We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. Spitzenemission und Übersprechen Bestimmung (siehe auch Abbildung 2) <ol><li> Um die Emissionsspitzen und die Höhe des Übersprechens zwischen dem Donor (Cumarin-Derivat V450) und Akzeptor (Fluorescein) Farbstoffe zu bestimmen, führen spektralen Scans von Zellen, die sowohl einzelne Fluorophore bei 405 nm Anregung bezeichnet. </li><li> Bestimmen einer 10 nm Bandbreite, innerhalb der Spitze von jedem Farbstoff, der für die Donor- und Akzeptor-Kanälen (hier: 455-465 nm und 525-535 nm) verwendet wird. Zeichnen Sie die normierte Intensität über der Wellenlänge und die Berechnung der durchschnittliche Prozentsatz der Übersprechen der Donor-Farbstoff in der Akzeptor-Kanal und umgekehrt (Abbildung 2). </li></ol> 2. Herstellung von Y. enterocolitica Stämme für die Zellkultur-Infektion <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Stämme: WA-314 pMK-Eizellen und (WA-314 mit den Plasmiden pMK-bla 17 und PMK-17-Eizellen bzw. transformiert) WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformiert mit dem Plasmid pMK-bla 17) </li><li> Mindestens zwei Tage vor der Infektion Strähne Y. enterocolitica WA-314 pMK-Eizellen, WA-314 pMK-bla und cryo Bestände auf LB-Agarplatten, die die erforderlichen Antibiotika (Kanamycin für WA-314 pMK-bla und WA-314 pMK-Eizellen WA-314ΔE pMK-BLA ; Kanamycin und Tetracyclin für WA-314ΔE pMK-bla) und wachsen O / N bei 27 ° C. Danach halten die Platten für bis zu einer Woche bei 4 ° C. </li><li> Einen Tag vor der Infektion zu impfen 3 ml LB-Medium, das die erforderlichen Antibiotika mit einer Kolonie der jeweiligen Stämme und inkubieren O / N bei 27 ° C in einem Schüttler bei 180 UpM. </li><li> Am Tag der Infektion zu impfen 2 ml des O / N-Kultur in 40 ml frisches LB-Medium ohne Antibiotika und Inkubation für 90 min bei 37 ° C in einem Schüttler bei 180 rpm, um die Expression des Typ-III-Sekretionssystem induzieren. </li><li> Übertragen Sie die Kulturen in ein geeignetes Rohr und die Kulturen zu halten auf Eis oder bei 4 ° Cvon jetzt an. Zentrifugieren die Kulturen 10 min bei 5000 × g und 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Bakterienpellet in 2-3 ml eiskaltem PBS. Verdünnen der Bakteriensuspension auf eine Konzentration von 8 x 10 8 cfu / ml unter Verwendung eines Spektrophotometers. Bestimmen Sie die entsprechende optische Dichte individuell. Bewahren Sie diese Suspension auf Eis, bis die Infektion der HeLa-Zellen. </li></ol> 3. Überzug HeLa-Zellen <ol><li> Einen Tag vor der Infektion Saatgut 1,5 x 10 4 Zellen HeLa-Zellen in 200 ul DMEM, enthaltend 10% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) in Vertiefungen einer 96-Well-Platte und pflegen in einem 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Seed drei Brunnen für jeden Stamm (drei unterschiedlichen Inkubationszeiten). </li></ol> 4. Die Infektion von HeLa-Zellen und Laden mit CCF4 <ol><li> Infizieren HeLa-Zellen durch Zugabe von 3,5 ul der Bakteriensuspension auf das Medium und mischen durch vorsichtiges Pipettieren das Medium zweimal. Lassen Sie sich die Bakterien zu sedimentieren aufzu den Zellen bei einer MOI (Gruppierung of infection) von etwa 100 Bakterien pro Zelle. Für eine Zeit Kurs beginnen Infektionen bei -90 min, -60 und -30 min min und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator bis 0 min, um einen gemeinsamen Endpunkt zu erreichen. </li><li> Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, wird das Medium sorgfältig absaugen, ohne HeLa-Zellen und 50 &amp; mgr; l PBS, das 20 ug / ml Chloramphenicol, um die Expression von Effektoren und 2,5 mM Probenecid zu stoppen, um den Export von CCF4 reduzieren. </li><li> An dieser Stelle überweisen Sie den 96-Well-Platte in den Mikroskoptisch, und definieren geeignete Plätze für eine spätere Analyse in jede Vertiefung. Beenden Sie den Schritt innerhalb von 10 Minuten (für Details der Akquisition siehe Abschnitt 5.1). </li><li> Pro Loch, fügen Sie 70 ul CCF4 / AM Beladungslösung (0,24 &amp; mgr; l Lösung A, 1,2 ul Lösung B, 18,56 &amp; mgr; l Lösung C (Lösung A, B und C innerhalb CCF4 / AM Lade Kit enthalten) und 50 ul PBS (enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid) unter Verwendung einer Mehr pipette und Inkubation für 5 min bei RT. Von nun an Arbeiten ohne Unterbrechungen. </li><li> Absaugen Beladungslösung und 100 ul PBS, enthaltend 20 ug / ml Chloramphenicol und 2,5 mM Probenecid mit einem Multipipette. Dann schnell die Platte mit 96 Vertiefungen übertragen in den Mikroskoptisch und starten Akquisition innerhalb von 10 Minuten vom Streben der Beladungslösung. </li></ol> 5. Laser Scanning Mikroskopie und Analyse von Daten <ol><li> Bilderfassung <ol><li> Setzen die Bilderzeugungsbedingungen in einer Weise, um die Gesamtphotonenzahl zu maximieren und Phototoxizität, Photobleichen und Queranregung. <ol><li> In einer modernen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, mit einem 20X hoher numerischer Apertur Sionsobjektiv, öffnen Sie den Detektor Pinhole bis 2,5 Airy-Einheiten (dh breite optische Schnitte), wählen Sie eine hohe Empfindlichkeit GaAsP-Detektoren gleichzeitig aktive Donor und Akzeptor-Kanäle, 8 Bit-Tiefe , ~ 750 nm Pixelgröße, 3-fach-Rahmen Mittelwertbildung und excite mit 10% einer 405 nm Laserdiode. </li><li> Um zu gewährleisten, stellen Sie die korrekte Quantifizierung Detektor-Verstärkung beider Kanäle auf den gleichen Wert und zu gesättigten Pixeln zu vermeiden. Anmerkung: Hier wurden die Gewinne zu 150% festgelegt. </li></ol></li><li> Sicherzustellen Überflutung durch Spreizen Sionsmediums zum Boden der Vertiefungen, beispielsweise mit einer 1 ml Spritze und das Einfangen von Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Aktivieren Sie den Durchlicht und finden Sie eine repräsentative Sichtfeld in jeder gut. Verwenden Sie eine richtig kalibriert automatische Bühne und markieren Sie die Position in der Software. </li><li> Nach der Entfernung der Platte für die Färbung (siehe Abschnitt 4.3), legen Sie die Platte und fügen Sie ein Gewicht auf den Brenndrift zu vermeiden. Überprüfen Sie die gespeicherten Positionen mit der Laser-Scanning-Modus und stellen Sie den Fokus und Seitenlage richtig. </li><li> Stellen Sie den Zeitablauf bis 2 Minuten, die Dauer bis 2 Stunden und starten Akquisition. </li></ol></li><li> Bildquantifizierung (Beispiele für Bitplane Softw gegeben werdensind wie Imaris) <ol><li> Importieren Sie die Datenmenge in Software, die arithmetische Berechnungen von Pixelmatrix ermöglicht. Tun Sie dies durch Ziehen und Ablegen die Quelldatei, die sowohl den Donor und Akzeptor-Kanal auf das Software-Symbol. </li><li> Subtrahieren Sie den Hintergrund in beiden Kanälen mit den gleichen Versatz. Um dies zu tun, klicken Sie auf Menü und dann auf Bild&gt; Verarbeitung&gt; Basisliniensubtraktion. Wählen Sie jeden Kanal und geben Sie den Ausgangswert. </li><li> Korrigieren Sie den Durchschlag des Spenders Kanal (CH1) in das Akzeptor-Kanal (CH2) mit der vorgegebenen Korrekturfaktor f (siehe 1.1), die Schaffung eines neuen Kanal: Ch2 &#39;= CH 2 - Ch1 * f HINWEIS: Ein Durchschlagen des Akzeptors in den Spender Kanal nicht über die Höhe der Rausch nachweisbar. <ol><li> Klicken Sie auf Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Danach löschen Sie Kanal 2, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Kanäle löschen. Sicherzustellen, dass dieDurchschlagen korrigiert Akzeptorkanal bleibt der neue Kanal 2. Optional: Ändern Sie den Kanal Farbe von grau auf die ursprüngliche Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Grundfarbe und ändern Sie es in zB grün. </li></ol></li><li> Erstellen Sie einen neuen Kanal mit den folgenden Vorgang, um die relative FRET Koeffizienten zu bestimmen: Ch3 = CH 2 &#39;/ (Ch1 + Ch2&#39;) <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben ch2 ./ (ch1 + ch2) </li></ol></li><li> Für die richtige Visualisierung der FRET-Kanal in einem 8-Bit-Bild, erstellen Sie einen vierten Kanal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Gehen Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Channel-Arithmetik und geben Sie 255 * CH 3. Ändern Sie den Kanal Farbe, indem Sie auf Menü&gt; Bearbeiten&gt; Image-Eigenschaften. Wählen Sie Channel 4&gt; Mapped Farbe&gt; Farbtabelle Datei&gt; Jet. </li></ol></li><li> Tragen Sie eine 3x3 Medianfilter, um die Kanäle CH3 und CH4 that das Rauschen in den Bildern zu reduzieren. Um dies zu tun, Sie zu Menü&gt; Bildverarbeitung&gt; Glätten&gt; Median-Filter klicken. Wählen Sie beide Kanäle und einen Filter Größe &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Zur Quantifizierung von zellulären Signalen, erkennen die Zellen in Ch4 durch geeignetes Einstellen der Offset und filtern Sie die Strukturen durch Größe, um zu kleine Strukturen auszuschließen. <ol><li> Wählen Sie die Surpass-Ansicht und klicken Sie auf das Symbol &quot;Neue Oberflächen&quot;. Definieren Sie die Erkennungsalgorithmus Parameter in der Oberflächen Fenster. Für eine schnellere Verarbeitung, aktivieren Sie die beiden Checkboxen &quot;Segment nur eine Region of Interest&quot; und &quot;Prozess gesamte Bild endlich&quot;. Definieren Sie die Region von Interesse, indem Sie ihren Dimensionen. </li><li> Wählen Sie Channel 4 als Quellkanal und stellen Sie die Schwelle durch Thresholding&gt; Hintergrund Subtraktion (Local Contrast) und stellen Durchmesser bis 10 um. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle manuell auf 0 und die maximale Schwelle der maximalen intensiviertty. Filtern Sie die Strukturen durch Bereich und den Minimalwert auf zB 187 um². Beenden Sie die Oberflächenerfassung. </li></ol></li><li> Extrahieren der Mittelwerte für Donorfluoreszenzintensität (Ch1) und die relative FRET Koeffizienten (CH3) und ihre Standardabweichungen im zellularen Entität. Um dies zu tun, gehen Sie auf die Oberflächeneigenschaften. Ändern Sie das Aussehen der Strukturen durch Auswahl Surfaces Style / Qualität&gt; Surface. Wählen Sie alle Strukturen, indem Sie auf die Registerkarte Filter. Vereinheitlichen Sie die erfassten Strukturen, indem Sie auf Auswahl&gt; Unify verarbeiten. Exportieren Sie die Oberfläche Statistiken in MS Excel, indem Sie auf der Registerkarte Statistik&gt; Export Alle Statistiken in Datei. </li><li> Zeichnen Sie diese Werte im Laufe der Zeit. Identifizierung der 10 min-Intervall der maximalen Steigung der Spenderkanal Fluoreszenzzunahme für jede Bedingung als eine vernünftige Parameter, um die Menge an transloziert Effektor darzustellen. Berechnung der Steigung m = Δ Donorfluoreszenzintensität / Δ Zeit (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir hier erfolgreich angewendet ein TEM-1-beta-Lactamase-Reporter-basierten Assay für die quantitative Analyse von Effektorzellen Translokation von Y. enterocolitica. Viele verschiedene Variationen dieses empfindliche, spezifische und relativ einfache Technik, wurden in der Literatur beschrieben worden. In dieser Studie wurde der Laser Scanning Mikroskopie für die empfindlichsten und präzise Detektion von Fluoreszenzsignalen durchgeführt. Insbesondere die Korrektur für das Übersprechen zwischen d...

Typ III-Sekretion Systeme sind von verschiedenen spezialisierten Genera gram-negativer Bakterien, direkt liefern bakteriell kodierte Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen genutzt Protein-Export-Maschinen. Während die Sekretion Maschine selbst ist hoch konserviert, haben spezialisierte Gruppen von Effektorproteinen zwischen den verschiedenen Bakterienarten entwickelt, um Signale der Zelle verändern und erleichtern bestimmten bakteriellen Virulenz-Strategien ein. Im Falle von Yersinia, bis zu sieben Effektorproteine ​​sogenannte Yops (Yersinia äußeren Proteine), werden bei Wirtszelle Kontakt transloziert und wirken zusammen, um die Immunzellantworten, wie Phagozytose und die Cytokin-Produktion, dh wandern, um extrazelluläre Überleben der Bakterien erlauben 2-4. Der Prozess der Translokation ist eng in den verschiedenen Phasen 5 gesteuert. Es ist erwiesen, dass die primäre Aktivierung des T3SS durch seinen Kontakt mit dem Ziel ce ausgelöstll 6. Jedoch ist der genaue Mechanismus dieser Einleitung noch aufgeklärt werden. Yersinia in eine zweite Ebene von sogenannten Feinabstimmung der Translokation durch Aufwärts- oder Abwärtsregulierende Aktivität der zellulären Rho GTP-bindenden Proteinen Rac1 oder RhoA erreicht. Aktivierung von Rac1 zB durch Invasindomäne oder zytotoxische nekrotisierende Faktor Y (CNF-Y) führt zu einer erhöhten Translokation 7-9, während die GAP (GTPase-aktivierendes Protein) Funktion transloziert YopE herunterreguliert Rac1-Aktivität und dementsprechend verringert sich die Translokation durch eine negative Rückkopplung der Mechanismus 10,11. Gültig und präzise Methoden sind die Voraussetzung, um zu untersuchen, wie die Translokation bei Yersinia Wirtszellinteraktion wird geregelt. Viele verschiedene Systeme wurden für diesen Zweck mit spezifischen Vor- und Nachteile gelegt, wobei jeder. Einige Ansätze beruhen auf der Lyse von infizierten Zellen, nicht aber Bakterien durch verschiedene Reinigungsmittel, gefolgt von Western-Blot-Analyse. The gemeinsamer Nachteil dieser Verfahren ist, dass geringfügige, aber unvermeidliche Bakterienlyse potentiell verunreinigt das Zelllysat mit Bakterien-assoziierten Effektor-Proteine. Die Behandlung der Zellen mit Proteinase K, um extrazelluläre Effektorproteine ​​und die anschließende Verwendung von Digitonin zur selektiven Lyse der eukaryotischen Zellen abgebaut wurden vorgeschlagen, um dieses Problem zu 12 zu minimieren. Wichtig ist, dass diese Assays entscheidend davon abhängen, hochwertige Anti-Effektor-Antikörper, die größtenteils im Handel erhältlich sind es nicht. Versuche, translationale Fusionen Effektorproteine ​​und fluoreszierende Proteine ​​wie GFP verwenden, um die Translokation zu überwachen, waren nicht erfolgreich wahrscheinlich aufgrund der globularen Tertiärstruktur der fluoreszierenden Proteine ​​und der Unfähigkeit des Sekretionsapparates, sie vor Sekretion 13 entfalten. Doch verschiedene Reporter-Tags wie die cya (Calmodulin-abhängige Adenylatcyclase) Domäne des Bordetella pertussis Toxin cyclolysin 14 oder dem Flash-Tag wurden erfolgreich eingesetzt, um die Translokation zu analysieren. Im ersteren Assay die enzymatische Aktivität der cya wird verwendet, um das Signal des intrazellulären Fusionsprotein zu verstärken, während der Flash Tag, ein sehr kurzer Tetracysteinmotiv (4cys) Motiv-Tag ermöglicht die Kennzeichnung mit dem biarsenische Farbstoff Flash ohne den Prozess der Sekretion stören 15. Das hier angewandte Konzept wurde erstmals von Charpentier et al. Berichtet, und ist an der intrazellulären Umwandlung des Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Farbstoff CCF4 durch transloziert Effektor TEM-1-beta-Lactamase-Fusionen 16 (1A) auf der Basis. CCF4 / AM ist ein zelldurchdringenden Verbindung, in der ein Cumarin-Derivat (Donor) und eine Fluoresceingruppe (Akzeptor) werden durch ein Cephalosporin-Kerns verbunden ist. Beim passiven Eintritt in die eukaryotische Zelle, die nicht-fluoreszierende verestert CCF4 / AM-Verbindung durch zelluläre Esterasen zu der geladenen und fluoreszierende CCF4 verarbeitet und dadurch gefangeninnerhalb der Zelle. Anregung der Kumarin-Gruppe bei 405 nm ergibt FRET an die Fluoresceingruppe, die ein grünes Fluoreszenzsignal bei 530 nm emittiert. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern durch die Beta-Lactamase FRET gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission at460 nm. Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, beispielsweise wurde die Technik in einem Mausinfektionsmodell verwendet, um die Leukozyten-Populationen für die Translokation in vivo 17-19 gezielte identifizieren. Auslesen der Signale kann mit Plattenlesegeräte, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Zu beachten ist, sieht das Verfahren auch die Möglichkeit, Translokation in Echtzeit Live-Zell-Mikroskopie während des Infektionsprozesses 20,21 überwachen. Hier wurde Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie für readou angewendett von Fluoreszenzsignalen da sie die höchste Empfindlichkeit und Genauigkeit. Insbesondere die Möglichkeit der Emissionsfenster mit Nanometer-Präzision in Kombination mit hochempfindlichen Detektoren erleichtert optimierte Fluoreszenzdetektion und minimiert ein Übersprechen zu justieren. Zusätzlich kann diese Einrichtung für die Mikroskopie eine Echtzeitüberwachung der Translokation angepasst werden und potenziell ermöglicht die gleichzeitige Analyse von Wirt-Pathogen-Interaktion auf zellulärer Ebene. In dieser Studie Translokationsgeschwindigkeiten eines Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm und eine YopE Deletionsmutante die eine hypertranslocator Phänotyp 10,11 wurden exemplarisch analysiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Viele gramnegative Bakterien einschließlich pathogenen Yersinia spp. Beschäftigen Typ III-Sekretion Systeme Effektorproteinen in eukaryontische Zielzellen zu translozieren. Im Inneren der Wirtszelle die Effektor-Proteine ​​zu manipulieren zellulären Funktionen zum Vorteil der Bakterien. Um die Kontrolle des Typ III-Sekretion während der Host-Zell-Interaktion, empfindliche und genaue Tests besser zu verstehen, um die Translokation zu messen sind erforderlich. Wir beschreiben hier die Anwendung eines Assays auf der Basis der Fusion einer Yersinia enterocolitica Effektorprotein Fragment (Yersinia Außen Protein; YopE). TEM-1-Beta-Lactamase für eine quantitative Analyse der Translokation Der Assay beruht auf der Spaltung einer Zelle permeant FRET-Farbstoff (CCF4 / AM) durch transloziert Beta-Lactamase-Fusion. Nach der Spaltung des Cephalosporins Kern CCF4 durch die Beta-Lactamase, FRET von Cumarin zu Fluorescein ist gestört und Anregung der Kumarin-Gruppe führt zu blauen Fluoreszenzemission.Verschiedene Anwendungen dieses Verfahrens sind in der Literatur Hervorhebung ihrer Vielseitigkeit beschrieben. Das Verfahren erlaubt die Analyse der Translokation in vitro als auch in vivo, zB in einem Maus-Modell. Detektion der Fluoreszenzsignale kann unter Verwendung von Plattenleser, FACS-Analyse oder Fluoreszenzmikroskopie werden. In der hier von verschiedenen Yersinia Mutanten beschrieben, in vitro Translokation von Effektor-Fusionen in HeLa-Zellen-Setup wird durch Laser Scanning Mikroskopie überwacht. Aufzeichnung intrazellulären Umwandlung des FRET-Reporter durch die Beta-Lactamase-Effektor-Fusion in Echtzeit bietet robuste quantitative Ergebnisse. Wir zeigen hier beispielhafte Daten, was zeigt, erhöhte Translokation von einem Y. enterocolitica YopE Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.

Um die Leistungsfähigkeit des beschriebenen Verfahrens zeigen, um quantitativ zu analysieren Effektor Translokation in Zielzellen wurden zwei Yersinia-Stämmen mit unterschiedlichen Translokation Kinetik untersucht: Y. enterocolitica Wildtyp-Stamm WA-314 (Serogruppe O8, beherbergen die Virulenzplasmid pYVO8 22) und seine Ableitung WA-314ΔYopE (WA-314 beherbergt pYVO8ΔYopE 23). Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Y. enterocolitica Mutanten ohne funktionelle YopE eine ...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse von<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effektor Translokation in Wirtszellen unter Verwendung Beta-Lactamase-Effektor-Fusionen

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K Aufrufe.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Serie: Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening für Host beteiligten Faktoren in Vaccinia Virus-Infektion mit Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

Nachweis von Toxin Translokation in den Host-Cytosol von Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

In vitro-Test, um die Auswirkungen von immun Pathways auf die HIV-spezifischen CD4 T-Zell-Effektor-Funktion auswerten

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Anwenden von Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) zu untersuchen Effektor Translokation Effizienz durch<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Während siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Ein chronisches Autoimmun-Trockenaugen-Rattenmodell mit Zunahme im Effekt-Speicher T-Zellen in Augapfel-Gewebe

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Eine Methode zur Bewertung von Fc-vermittelten Effektor-Funktionen durch Influenza Hämagglutinin spezifische Antikörper induziert

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.