We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. שיא פליטה וקביעת הצלב-שיחה (ראה גם איור 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לקבוע את פסגות הפליטה וסכום של שיחה בין-בין התורם (V450 נגזר coumarin) וצבעים acceptor (העמסה), לבצע סריקות רפאים של תאים שכותרתו עם שני fluorophores הפרט ב 405 ננומטר עירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את רוחב פס של 10 ננומטר בשיא של כל צבע שישמש עבור ערוצי תורם acceptor (כאן 455-465 ננומטר ו525-535 ננומטר). העלילה העצמה המנורמלת על הגל ולחשב את האחוז הממוצע של הצטלבות של צבע התורם בערוץ acceptor ולהיפך (איור 2). </li></ol> 2. הכנה של י &#39; enterocolitica זנים לזיהום תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בזנים הבאים: WA-314 PMK-ביציות (WA-314 הפכו עם פלסמידים PMK-בלה 17 וPMK-ביציות 17, בהתאמה) וWA-314ΔYopE PMK-בלה (שר-המים314ΔYopE הפך עם פלסמיד PMK-בלה 17) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות יומיים לפני י &#39;פס ההדבקה enterocolitica זני WA-314 PMK-ביציות, WA-314 PMK-בלה וWA-314ΔE PMK-בלה מקריו מניות על צלחות LB-אגר המכילות אנטיביוטיקה הנדרשת (kanamycin לWA-314 PMK-בלה וWA-314 PMK-ביציות ; Kanamycin וטטרציקלין לWA-314ΔE PMK-בלה) ולגדול O / N ב 27 מעלות צלזיוס. לאחר מכן לשמור את הצלחות לעד שבוע ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני ההדבקה לחסן 3 מיליליטר של LB-בינוני המכיל אנטיביוטיקה הנדרשת עם מושבה אחת של הזנים המתאימים ודגירת O / N ב 27 ° C שייקר ב 180 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום של זיהום לחסן 2 מיליליטר של O / תרבות N ל40 מיליליטר של LB-בינוני טרי ללא אנטיביוטיקה ודגירה של 90 דקות ב 37 מעלות צלזיוס שייקר ב 180 סל&quot;ד לגרום לביטוי של מערכת הפרשת הסוג השלישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את התרבויות לתוך צינור מתאים ולשמור על התרבויות על קרח או על 4 מעלות צלזיוסמעכשיו. צנטריפוגה התרבויות במשך 10 דקות בXG 5000 ו- 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה חיידקים ב2-3 מיליליטר של קרח הקר PBS. לדלל את ההשעיה החיידקים בריכוז של 8 x 10 8 CFU / ml באמצעות ספקטרופוטומטר. לקבוע את הצפיפות האופטית המקבילה בנפרד. שמור השעיה זו על קרח עד הדבקת תאי הלה. </li></ol> 3. תאי ציפוי הלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני זרע זיהום 1.5 x 10 4 תאי תאי הלה יום אחד בDMEM 200 μl סרום המכיל 10% חום מומת עגל עוברי (FCS) בבארות של צלחת גם 96 ולטפח ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. זרעי שלוש בארות עבור כל זן (שלוש פעמים דגירה שונות). </li></ol> 4. זיהום של תאי הלה וטעינה עם CCF4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק תאי הלה על ידי הוספת 3.5 μl של ההשעיה החיידקים לטווח הבינוני ולערבב בעדינות על ידי pipetting בינוני פעמיים. לאפשר לחיידקים למשקעים בלתאים במשרד פנים (מחצית מזיהום) של כ -100 חיידקים לכל תא. לקורס זמן להתחיל זיהומים ב-90 דקות, ודקות -60 דקות -30 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 עד 0 דקות כדי להשיג נקודת סיום משותפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדגירה תושלם, לשאוב בזהירות הבינוני מבלי להסיר תאי הלה ולהוסיף 50 μl של PBS המכיל 20 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol להפסיק ביטוי של effectors וprobenecid 2.5 מ&quot;מ להפחתת יצוא של CCF4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה להעביר את צלחת 96-היטב לבמת מיקרוסקופ ולהגדיר כתמים מתאימים לניתוח מאוחר יותר בכל טוב. לסיים שלב זה תוך 10 דקות (לפירוט ראה סעיף 5.1 רכישה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל טוב, להוסיף 70 μl של פתרון CCF4 / טעינה בבוקר (פתרון 0.24 μl, פתרון B 1.2 μl, 18.56 μl C פתרון (פתרון, B, ו- C הניתן בערכה / טעינה בבוקר CCF4) ו -50 μl PBS (המכיל 20 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol ו -2.5 probenecid מ&quot;מ) באמצעות p רבipette דגירה במשך 5 דקות ב RT. מעתה והלאה עבודה ללא הפרעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון הטעינה ולהוסיף 100 של PBS μl המכיל 20 מיקרוגרם / מיליליטר chloramphenicol וprobenecid 2.5 מ&quot;מ באמצעות פיפטה רבת. לאחר מכן במהירות להעביר את צלחת 96 גם לבמת מיקרוסקופ ולהתחיל רכישה בתוך 10 דקות משאיפה של פתרון הטעינה. </li></ol> 5. סריקת הלייזר מיקרוסקופית וניתוח של נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תנאי ההדמיה בדרך למקסם את סך ספירת הפוטון ולמזער phototoxicity, photobleaching והעירור צולב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal מודרני, להשתמש אובייקטיבי מספרית גבוהה 20X טבילת צמצם, לפתוח את חריר הגלאי 2.5 יחידות אווריריות (כלומר חתך אופטי רחב,), לבחור רגישות גבוהה Gaasp גלאי עם ערוצי תורם acceptor בו זמנית פעילים, עומק 8 סיביות , ~ 750 גודל פיקסל ננומטר, מיצוע המסגרת של פי 3 וExcitדואר עם 10% מדיודת לייזר 405 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח כימות נכון להגדיר את רווח הגלאי של שני הערוצים לאותו הערך ולהימנע מכל פיקסלים רוויים. שים לב: כאן, הרווחים נקבעו ל -150%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא טבילה רציפה על ידי הפצה בינונית טבילה לתחתית הבארות, למשל עם מזרק 1 מיליליטר, ולהימנע מהשמנה של כל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את האור המועבר ולמצוא שדה נציג של נוף בכל היטב. השתמש בשלב אוטומטי מכויל כראוי ולסמן את המיקום בתוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת הצלחת לצביעה (ראה סעיף 4.3), הכנס שוב את הצלחת ולהוסיף משקל על עליון כדי למנוע סחף מוקדי. סקור את העמדות נשמרו עם מצב סריקת הלייזר ולהתאים את המיקוד ומיקום לרוחב כמו שצריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הזמן לשגות 2 דקות, את משך הזמן עד שעה 2 ולהתחיל רכישה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות תמונה (דוגמאות תינתן לBitplane Softwהם כמו Imaris) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את בסיס הנתונים לתוכנה המאפשרת חישובים אריתמטיים של מטריצות פיקסל. לעשות זאת על ידי גרירה ושחרור של קובץ המקור המכיל את שני התורם וערוץ acceptor על סמל התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הרקע בשני הערוצים באמצעות אותו הקיזוז. כדי לעשות זאת, לחץ על תפריט ולאחר מכן לחץ על תמונה&gt; עיבוד&gt; Baseline חיסור. בחר כל ערוץ והזן את הערך הבסיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את לדמם דרך ערוץ התורם (CH1) לערוץ acceptor (CH2) עם F נקבע מראש תיקון הגורם (ראה 1.1), יצירת ערוץ חדש: CH2 &#39;= CH2 - CH1 * F הערה: לדמם דרכו של acceptor לערוץ התורם לא הייתה לזיהוי על רמת הרעש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תפריט&gt; עיבוד תמונה&gt; ערוץ האריתמטיקה ולהיכנס ABS (ch2- (CH1 * 0.33)). לאחר מכן למחוק ערוץ 2 על ידי לחיצה על תפריט&gt; ערוך&gt; מחק ערוצים. ודא שלדמם דרך ערוץ acceptor תיקן נשאר כערוץ החדש 2. אופציונליים: שנה את צבע ערוץ מאפור לצבע המקורי על ידי לחיצה על תפריט&gt; מאפייני Edit&gt; תמונה. בחר ערוץ 4&gt; צבע&gt; צבע בסיס ממופה ולשנות אותו לדוגמה, ירוק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת ערוץ חדש עם הפעולה הבאה כדי לקבוע את מקדם סריג היחסי: CH3 CH2 = &quot;/ (CH1 CH2 + &#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתפריט&gt; עיבוד תמונה&gt; ערוץ האריתמטיקה ולהיכנס CH2 ./ (CH1 CH2 +) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדמיה תקינה של ערוץ סריג בתמונה 8 סיביות, ליצור ערוץ רביעי: CH4 = 255 CH3 * <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתפריט&gt; עיבוד תמונה&gt; ערוץ האריתמטיקה ולהיכנס 255 CH3 *. שינוי צבע הערוץ על ידי לחיצה על תפריט&gt; מאפייני Edit&gt; תמונה. בחר 4&gt; קובץ ממופה ערוץ הצבע&gt; צבע שולחן&gt; Jet. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מסנן חציון 3x3 לCH3 ערוצים וtha CH4לא יפחית את הרעש בתמונות. כדי לעשות זאת, לחץ על תפריט&gt; עיבוד תמונה&gt;&gt; סינון חציון החלקה. בחר בשני הערוצים ולהחיל גודל מסנן &quot;3x3x1&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכימות של אותות סלולריים, לזהות את התאים בCH4 ידי הגדרה כראוי קיזוז ולסנן את המבנים לפי גודל שלא לכלול מבנים קטנים מדי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר לעלות הצג ולחץ על הסמל &quot;הוסף משטחים חדשים&quot;. הגדר את הפרמטרים אלגוריתם זיהוי בחלון Surface. לעיבוד מהיר יותר, להפעיל את שתי תיבות סימון &quot;מגזר רק אזור של עניין&quot; ו- &quot;תמונה כל תהליך סוף סוף&quot;. הגדר את האזור של עניין על ידי עריכת ממדיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ 4 כערוץ המקור ולקבוע את הסף על ידי קביעת ערכי סף&gt; רקע חיסור (ניגודיות המקומית) ולהגדיר קוטר 10 מיקרומטר. הגדר את סף מינימום העצמה ידני ל0 ואת הסף המרבי להתעצם המרביטאי. סנן את המבנים על ידי אזור ולהגדיר את הערך המינימאלי לדוגמה, μm² 187. לסיים את זיהוי פני השטח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ את הערכים הממוצעים לעוצמת הקרינה תורם (CH1) ומקדם סריג יחסי (CH3) וסטיות התקן שלהם בישות הסלולרית. כדי לעשות זאת, ללכת למאפייני פני השטח. לשנות את המראה של המבנים על ידי בחירה&gt; משטח / איכות סגנון משטחים. בחר את כל המבנים על ידי לחיצה על כרטיסיית המסננים. לאחד את המבנים שזוהו על ידי הולך לתהליך בחירה&gt; לאחד. לייצא את הנתונים הסטטיסטיים משטח ל- MS Excel על-ידי לחיצה על הכרטיסייה בסטטיסטיקה&gt; סטטיסטיקה יצוא לקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עלילה ערכים אלה לאורך זמן. זהה את מרווח 10 דקות של שיפוע המרבי של עליית הקרינה ערוץ תורם לכל מצב כפרמטר סביר לייצג את כמות מפעיל translocated. חשב את השיפוע כמטר = עוצמת הקרינה תורם Δ / שעת Δ (דקות). </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Type+III+Secretion+Systems:+Specialized+Nanomachines+for+Protein+Delivery+into+Target+Cells.">Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells.</a> Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).</li><li>Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+functions+of+pathogenic+Yersinia+species.">Effector functions of pathogenic Yersinia species.</a> Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).</li><li>Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia's+stratagem:+targeting+innate+and+adaptive+immune+defense.">Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense.</a> Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).</li><li>Viboud, G. I., Bliska, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+outer+proteins:+role+in+modulation+of+host+cell+signaling+responses+and+pathogenesis.">Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis.</a> Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).</li><li>Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Yersinia+type+III+secretion+system:+traffic+control.">Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control.</a> Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).</li><li>Pettersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+virulence+factor+expression+by+pathogen+target+cell+contact.">Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact.</a> Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).</li><li>Schweer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+necrotizing+factor+of+Yersinia+pseudotuberculosis+(CNFY)+enhances+inflammation+and+Yop+delivery+during+infection+by+activation+of+Rho+GTPases.">The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases.</a> PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).</li><li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxic+necrotizing+factor-Y+boosts+Yersinia+effector+translocation+by+activating+Rac+protein.">Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein.</a> J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).</li><li>Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+controls+type+III+effector+delivery+into+host+cells+by+modulating+Rho+activity.">Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity.</a> PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).</li><li>Aili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Yersinia+Yop-effector+delivery+by+translocated+YopE.">Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE.</a> Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).</li><li>Gaus, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+YopE+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway+fine-tunes+Yop+delivery+into+host+cells+and+facilitates+systemic+spread+of+Yersinia+enterocolitica+in+host+lymphoid+tissue.">Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue.</a> Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).</li><li>Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YopB+of+Yersinia+enterocolitica+is+essential+for+YopE+translocation.">YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation.</a> Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).</li><li>Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+pathogenic+type+3+secretion+system+in+action.">Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).</li><li>Sory, M. P., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+hybrid+YopE-adenylate+cyclase+from+Yersinia+enterocolitica+into+HeLa+cells.">Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells.</a> Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).</li><li>Schlumberger, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+type+III+secretion:+Salmonella+SipA+injection+into+host+cells.">Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).</li><li>Charpentier, X., Oswald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+secretion+and+translocation+domain+of+the+enteropathogenic+and+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+effector+Cif,+using+TEM-1+beta-lactamase+as+a+new+fluorescence-based+reporter.">Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter.</a> J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).</li><li>Koberle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yersinia+enterocolitica+targets+cells+of+the+innate+and+adaptive+immune+system+by+injection+of+Yops+in+a+mouse+infection+model.">Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model.</a> PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).</li><li>Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cells+targeted+by+Salmonella+type+III+secretion+in+vivo.">Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo.</a> PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).</li><li>Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plague+bacteria+target+immune+cells+during+infection.">Plague bacteria target immune cells during infection.</a> Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+type+III+secretion+system+activity+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li><li>Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+effector+translocation+by+the+type+III+secretion+system+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).</li><li>Heesemann, J., Laufs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+mobilizable+Yersinia+enterocolitica+virulence+plasmid.">Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid.</a> J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).</li><li>Zumbihl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxin+YopT+of+Yersinia+enterocolitica+induces+modification+and+cellular+redistribution+of+the+small+GTP-binding+protein+RhoA.">The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA.</a> J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

אנחנו כאן מיושמים בהצלחה מבוססת assay כתב בטא לקטמאז TEM-1 לניתוח כמותי של טרנסלוקציה מפעיל על ידי י &#39; enterocolitica. וריאציות שונות של טכניקה רגישה, ספציפית ופשוטה יחסית זו תוארו בספרות. במחקר זה מיקרוסקופ סריקת לייזר נערך לגילוי רגיש והמדויק ביותר של אותות הקרינה. באופ?...

III מערכות הפרשת סוג מכונות חלבון-יצוא מיוחד מנוצל על ידי genera של חיידקי גרם שלילי לספק ישירות חלבוני מפעיל מקודדים bacterially לתאי יעד האיקריוטים שונה. בעוד מכונות ההפרשה עצמו שמור ביותר, סטים מיוחדים של חלבוני מפעיל התפתחו בין מיני חיידקים השונים כדי לתפעל מסלולי איתות תאיים ולהקל אסטרטגיות אלימות חיידקים ספציפיות 1. במקרה של Yersinia, עד שבעה חלבוני מפעיל, (חלבונים חיצוניים Yersinia) Yops שנקרא, הם translocated במגע תא מארח ולפעול יחד כדי לחתור תחת תגובות תא חיסון כגון ייצור phagocytosis וציטוקינים, כלומר, כדי לאפשר הישרדות תאית של החיידקים 2-4. התהליך של טרנסלוקציה נשלט בחוזקה בשלבים שונים 5. הוא קבע כי הפעלה ראשונית של T3SS מופעלת על ידי המגע שלה ליעד לספירהLL 6. עם זאת, המנגנון המדויק של חניכה זו הוא עדיין לא הובהר. בYersinia רמה שנייה של מה שנקרא כוונון עדין של טרנסלוקציה מושגת על ידי למעלה או פעילות של חלבוני Rho GTP מחייב Rac1 הסלולריים או RhoA ויסות כלפי מטה. הפעלה של Rac1 למשל על ידי גורם necrotizing invasin או ציטוטוקסיות Y (CNF-Y) מובילה לטרנסלוקציה עלתה 7-9, ואילו הפער (GTPase הפעלת חלבון) פונקציה של YopE translocated מסדירה את הפעילות-Rac1 ובהתאם יורד טרנסלוקציה ידי סוג משוב שלילי של מנגנון 10,11. שיטות תקפות ומדויקות הן התנאי ההכרחי כדי לחקור כיצד טרנסלוקציה מוסדרת במהלך האינטראקציה תא המארח Yersinia. מערכות רבות ושונות המשמשות למטרה זו, כל אחד עם יתרונות וחסרונות מסוימים. גישות יש להסתמך על תמוגה של תאים נגועים אך לא חיידקים על ידי חומרי ניקוי שונים ואחריו ניתוח כתם מערבי. החסרון משותף דואר של שיטות אלה הוא שתמוגה חיידקי קטין אך בלתי נמנעת שעלולה מזהמת את lysate התא עם הקשורים חיידקי חלבוני מפעיל. עם זאת, טיפול בתאים עם K proteinase להשפיל חלבוני מפעיל תאיים והשימוש הבא של digitonin לתמוגה סלקטיבית של התאים האיקריוטים הוצעו כדי למזער בעיה זו 12. חשוב לציין, מבחני אלה תלויים באופן מכריע על נוגדנים נגד מפעיל באיכות גבוהה, שהם בעיקר לא זמינים באופן מסחרי. ניסיונות להשתמש שילובי translational של חלבוני מפעיל וחלבוני ניאון כמו GFP לעקוב אחר טרנסלוקציה לא היו מוצלחים ככל הנראה בשל המבנה הכדורי שיישונים של חלבוני הניאון וחוסר היכולת של מנגנון ההפרשה להתפתח לפני ההפרשה 13. עם זאת תחום, כמה תגי כתב שונים כמו cya (cyclase adenylate calmodulin תלוי) של רעלן שעלת Bordetella cyclolysin 14 או פלאשתג שימש בהצלחה לניתוח טרנסלוקציה. בassay לשעבר הפעילות האנזימטית של cya משמשת כדי להגביר את האות של חלבון ההיתוך תאיים, ואילו תג פלאש, תג מוטיב tetracysteine ​​קצר מאוד (4Cys), מאפשר לתיוג עם פלאש הצבע biarsenical מבלי להפריע לתהליך של הפרשה 15. הגישה מיושמת כאן דווחה לראשונה על ידי שרפנטייה et al., והוא מבוסס על ההמרה תאית של CCF4 צבע תהודת העברת אנרגיית פורסטר (סריג) על ידי שילובי translocated מפעיל TEM-1 בטא לקטמאז 16 (איור 1 א). CCF4 / AM הוא תרכובת תא-permeant בי נגזר coumarin (תורם) ומחצית העמסה (acceptor) צמודות על ידי ליבת צפלוספורין. עם הכניסה פסיבית לתוך התא אוקריוטים, לא פלורסנט אסטרי מתחם CCF4 / AM מעובד על ידי esterases הסלולרי לCCF4 הטעון וניאון ולכודים ובכךבתוך התא. עירור של מחצית coumarin ב 405 ננומטר תוצאות בסריג למחצית והעמסת, אשר פולטת אותות הקרינה ירוקים ב530 ננומטר. לאחר המחשוף של ליבת צפלוספורין ידי סריג בטא לקטמאז מופר ועירור של מחצית coumarin מוביל לפליטת הקרינה הכחולה at460 ננומטר. יישומים שונים של שיטה זו תוארו בספרות הדגשה צדדיות שלה. השיטה מאפשרת ניתוח של טרנסלוקציה במבחנה וגם בin vivo, למשל, את הטכניקה הייתה בשימוש במודל זיהום עכבר כדי לזהות את אוכלוסיות יקוציט ממוקדות עבור טרנסלוקציה in vivo 17-19. קריאת נתונים של אותות ניתן לבצע באמצעות קוראי צלחת, ניתוח FACS או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ראוי לציין, השיטה מספקת גם את האפשרות לעקוב אחר טרנסלוקציה בזמן אמת על ידי מיקרוסקופ לחיות התאים במהלך 20,21 תהליך ההדבקה. כאן מיקרוסקופ פלואורסצנטי סריקת הלייזר יושם לreadouלא של אותות הקרינה כפי שהוא מספק רגישות ודיוק הגבוהות ביותר. בפרט, את היכולת להתאים את חלון הפליטה עם דיוק ננומטר בשילוב עם גלאים גבוהים רגישים מקל מותאמת גילוי הקרינה ולמזער הצטלבות. בנוסף התקנת מיקרוסקופיה זה יכולה להיות מותאם לניטור של טרנסלוקציה בזמן אמת ובאופן פוטנציאלי מאפשרת לניתוח בו זמני של אינטראקציה מארח הפתוגן ברמה התאית. בשיעורי טרנסלוקציה מחקר זה של י &#39; זן enterocolitica פראי סוג ומוטצית מחיקת YopE מציגה פנוטיפ hypertranslocator 10,11 נותחו exemplarily.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

חיידקי גרם שלילי רבים, כולל spp Yersinia פתוגניים. להעסיק סוג שלישי מערכות הפרשה לtranslocate חלבוני מפעיל לתאי יעד האיקריוטים. בתוך התא המארח חלבוני מפעיל לתפעל פונקציות סלולריות לטובת החיידקים. כדי להבין את השליטה של ​​הפרשת III הסוג במהלך אינטראקציה תא מארח, רגישה ומבחנים מדויקים יותר למדידת טרנסלוקציה נדרשים. אנחנו כאן לתאר את היישום של assay המבוסס על השילוב של שבר חלבון מפעיל Yersinia enterocolitica (חלבון החיצוני Yersinia; YopE). עם TEM-1 בטא לקטמאז לניתוח כמותי של טרנסלוקציה assay מסתמך על מחשוף של תא permeant סריג צבע (CCF4 / AM) על ידי היתוך בטא לקטמאז translocated. לאחר המחשוף של ליבת צפלוספורין של CCF4 ידי בטא לקטמאז, סריג מcoumarin להעמסה מופרת והעירור של מחצית coumarin מוביל לפליטת הקרינה כחולה.יישומים שונים של שיטה זו תוארו בספרות הדגשה צדדיות שלה. השיטה מאפשרת ניתוח של טרנסלוקציה במבחנה וגם בin vivo, למשל, במודל של עכברים. זיהוי של אותות הקרינה יכול להתבצע באמצעות קוראי צלחת, ניתוח FACS או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בהתקנה המתוארת כאן, בטרנסלוקציה מבחנה של שילובי מפעיל לתאי הלה על ידי מוטציות Yersinia שונות מנוטר על ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר. הקלטת המרה תאית של כתב סריג על ידי היתוך מפעיל בטא לקטמאז בזמן אמת מספקת תוצאות כמותיות חזקות. אנחנו כאן להראות נתונים למופת, מדגימים טרנסלוקציה המוגברת על ידי י &#39; המוטציה enterocolitica YopE בהשוואה לזן מהסוג בר.

כדי להדגים את היכולת של השיטה המתוארת לנתח טרנסלוקציה מפעיל לתאי יעד כמותית, שני זני Yersinia עם קינטיקה טרנסלוקציה שונה נחקרו: י &#39; זן enterocolitica סוג בר WA-314 (serogroup O8, מחסה פלסמיד הארסיות 22 pYVO8) וWA-314ΔYopE (WA-314 מחסה pYVO8ΔYopE 23) הנגזרים שלה. העבודה קודמת הרא...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions at JoVE.com

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K Views.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Video: Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi הקרנת עבור גורמים מארח מעורב Vaccinia וירוס זיהום באמצעות תסיסנית תאים

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

כרוני אוטואימונית יבש עין עכברוש דגם עם הגדלת זיכרון תאי זיכרון T ב Eyeball רקמות

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.