞当たり約100バクテリアのMOI（感染の部分）の細胞です。時間経過の場合は-90分、-60分-30分で感染を開始し、一般的なエンドポイントを達成するために、0分まで、5％CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーションが完了したときに、慎重にHeLa細胞を除去せずに培地を吸引し、CCF4の輸出を減らすためにエフェクターおよび2.5mMプロベネシドの発現を停止するために20μg/ mlのクロラムフェニコールを含有するPBSを50μl加えます。 </li><li>この時点で、顕微鏡ステージに96ウェルプレートに移し、各ウェルに、後の分析のために適切なスポットを定義します。 10分以内に、この手順を終了（取得の詳細については、セクション5.1を参照）。 </li><li>あたりがよく、20を含むCCF4 / AM負荷溶液（0.24μlの溶液A、1.2μlの溶液Bの70μL、18.56μlの溶液C（溶液A、B、及びCはCCF4 / AMローディングキット内に提供される）および50μlのPBSを（追加しますマルチPを使用して/ mlのクロラムフェニコールおよび2.5mMプロベネシド）ipetteを室温で5分間インキュベートすると。今から仕事の中断なし。 </li><li>ローディング溶液を吸引除去し、マルチピペットを用いて20μg/ mlのクロラムフェニコールおよび2.5mMプロベネシドを含む100μlのPBSを追加します。その後急速に顕微鏡ステージに96ウェルプレートを転送し、充填溶液の吸引から10分以内に取得を開始します。 </li></ol> 5.レーザー走査顕微鏡とデータ解析<ol><li>画像収集<ol><li>総光子数を最大化し、光毒性を最小限にするように撮影条件を設定し、光退色、クロス励起。 <ol><li>現代の共焦点レーザー走査型顕微鏡では、同時にアクティブなドナーおよびアクセプターチャネル、8ビット深度で高感度のGaAsP検出器を選択し、2.5エアリー単位（ すなわち、広い光学切片）に検出器のピンホールを開いて、20倍高い開口数の液浸対物レンズを使用し、〜750 nmの画素サイズ、3倍のフレーム平均とexcit405nmのダイオードレーザーの10％E。 </li><li>正確な定量化が同じ値に両チャンネルの検出器利得を設定確保し、いかなる飽和画素を回避すること。 注：ここでは、ゲインを150％に設定しました。 </li></ol></li><li> 1mlシリンジで例えば、ウェルの底に液浸媒体を拡散することによって、連続的な浸漬を確認し、任意の気泡の捕捉を避けます。 </li><li>透過光を有効にして、全てのウェル内の視野の代表フィールドを見つけます。正しく調整自動ステージを使用して、ソフトウェア内の位置をマークします。 </li><li>染色用のプレートを除去した後、（4.3節を参照）、プレートを再挿入し、焦点ずれを回避するために、上に重量を付加します。レーザ走査モードで保存された位置を確認し、適切にフォーカスし、横方向の位置を調整します。 </li><li> 2時間に、2分に期間を時間の経過を設定し、取得を開始します。 </li></ol></li><li>画像定量化（例としては、ビットプレーンSOFTWについて説明します）などIMARISの通りです<ol><li>ピクセル行列の算術計算を可能にするソフトウェアにデータセットをインポートします。ソフトウェアのアイコンをドナーとアクセプターチャネルの両方を含むソースファイルをドラッグ＆ドロップすることでこれを行います。 </li><li>同じオフセットを使用して、両方のチャネルでバックグラウンドを減算します。これを行うには、 メニューをクリックし、画像&gt;処理&gt;ベースライン減算をクリックします。各チャンネルを選択し、ベースライン値を入力します。 </li><li>予め決定された補正係数fとアクセプターチャネル（CH）にドナーチャネル（CH1）のブリードスルーを補正（1.1を参照）、新しいチャネルを作成します。 Ch1のF * - = CH 2 CH 2」 注：アクセプターのブリードスルードナーチャンネルにはノイズのレベルを超える検出されませんでした。 <ol><li>メニュー&gt;画像処理&gt;チャネル算数をクリックして、ABS（CH 2 - （CH1 * 0.33））を入力します。その後メニュー&gt; [編集]&gt; [チャンネルを削除]をクリックしてチャンネル2を削除します。ていることを確認してくださいブリードにより補正アクセプターチャネルとして残る新しいチャンネル2.オプション：[メニュー]&gt; [編集]&gt; [画像のプロパティに行くことによって、元の色にグレーのチャンネルカラーを変更します。カラー&gt;ベースカラーをマッピングされた&gt;チャネル4を選択し、緑などに変更します。 </li></ol></li><li>相対FRET係数を決定するために、次の操作で新しいチャネルを作成します。 CH3 = CH 2 &#39;/（CH1 + Ch2の&#39;） <ol><li> ./メニュー&gt;画像処理&gt;チャネル算数に移動して、CH2を入力（CH1 + CH2） </li></ol></li><li> 8ビット画像でのFRETチャンネルを適切に視覚化するために、第四のチャネルを作成します。 CH4 = 255 * Ch3の<ol><li>メニュー&gt;画像処理&gt;チャネル算数に移動し、255 *のCH3を入力します。[メニュー]&gt; [編集]&gt; [画像のプロパティに行くことによって、チャネルの色を変更します。チャンネル4&gt;マップされたカラー&gt;カラーテーブルファイル&gt;ジェットを選択します。 </li></ol></li><li>チャネルCH3およびCh4を股関節に3×3のメディアンフィルタを適用します。tは、画像のノイズを低減します。これを行うには、メニュー&gt;画像処理&gt;スムージング&gt;メジアンフィルタにクリックします。両方のチャンネルを選択し、フィルタサイズ「3x3x1」を適用します。 </li><li>細胞のシグナルの定量のために、適切にオフセットが小さすぎる構造を除外するように大きさの構造体をフィルタを設定することにより、Ch4を内のセルを検出します。 <ol><li> ビューを突破し、「 新しいサーフェスの追加」アイコンをクリックしてください]を選択します。表面ウィンドウで検出アルゴリズムのパラメータを定義します。より高速な処理のために、2つのチェックボックス「セグメント関心領域のみ」と「最終的にはプロセス全体のイメージを &quot;有効にします。その寸法を編集して、関心領域を定義します。 </li><li>ソース・チャンネルとしてチャンネル4を選択し、しきい値設定&gt;背景差分（局所的なコントラスト）によりしきい値を設定し、10μmの直径を設定します。最大intensiに手動で0に最小強度しきい値と最大しきい値を設定しますTY。地域によって構造を濾過し、 例えば、187μm²に最小値を設定します。表面検出を終了します。 </li></ol></li><li>携帯エンティティにおけるドナー蛍光強度の平均値（CH1）及び相対FRET係数（CH 3）とその標準偏差を抽出します。これを行うには、表面特性にアクセスしてください。サーフェススタイル/品質&gt;サーフェスを選択することにより、構造物の外観を変更します。フィルタ]タブをクリックすることで、すべての構造を選択します。選択&gt;統一を処理するために行くことによって検出された構造を統一。ファイルにすべての統計情報をエクスポート&gt;統計]タブをクリックして、MS Excelに表面の統計情報をエクスポートします。 </li><li>時間をかけてこれらの値をプロットします。転位置エフェクターの量を表すために合理的なパラメータとして、各条件のためのドナーチャンネル蛍光増加の最大傾斜の10分の間隔を指定します。 M =Δドナー蛍光強度/Δ時間（分）などの傾きを計算します。 </li></ol></lI&gt; </ol>

<ol>
	<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+type+III+secretion:+Salmonella+SipA+injection+into+host+cells.">Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).</li><li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif,+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter.">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).</li><li>Koberle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+enterocolitica+targets+cells+of+the+innate+and+adaptive+immune+system+by+injection+of+Yops+in+a+mouse+infection+model.">Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model.</a> PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).</li><li>Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cells+targeted+by+Salmonella+type+III+secretion+in+vivo.">Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo.</a> PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).</li><li>Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plague+bacteria+target+immune+cells+during+infection.">Plague bacteria target immune cells during infection.</a> Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+type+III+secretion+system+activity+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).</li><li>Heesemann, J., Laufs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+mobilizable+Yersinia+enterocolitica+virulence+plasmid.">Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid.</a> J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).</li><li>Zumbihl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxin+YopT+of+Yersinia+enterocolitica+induces+modification+and+cellular+redistribution+of+the+small+GTP-binding+protein+RhoA.">The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA.</a> J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ここでは、正常Yでエフェクター転座の定量分析のために、TEM-1ベータラクタマーゼレポーターベースのアッセイを適用しましたエンテロコリチカ 。この敏感な特定の比較的簡単な技術の多くの異なる変形例が文献に記載されています。この研究では、レーザ走査顕微鏡は、蛍光シグナルの最も高感度で正確な検出を行いました。具体的にドナーとアクセプター色素と個別に調整...

III型分泌系を直接標的真核細胞中にコードされた細菌のエフェクタータンパク質を提供するために、グラム陰性菌の異なる属が利用する特殊なタンパク質輸出機です。分泌機構自体が高度に保存されている一方で、エフェクタータンパク質の特殊なセットは、細胞シグナル伝達経路を操作し、特定の細菌の病原性戦略1を容易にするために、異なる細菌種間で進化してきました。 エルシニアの場合には、7エフェクタータンパク質、いわゆるYops（ エルシニア外側タンパク質）まで、宿主細胞の接触の際に転位などすなわち食作用およびサイトカイン産生、免疫細胞応答を破壊するために一緒に作用され、細菌の細胞外の生存を可能にします2-4。トランスロケーションのプロセスをしっかりと異なる段階5で制御されています。これは、T3SSの主要な活性化は、ターゲットCEとの接触によって誘発されることが確立されていますLL 6。しかし、この開始の正確なメカニズムはまだ解明されています。 エルシニアで転座のいわゆる微調整の第二のレベルは、細胞のRho GTP結合タンパク質Rac1のまたはRhoAのアップまたはダウンレギュレーション活動によって達成されます。転位しYopEのGAP（GTPアーゼ活性化タンパク質）関数は、Rac1活性をダウンレギュレートし、それに応じて負帰還型によって転位を減少するベーまたは細胞傷害性壊死因子Y（CNF-Y）でのRac1 などの活性化は、増加した転座7-9につながります機構10,11の。 有効かつ正確な方法は、転座は、 エルシニア 、宿主細胞の相互作用の間に調節する方法を調査するための前提条件です。多くの異なるシステムは、特定の利点と欠点を有するそれぞれ、この目的のために使用されてきました。いくつかのアプローチは、ウェスタンブロット分析を行った異なる界面活性剤によって感染した細胞の溶解ではなく、細菌に依存しています。目これらの方法の電子共通の欠点は、マイナーが、避けられない細菌溶解は、潜在的に細菌に関連するエフェクタータンパク質と細胞溶解液を汚染することです。しかし、細胞外エフェクタータンパク質および真核細胞の選択的溶解のためのジギトニンのその後の使用を分解するプロテイナーゼKでの細胞の処理は、この問題12を最小化するために提案されました。重要なことは、これらのアッセイは、決定的にほとんどが市販されていない高品質の抗エフェクター抗体に依存。転座を監視するために、エフェクタータンパク質とGFPなどの蛍光タンパク質の翻訳融合を使用しようとすると、おそらく蛍光タンパク質の球状三次構造と分泌13前にそれらを展開するために分泌装置のできないことに成功しませんでした。しかしCYAのような、いくつかの異なるレポータータグ（カルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼ） 百日咳菌毒素 cyclolysin 14またはフラッシュのドメインタグが正常に転座を分析するために使用されました。フラッシュタグ、非常に短いテトラ（4Cys）モチーフタグは、分泌のプロセスを妨げることなく、二ヒ素色素のFlashでの標識を可能にしながら、元のアッセイではCYAの酵素活性は、細胞内の融合タンパク質の信号を増幅するために使用されます15。 ここで適用されるアプローチは、によってシャルパンティエらは 、初めて報告され、転エフェクターTEM-1β-ラクタマーゼ融合物16（ 図1A）によって蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）色素CCF4の細胞内変換に基づいています。 CCF4 / AMは、クマリン誘導体（ドナー）およびフルオレセイン部分（アクセプタ）はセファロスポリンのコアによって連結された細胞透過性化合物です。真核生物の細胞内へのパッシブエントリー時には、非蛍光性エステル化CCF4 / AM化合物を仕込み、蛍光CCF4に携帯エステラーゼにより処理され、それによって捕捉され、セル内の。 530 nmの緑色の蛍光シグナルを発するフルオレセイン部分へのFRETの405 nmの結果でのクマリン部分の励起。 β-ラクタマーゼFRETによってセファロスポリンのコアの切断後に破壊され、クマリン部分の励起は、NM at460青色の蛍光発光につながります。この方法の別の用途は、その汎用性を強調し、文献に記載されています。この方法は 、インビトロで転座の分析を可能にし、 また 、インビボで、例えば、この技術は、インビボ 17-19 に転座の標的白血球集団を同定するために、マウスの感染モデルに使用しました。信号の読み出しは、プレートリーダー、FACS分析または蛍光顕微鏡を用いて行うことができます。注目すべきは、この方法は、感染プロセス20,21の間に、生細胞の顕微鏡検査により、リアルタイムで移動を監視する可能性を提供します。ここで、レーザ走査型蛍光顕微鏡に適用したreadou蛍光シグナルのトンそれは最高の感度と精度を提供していました。具体的には、高感度の検出器と組み合わせて、ナノメートル精度で放射窓を調整する能力は、最適化された蛍光検出と最小限にクロストークを容易にします。また、この顕微鏡の設定は、転座のリアルタイムモニタリングのために適合することができ、潜在的に細胞レベルでの宿主 - 病原体相互作用の同時分析のために可能になります。 Yのこの研究転速度でエンテロコリチカ野生型株とhypertranslocator表現型10,11を示す YopE欠失変異体は、例示的に分析しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

病原性エルシニア属を含む多くのグラム陰性菌。真核生物の標的細胞へのエフェクタータンパク質を転位するIII型分泌系を使用します。宿主細胞の内部にエフェクタータンパク質は、細菌の利益のために細胞機能を操作します。より良い転座を測定するために、宿主細胞の相互作用、敏感かつ正確なアッセイ中のIII型分泌の制御を理解するために必要とされます。ここでは、 腸炎エルシニアエフェクタータンパク質断片（エルシニア外側タンパク質; YopE）の融合に基づくアッセイのアプリケーションを記述している。転座の定量分析のためのTEM-1β-ラクタマーゼとのアッセイは、細胞の切断に依存している浸透性のFRET染料（CCF4 / AM）転座β-ラクタマーゼ融合による。 β-ラクタマーゼによってCCF4のセファロスポリンのコアの切断後、フルオレセインへクマリンからのFRETが中断され、クマリン部分の励起は、青色蛍光発光につながります。この方法の別の用途は、その汎用性を強調し、文献に記載されています。この方法は、マウスモデルでは、例えば、インビトロでもインビボで転座の分析を可能にします。蛍光信号の検出は、FACS分析または蛍光顕微鏡は、プレートリーダーを用いて行うことができます。ここで説明するセットアップでは、異なるエルシニア変異体によるHeLa細胞へのエフェクター融合物のインビトロ転位はレーザー走査顕微鏡によってモニターされます。リアルタイムでβ-ラクタマーゼエフェクター融合によるFRETレポーターの細胞内変換を記録する堅牢な定量的な結果を提供します。ここでは、Yで増加転座を実証する、典型的なデータを示し、 エンテロコリチカ YopE変異野生型株と比較。

定量的に、標的細胞へのエフェクターの移動を分析するために記載された方法の能力を実証するために、種々の転動態を有する2つのエルシニア菌株を試験した：Y.野生型株WA-314 エンテロコリチカ （血清群O8、病原性プラスミドpYVO8 22宿す）及びその誘導体WA-314ΔYopE（pYVO8ΔYopE23を保有する WA-314）。初期の作品は、ことが示されたY.機能YopEの展示に有?...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K ビュー.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

免疫・感染学

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;のsiRNAサイレンシング中

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

インフルエンザ血球凝集素抗体による Fc を介したエフェクター機能を評価する方法

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.