We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. Spitzenemission und Übersprechen Bestimmung (siehe auch Abbildung 2) <ol><li> Um die Emissionsspitzen und die Höhe des Übersprechens zwischen dem Donor (Cumarin-Derivat V450) und Akzeptor (Fluorescein) Farbstoffe zu bestimmen, führen spektralen Scans von Zellen, die sowohl einzelne Fluorophore bei 405 nm Anregung bezeichnet. </li><li> Bestimmen einer 10 nm Bandbreite, innerhalb der Spitze von jedem Farbstoff, der für die Donor- und Akzeptor-Kanälen (hier: 455-465 nm und 525-535 nm) verwendet wird. Zeichnen Sie die normierte Intensität über der Wellenlänge und die Berechnung der durchschnittliche Prozentsatz der Übersprechen der Donor-Farbstoff in der Akzeptor-Kanal und umgekehrt (Abbildung 2). </li></ol> 2. Herstellung von Y. enterocolitica Stämme für die Zellkultur-Infektion <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Stämme: WA-314 pMK-Eizellen und (WA-314 mit den Plasmiden pMK-bla 17 und PMK-17-Eizellen bzw. transformiert) WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformiert mit dem Plasmid pMK-bla 17) </li><li> Mindestens zwei Tage vor der Infektion Strähne Y. enterocolitica WA-314 pMK-Eizellen, WA-314 pMK-bla und cryo Bestände auf LB-Agarplatten, die die erforderlichen Antibiotika (Kanamycin für WA-314 pMK-bla und WA-314 pMK-Eizellen WA-314ΔE pMK-BLA ; Kanamycin und Tetracyclin für WA-314ΔE pMK-bla) und wachsen O / N bei 27 ° C. Danach halten die Platten für bis zu einer Woche bei 4 ° C. </li><li> Einen Tag vor der Infektion zu impfen 3 ml LB-Medium, das die erforderlichen Antibiotika mit einer Kolonie der jeweiligen Stämme und inkubieren O / N bei 27 ° C in einem Schüttler bei 180 UpM. </li><li> Am Tag der Infektion zu impfen 2 ml des O / N-Kultur in 40 ml frisches LB-Medium ohne Antibiotika und Inkubation für 90 min bei 37 ° C in einem Schüttler bei 180 rpm, um die Expression des Typ-III-Sekretionssystem induzieren. </li><li> Übertragen Sie die Kulturen in ein geeignetes Rohr und die Kulturen zu halten auf Eis oder bei 4 ° Cvon jetzt an. Zentrifugieren die Kulturen 10 min bei 5000 × g und 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Bakterienpellet in 2-3 ml eiskaltem PBS. Verdünnen der Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 8 x 10 8 cfu / ml unter Verwendung eines Spektrophotometers. Bestimmen Sie die entsprechende optische Dichte individuell. Bewahren Sie diese Suspension auf Eis, bis die Infektion der HeLa-Zellen. </li></ol> 3. Überzug HeLa-Zellen <ol><li> Einen Tag vor der Infektion Saatgut 1,5 x 10 4 Zellen HeLa-Zellen in 200 ul DMEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) in Vertiefungen einer 96-Well-Platte und pflegen in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Seed drei Brunnen für jeden Stamm (drei unterschiedlichen Inkubationszeiten). </li></ol> 4. Die Infektion von HeLa-Zellen und Laden mit CCF4 <ol><li> Infizieren HeLa-Zellen durch Zugabe von 3,5 ul der Bakteriensuspension auf das Medium und mischen durch vorsichtiges Pipettieren das Medium zweimal. Lassen Sie sich die Bakterien zu sedimentieren aufzu den Zellen bei einer MOI (Gruppierung of infection) von etwa 100 Bakterien pro Zelle. Für eine Zeit Kurs beginnen Infektionen bei -90 min, -60 und -30 min min und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator bis 0 min, um einen gemeinsamen Endpunkt zu erreichen. </li><li> Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, wird das Medium sorgfältig absaugen, ohne HeLa-Zellen und 50 &amp; mgr; l PBS, das 20 ug / ml Chloramphenicol, um die Expression von Effektoren und 2,5 mM Probenecid zu stoppen, um den Export von CCF4 reduzieren. </li><li> An dieser Stelle überweisen Sie den 96-Well-Platte in den Mikroskoptisch, und definieren geeignete Plätze für eine spätere Analyse in jede Vertiefung. Beenden Sie den Schritt innerhalb von 10 Minuten (für Details der Akquisition siehe Abschnitt 5.1). </li><li> Pro Loch, fügen Sie 70 ul CCF4 / AM Beladungslösung (0,24 &amp; mgr; l Lösung A, 1,2 ul Lösung B, 18,56 &amp; mgr; l Lösung C (Lösung A, B und C innerhalb CCF4 / AM Lade Kit enthalten) und 50 ul PBS (enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid) unter Verwendung einer Mehr pipette und Inkubation für 5 min bei RT. Von nun an Arbeiten ohne Unterbrechungen. </li><li> Absaugen Beladungslösung und 100 ul PBS, enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid mit einem Multipipette. Dann schnell die Platte mit 96 Vertiefungen übertragen in den Mikroskoptisch und starten Akquisition innerhalb von 10 Minuten vom Streben der Beladungslösung. </li></ol> 5. Laser Scanning Mikroskopie und Analyse von Daten <ol><li> Bilderfassung <ol><li> Setzen die Bilderzeugungsbedingungen in einer Weise, um die Gesamtphotonenzahl zu maximieren und Phototoxizität, Photobleichen und Queranregung. <ol><li> In einer modernen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, mit einem 20X hoher numerischer Apertur Sionsobjektiv, öffnen Sie den Detektor Pinhole bis 2,5 Airy-Einheiten (dh breite optische Schnitte), wählen Sie eine hohe Empfindlichkeit GaAsP-Detektoren gleichzeitig aktive Donor und Akzeptor-Kanäle, 8 Bit-Tiefe , ~ 750 nm Pixelgröße, 3-fach-Rahmen Mittelwertbildung und excite mit 10% einer 405 nm Laserdiode. </li><li> Um zu gewährleisten, stellen Sie die korrekte Quantifizierung Detektor-Verstärkung beider Kanäle auf den gleichen Wert und zu gesättigten Pixeln zu vermeiden. Anmerkung: Hier wurden die Gewinne zu 150% festgelegt. </li></ol></li><li> Sicherzustellen Überflutung durch Spreizen Sionsmediums zum Boden der Vertiefungen, beispielsweise mit einer 1 ml Spritze und das Einfangen von Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Aktivieren Sie den Durchlicht und finden Sie eine repräsentative Sichtfeld in jeder gut. Verwenden Sie eine richtig kalibriert automatische Bühne und markieren Sie die Position in der Software. </li><li> Nach der Entfernung der Platte für die Färbung (siehe Abschnitt 4.3), legen Sie die Platte und fügen Sie ein Gewicht auf den Brenndrift zu vermeiden. Überprüfen Sie die gespeicherten Positionen mit der Laser-Scanning-Modus und stellen Sie den Fokus und Seitenlage richtig. </li><li> Stellen Sie den Zeitablauf bis 2 Minuten, die Dauer bis 2 Stunden und starten Akquisition. </li></ol></li><li> Bildquantifizierung (Beispiele für Bitplane Softw gegeben werdensind wie Imaris) <ol><li> Importieren Sie die Datenmenge in Software, die arithmetische Berechnungen von Pixelmatrix ermöglicht. Tun Sie dies durch Ziehen und Ablegen die Quelldatei, die sowohl den Donor und Akzeptor-Kanal auf das Software-Symbol. </li><li> Subtrahieren Sie den Hintergrund in beiden Kanälen mit den gleichen Versatz. Um dies zu tun, klicken Sie auf Menü und dann auf Bild&gt; Verarbeitung&gt; Basisliniensubtraktion. Wählen Sie jeden Kanal und geben Sie den Ausgangswert. </li><li> Korrigieren Sie den Durchschlag des Spenders Kanal (CH1) in das Akzeptor-Kanal (CH2) mit der vorgegebenen Korrekturfaktor f (siehe 1.1), die Schaffung eines neuen Kanal: Ch2 &#39;= CH 2 - Ch1 * f HINWEIS: Ein Durchschlagen des Akzeptors in den Spender Kanal nicht über die Höhe der Rausch nachweisbar. <ol><li> Klicken Sie auf Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Danach löschen Sie Kanal 2, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Kanäle löschen. Sicherzustellen, dass dieDurchschlagen korrigiert Akzeptorkanal bleibt der neue Kanal 2. Optional: Ändern Sie den Kanal Farbe von grau auf die ursprüngliche Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Grundfarbe und ändern Sie es in zB grün. </li></ol></li><li> Erstellen Sie einen neuen Kanal mit den folgenden Vorgang, um die relative FRET Koeffizienten zu bestimmen: Ch3 = CH 2 &#39;/ (Ch1 + Ch2&#39;) <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben ch2 ./ (ch1 + ch2) </li></ol></li><li> Für die richtige Visualisierung der FRET-Kanal in einem 8-Bit-Bild, erstellen Sie einen vierten Kanal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie 255 * CH 3. Ändern Sie den Kanal Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Farbtabelle Datei&gt; Jet. </li></ol></li><li> Tragen Sie eine 3x3 Medianfilter, um die Kanäle CH3 und CH4 that das Rauschen in den Bildern zu reduzieren. Um dies zu tun, Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Glätten&gt; Median-Filter klicken. Wählen Sie beide Kanäle und einen Filter Größe &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Zur Quantifizierung von zellulären Signalen, erkennen die Zellen in Ch4 durch geeignetes Einstellen der Offset und filtern Sie die Strukturen durch Größe, um zu kleine Strukturen auszuschließen. <ol><li> Wählen Sie die Surpass-Ansicht und klicken Sie auf das Symbol &quot;Neue Oberflächen&quot;. Definieren Sie die Erkennungsalgorithmus Parameter in der Oberflächen Fenster. Für eine schnellere Verarbeitung, aktivieren Sie die beiden Checkboxen &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; und &quot;Prozess gesamte Bild endlich&quot;. Definieren Sie die Region von Interesse, indem Sie ihren Dimensionen. </li><li> Wählen Sie Channel 4 als Quellkanal und stellen Sie die Schwelle durch Thresholding&gt; Hintergrund Subtraktion (Local Contrast) und stellen Durchmesser bis 10 um. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle manuell auf 0 und die maximale Schwelle der maximalen intensiviertty. Filtern Sie die Strukturen durch Bereich und den Minimalwert auf zB 187 um². Beenden Sie die Oberflächenerfassung. </li></ol></li><li> Extrahieren der Mittelwerte für Donorfluoreszenzintensität (Ch1) und die relative FRET Koeffizienten (CH3) und ihre Standardabweichungen im zellularen Entität. Um dies zu tun, gehen Sie auf die Oberflächeneigenschaften. Ändern Sie das Aussehen der Strukturen durch Auswahl Surfaces Style / Qualität&gt; Surface. Wählen Sie alle Strukturen, indem Sie auf die Registerkarte Filter. Vereinheitlichen Sie die erfassten Strukturen, indem Sie auf Auswahl&gt; Unify verarbeiten. Exportieren Sie die Oberfläche Statistiken in MS Excel, indem Sie auf der Registerkarte Statistik&gt; Export Alle Statistiken in Datei. </li><li> Zeichnen Sie diese Werte im Laufe der Zeit. Identifizierung der 10 min-Intervall der maximalen Steigung der Spenderkanal Fluoreszenzzunahme für jede Bedingung als eine vernünftige Parameter, um die Menge an transloziert Effektor darzustellen. Berechnung der Steigung m = Δ Donorfluoreszenzintensität / Δ Zeit (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir hier erfolgreich angewendet ein TEM-1-beta-Lactamase-Reporter-basierten Assay für die quantitative Analyse von Effektorzellen Translokation von Y. enterocolitica. Viele verschiedene Variationen dieses empfindliche, spezifische und relativ einfache Technik, wurden in der Literatur beschrieben worden. In dieser Studie wurde der Laser Scanning Mikroskopie für die empfindlichsten und präzise Detektion von Fluoreszenzsignalen durchgeführt. Insbesondere die Korrektur für das Übersprechen zwischen d...

Typ III-Sekretion Systeme sind von verschiedenen spezialisierten Genera gram-negativer Bakterien, direkt liefern bakteriell kodierte Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen genutzt Protein-Export-Maschinen. Während die Sekretion Maschine selbst ist hoch konserviert, haben spezialisierte Gruppen von Effektorproteinen zwischen den verschiedenen Bakterienarten entwickelt, um Signale der Zelle verändern und erleichtern bestimmten bakteriellen Virulenz-Strategien ein. Im Falle von Yersinia, bis zu sieben Effektorproteine ​​sogenannte Yops (Yersinia äußeren Proteine), werden bei Wirtszelle Kontakt transloziert und wirken zusammen, um die Immunzellantworten, wie Phagozytose und die Cytokin-Produktion, dh wandern, um extrazelluläre Überleben der Bakterien erlauben 2-4. Der Prozess der Translokation ist eng in den verschiedenen Phasen 5 gesteuert. Es ist erwiesen, dass die primäre Aktivierung des T3SS durch seinen Kontakt mit dem Ziel ce ausgelöstll 6. Jedoch ist der genaue Mechanismus dieser Einleitung noch aufgeklärt werden. Yersinia in eine zweite Ebene von sogenannten Feinabstimmung der Translokation durch Aufwärts- oder Abwärtsregulierende Aktivität der zellulären Rho GTP-bindenden Proteinen Rac1 oder RhoA erreicht. Aktivierung von Rac1 zB durch Invasindomäne oder zytotoxische nekrotisierende Faktor Y (CNF-Y) führt zu einer erhöhten Translokation 7-9, während die GAP (GTPase-aktivierendes Protein) Funktion transloziert YopE herunterreguliert Rac1-Aktivität und dementsprechend verringert sich die Translokation durch eine negative Rückkopplung der Mechanismus 10,11. Gültig und präzise Methoden sind die Voraussetzung, um zu untersuchen, wie die Translokation bei Yersinia Wirtszellinteraktion wird geregelt. Viele verschiedene Systeme wurden für diesen Zweck mit spezifischen Vor- und Nachteile gelegt, wobei jeder. Einige Ansätze beruhen auf der Lyse von infizierten Zellen, nicht aber Bakterien durch verschiedene Reinigungsmittel, gefolgt von Western-Blot-Analyse. The gemeinsamer Nachteil dieser Verfahren ist, dass geringfügige, aber unvermeidliche Bakterienlyse potentiell verunreinigt das Zelllysat mit Bakterien-assoziierten Effektor-Proteine. Die Behandlung der Zellen mit Proteinase K, um extrazelluläre Effektorproteine ​​und die anschließende Verwendung von Digitonin zur selektiven Lyse der eukaryotischen Zellen abgebaut wurden vorgeschlagen, um dieses Problem zu 12 zu minimieren. Wichtig ist, dass diese Assays entscheidend davon abhängen, hochwertige Anti-Effektor-Antikörper, die größtenteils im Handel erhältlich sind es nicht. Versuche, translationale Fusionen Effektorproteine ​​und fluoreszierende Proteine ​​wie GFP verwenden, um die Translokation zu überwachen, waren nicht erfolgreich wahrscheinlich aufgrund der globularen Tertiärstruktur der fluoreszierenden Proteine ​​und der Unfähigkeit des Sekretionsapparates, sie vor Sekretion 13 entfalten. Doch verschiedene Reporter-Tags wie die cya (Calmodulin-abhängige Adenylatcyclase) Domäne des Bordetella pertussis Toxin cyclolysin 14 oder dem Flash-Tag wurden erfolgreich eingesetzt, um die Translokation zu analysieren. Im ersteren Assay die enzymatische Aktivität der cya wird verwendet, um das Signal des intrazellulären Fusionsprotein zu verstärken, während der Flash Tag, ein sehr kurzer Tetracysteinmotiv (4cys) Motiv-Tag ermöglicht die Kennzeichnung mit dem biarsenische Farbstoff Flash ohne den Prozess der Sekretion stören 15. Das hier angewandte Konzept wurde erstmals von Charpentier et al. Berichtet, und ist an der intrazellulären Umwandlung des Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Farbstoff CCF4 durch transloziert Effektor TEM-1-beta-Lactamase-Fusionen 16 (1A) auf der Basis. CCF4 / AM ist ein zelldurchdringenden Verbindung, in der ein Cumarin-Derivat (Donor) und eine Fluoresceingruppe (Akzeptor) werden durch ein Cephalosporin-Kerns verbunden ist. Beim passiven Eintritt in die eukaryotische Zelle, die nicht-fluoreszierende verestert CCF4 / AM-Verbindung durch zelluläre Esterasen zu der geladenen und fluoreszierende CCF4 verarbeitet und dadurch gefangeninnerhalb der Zelle. Anregung der Kumarin-Gruppe bei 405 nm ergibt FRET an die Fluoresceingruppe, die ein grünes Fluoreszenzsignal bei 530 nm emittiert. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern durch die Beta-Lactamase FRET gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission at460 nm. Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, beispielsweise wurde die Technik in einem Mausinfektionsmodell verwendet, um die Leukozyten-Populationen für die Translokation in vivo 17-19 gezielte identifizieren. Auslesen der Signale kann mit Plattenlesegeräte, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Zu beachten ist, sieht das Verfahren auch die Möglichkeit, Translokation in Echtzeit Live-Zell-Mikroskopie während des Infektionsprozesses 20,21 überwachen. Hier wurde Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie für readou angewendett von Fluoreszenzsignalen da sie die höchste Empfindlichkeit und Genauigkeit. Insbesondere die Möglichkeit der Emissionsfenster mit Nanometer-Präzision in Kombination mit hochempfindlichen Detektoren erleichtert optimierte Fluoreszenzdetektion und minimiert ein Übersprechen zu justieren. Zusätzlich kann diese Einrichtung für die Mikroskopie eine Echtzeitüberwachung der Translokation angepasst werden und potenziell ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktion auf zellulärer Ebene. In dieser Studie Translokationsgeschwindigkeiten eines Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm und eine YopE Deletionsmutante die eine hypertranslocator Phänotyp 10,11 wurden exemplarisch analysiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Viele gramnegative Bakterien einschließlich pathogenen Yersinia spp. Beschäftigen Typ III-Sekretion Systeme Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen zu translozieren. Im Inneren der Wirtszelle die Effektor-Proteine ​​zu manipulieren zellulären Funktionen zum Vorteil der Bakterien. Um die Kontrolle des Typ III-Sekretion während der Host-Zell-Interaktion, empfindliche und genaue Tests besser zu verstehen, um die Translokation zu messen sind erforderlich. Wir beschreiben hier die Anwendung eines Assays auf der Basis der Fusion einer Yersinia enterocolitica Effektorprotein Fragment (Yersinia Außen Protein; YopE). TEM-1-Beta-Lactamase für eine quantitative Analyse der Translokation Der Assay beruht auf der Spaltung einer Zelle permeant FRET-Farbstoff (CCF4 / AM) durch transloziert Beta-Lactamase-Fusion. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern CCF4 durch die Beta-Lactamase, FRET von Cumarin zu Fluorescein ist gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission.Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, zB in einem Maus-Modell. Detektion der Fluoreszenzsignale kann unter Verwendung von Plattenleser, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie werden. In der hier von verschiedenen Yersinia Mutanten beschrieben, in vitro Translokation von Effektor-Fusionen in HeLa-Zellen-Setup wird durch Laser Scanning Mikroskopie überwacht. Aufzeichnung intrazellulären Umwandlung des FRET-Reporter durch die Beta-Lactamase-Effektor-Fusion in Echtzeit bietet robuste quantitative Ergebnisse. Wir zeigen hier beispielhafte Daten, was zeigt, erhöhte Translokation von einem Y. enterocolitica YopE Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.

Um die Leistungsfähigkeit des beschriebenen Verfahrens zeigen, um quantitativ zu analysieren Effektor Translokation in Zielzellen wurden zwei Yersinia-Stämmen mit unterschiedlichen Translokation Kinetik untersucht: Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm WA-314 (Serogruppe O8, beherbergen die Virulenzplasmid pYVO8 22) und seine Ableitung WA-314ΔYopE (WA-314 beherbergt pYVO8ΔYopE 23). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Y. enterocolitica Mutanten ohne funktionelle YopE eine ...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K Aufrufe.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.