著者は、2010年から2014年春学期の間、私のトランスポゾン突然変異誘発のアイデアをテストし、私の微生物生理学大学院生の私の学部独立研究生のすべてとすべてに感謝したいと思います。この作品は、ヤングズタウン州立大学の生物科学専攻によって資金を供給された。

コンピテントセル5,11の1.エレクトロポレーション<ol><li> エンテロバクター属のO / NのLB培養を希釈する。 YSU新鮮なLB培地50mlに1/20と0.4と0.6との間のOD（600 nm）に120rpmで、30℃で振盪しながら成長する。必要に応じて、それらの最適な成長温度で、他の細菌株を成長させる。 </li><li> 5分間の遠心分離を4℃で5分間7,000×gで氷上で細胞を冷やす。 </li><li> 、上清を捨て、4℃で滅菌氷冷水および遠心分離機50ml中の細胞を再懸濁し、5分間7000×gで。この手順を繰り返します。 </li><li>上清を捨て、細胞ペレットの体積に等しい氷冷水の量で細胞を懸濁します。長期保存のため、-80℃、融解氷冷10％（v / v）グリセロール、店舗の等しいペレット体積の氷冷10％（v / v）グリセロール、再懸濁し、10 mlの細胞を洗浄エレクトロポレーションの前に氷の上。 </li><li> 40μlにトランスポの0.5​​μlを添加する細胞。市販のトランスポ液/μlの0.33μgのDNAの濃度で供給される。 0.33μgのが推奨されていますが、0.165μgのDNAが十分です。 </li><li>氷冷、0.2ミリメートル、エレ​​クトロポレーションキュベット中の細胞/トランスポ混合物を配置し、キュベットの底に混合物をタップします。 25μF、200Ω、および2.5 kVので細胞に衝撃を与える。細胞は冷やし残ることを保証するために、使用前に-20℃の冷凍庫でエレクトロポレーションキュベットを格納します。 </li><li>すぐに、カタボライト抑制（SOC）媒体とスーパーの最適な培養液を滅菌フィルターの960μlを添加する。上下にピペッティングして混合し、滅菌1.5mlマイクロチューブに細胞を移す。 注：細胞がショック後に死に始めるが、SOC培地中の塩は、それらを回復することができます。節約するためには、トランスポを追加したり、陰性対照細胞を衝撃する必要はない。ちょうどそれに無菌のSOC培地960μlを添加する。 </li><li> 30℃fで細胞をインキュベートまたは120rpmで振盪しながら45〜60分。これは、ホストゲノムと、細胞は、カナマイシン耐性を表現するために再結合するトランスポのための時間を提供します。 </li><li> LB-館寒天プレート上に細胞100μlを広げて、30℃でプレートO / Nインキュベートする。 4℃の冷蔵庫内の残りの形質転換混合物を保管してください。必要であれば、最初のエレクトロポレーション後2週間に後日アップ時の追加金額を広める。 </li></ol>形質転換体の2グリッディング<ol><li>空の100×15 mmのペトリ皿の蓋にテープグリッドを。 「細菌遺伝学におけるショートコース&quot;12からグリッドをコピーします。 </li><li> LB-館寒天プレートの底面に線を引きます。グリッドが寒天を通して見えるようにグリッド蓋に固着させるために、テープの小片を使用してください。プレートの底上の線がグリッドの上、中央に整列されていることを確認。テープでプレートを固定することはあってもグリッド化を可能にし、滑りからそれを保つ。ラインは、レプリカめっき後のコロニーの識別を容易にします。 </li><li>無菌のつまようじを持つ単一の形質転換体を選択し、グリッド内の正方形の中心でそれを見つける。ただコロニーとスポットをタッチします。寒天につまようじを掘るしないでください。プレートを汚染回避するために、一端のみで爪楊枝を扱う。 </li><li>ステップ2.3のように隣接する広場で別の形質転換体を発見。板が一杯になると、30℃でO / Nをインキュベートする。これは、マスタープレートである。 </li></ol>栄養要求性表現型12を決定するために3.レプリカメッキ<ol><li> LB-館のためのM-9館のためのLB-館のための1、2および3：グリッド化された各プレートについて、1から3の番号3の新鮮な寒天プレートのスタックを作る。使用前に37℃で、逆さまに、O / Nでプレートを乾かします。 </li><li>ステップ2.2のように各プレートの上に線を引きます。 </li><li> 70％エタノールでレプリカ平板ツールを拭き、にレプリカ平板の上に無菌の別珍の正方形を配置オール及び別珍の正方形を取り締まる。手がさえ、それらを洗浄した後に微生物が生息している。その縁によって別珍の正方形を処理することにより、夾雑微生物の導入を防止。 </li><li>クランプに描かれた線とマスタープレート上のラインを合わせ、別珍の正方形の上にプレートを置く。別珍の正方形にプレートから細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。細菌を塗抹しないように注意してください。別珍広場からマスタープレートを外します。 </li><li>クランプ上のラインとプレートの番号1上に引かれた線の位置を合わせ、別珍の正方形の上に置きます。プレートに別珍の正方形から細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。プレート番号1を削除してください。 </li><li>水のビーカーに別珍の正方形を破棄し、ステップ3.3のようにレプリカプレーティングツール上でクリーン、無菌の別珍の正方形を配置します。このステップでは、画期的な成長と偽陽性の結果を引き起こす過剰接種を防ぐことができます。 </li><li>整列するクランプ上のラインとプレートの番号1上のラインと新別珍の正方形の上に置きます。別珍の正方形にプレート番号1から細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。プレート番号1を削除してください。 </li><li>クランプ上のラインとプレートの番号2に描かれたラインの位置を合わせ、別珍の正方形の上に置きます。プレート番号2に別珍の正方形から細菌を転送するために穏やかな圧力を適用します。プレート番号2を削除します。 </li><li>プレート番号3を繰り返しステップ3.8第3プレートは、他の二つのプレートのマスタープレートからの完全な転送のための制御である。水のビーカーに別珍の正方形を破棄。 、それらを乾燥、それらを洗ってアルミホイルでラップし、それらを再オートクレーブ、汚染された別珍の正方形を含むビーカーをオートクレーブ、別珍の正方形を再利用するには。 </li><li> 30°CO / Nでプレートをインキュベートする。両方LB館寒天プレート上で増殖するが、M-9館プレート上で増殖しなかったコロニーを栄養要求（あると考えられている<st栄&gt;図2）。 </li><li>ストリーク外の新鮮なLB-館寒天プレート上にプレート番号1から栄養要求を、30°CO / Nでプレートをインキュベートする。 </li><li>単離するためのストリーク外の新鮮なLB-館プレート上にステップ3.11においてストリークプレートから3コロニー。 30°CO / Nでプレートをインキュベートする。これは、変異体がよく絶縁されていることを保証します。一つのセクションで各コロニーから3分の連勝にプレートを分割。 </li><li>ステップ2.1から2.4のように、グリッドを形成するために、新鮮なLB-館プレートにステップ3.12から派生画線コロニーからのスポットコロニー。各変異体を三重に再テストされている。 </li><li>栄養要求の表現型を確認するためのステップ3.1から3.10のように、再びプレートを複製。 </li></ol> 4.遺伝子レスキュー<ol><li> 30℃で液体LB館培地でステップ3.13から単離された変異コロニーの3ミリリットルO / N培養を成長。市販のゲノムDNA精製キットを用いて培養液1mlからゲノムDNAを精製する。 </li><li> 0.025 Uの混合物をセットアップするBFU CI制限エンドヌクレアーゼ及び氷上で20μlの反応中/μlのゲノムDNAの1μgの14μlの。 BFU CIは12の異なる部位にトランスポゾンを切断するので、制限エンドヌクレアーゼ、BFA Iまたはそれぞれ二つの3つの異なる部位でトランスポゾンを切断するのHaeIIIを使用することがより効率的である。 </li><li> 25分間37℃で反応をインキュベートし、次に80℃で20分間、酵素を不活性化する。 0.8％アガロースゲル（ 図3）上で部分的に消化されたDNAの3μLを分析します。ゲルの底部まで10キロバイト上から塗抹標本で成功した部分的な消化の結果。 </li><li> 500μlの反応でT4 DNAリガーゼ800単位を使用して部分的に消化されたゲノムDNAを15μlを連結。反応のO / Nにおける4℃をインキュベートする。大きい反応容量は、それ自体、単一の断片のライゲーションを最大化し、二つ以上のDNA断片間の相互作用を最小化する。 </li><li> Precipitateの3 M酢酸ナトリウム、pH 5.5、1mlの95％エタノールを50μl添加し、20分間-20℃でインキュベートすることによって連結されたDNA。 </li><li> 、70％のエタノールでペレットを洗浄、10分間、4℃でDNA及び13500×gでの遠心フュージ真空濃縮器でそれを乾燥させ、およびヌクレアーゼを含まない水10μlにそれを再懸濁します。あるいは、DNAは、空気は、室温で15分間乾燥させることができる。 </li><li> Eを変換するために再懸濁させたDNA4μlのを使用してください部1 R6Kγ複製起点のようにエレクトロポレーションにより大腸菌菌株ECD100DのPIRまたはECD100Dのたpir116は 6を複製するpir遺伝子を持つ細菌菌株を必要とします。低コピープラスミドにおける菌株pir結果、およびたpir116株は高コピープラスミド結果のpir変異遺伝子が含まれています。各形質転換体は、トランスポゾンと、中断染色体（ 図1E）の領域で新たなプラスミドが含まれています。 </li><li> Inocul単一コロニーを含むLB館培地5mlを食べ、120 rpmで37℃で振盪しながらO / Nを成長し、市販のキットを使用して全体のO / N培養物からプラスミドDNAを精製する。 </li><li>制限エンドヌクレアーゼのXho Iを用いてプラスミド14μlのダイジェスト反応の最終容量を20μlのあることを確認します。この酵素は、カナマイシン耐性遺伝子の5 &#39;末端におけるトランスポゾンの中央に部位を認識する。未消化10μlのを分析し、0.8％アガロースゲル（ 図3）上でプラスミドを消化し ​​た。プラスミドは、2キロバイトトランスポゾンプラスに隣接する宿主DNAから構成されています。 </li></ol> 5. DNAシーケンシング<ol><li>市販のシークエンスキット、トランスポゾンの各末端に相同なプライマー、およびキャピラリーシークエンシング解析システムを用いてプラスミドを配列決定する。代わりに、プラスミドは、シークエンシングのために外部機関に出荷される場合があります。 </li><li>分子量標準（1キロバイトラダー）でを使用してくださいゲルは、プラスミドの大きさを推定する。その後、50 fmolのために必要とされるプラスミドのナノグラム（ng）を数を推定。 </li><li> 260nmの（260）および280nm（A 280）の波長で分光光度計を用いてプラスミドDNAの濃度を測定する。キュベットを通る光路長を確保することは1cmである。 50 ng /μLで260 nmの吸光度を乗じて濃度を決定する。高品質のプラスミドDNAは、1.8と2.0の間で、A 260 / A 280比を持つことになります。 </li><li>各配列決定反応のために必要なDNAの量は、プラスミドの濃度で割っ50 fmolのために必要とngの数である。 10μlに全量をもたらすために水で必要なプラスミドの量を混ぜる。 </li><li> 1分間96℃、プラスミドDNA /水の混合物を加熱し、次いでRTに冷却する。 </li><li>シーケンシングキットからマスターミックス8μlのを追加し、配列決定プライマーの1の1.6μMの2μlの。 </li><li> FOLサーマルサイクラープログラムと反応クリーンアップのためのシーケンシングキットからの低プロトコル。 </li><li>キャピラリーDNA解析システムを用いて、各サンプルの分析。 </li><li> DNA配列を表示するには、市販のソフトウェアパッケージを使用してください。トランスポゾン（ 図4）の最後の7塩基対である配列を、「5&#39;-GAGACAG-3 &#39;、」を検索してください。この7 bpのセグメントの5 &#39;末端の前にシーケンスをトランスポゾンに属します。この7 bpのセグメントの3 &#39;末端の後にシーケンスが中断された遺伝子に属します。 </li><li>基本的なローカル配列検索ツール（BLAST）7,8を使用して中断された遺伝子の可能な機能を決定する。以下を使用link: <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch" target="_b;ank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&amp;BLAST_PROGRAMS=megaBlast&amp;PAGE_TYPE=BlastSearch</a> .割り込みのシーケンスを貼り付けクエリボックスにED遺伝子は、データベースの「その他」を選択し、ページの下部にある「BLAST」をクリックしてください。結果が表示されたら、アライメント結果（ 図5）を表示するには、ページを下にスクロールします。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

トランスポを使用したトランスポゾン突然変異誘発は、 エンテロバクター属に栄養要求株を生成するための効率的なツールです。 YSU及びグラム陰性菌およびグラム陽性菌3,4の他のタイプ。プロセスは、エレクトロポレーションによって宿主へのTn 5由来のトランスポを導入することにより開始した。挿入物を有するコロニーを同定するために、形質転換されていない標?...

栄養細菌は、培地中の生合成1は 、アミノ酸、核酸、ビタミンのような前駆体を生成するために、中心炭素代謝の経路を介してグルコースに変換し、グルコース（M-9培地）を含有するM-9最小塩で成長する。 M-9培地は、炭素源およびエネルギー源としての硫黄源、およびグルコースなどの緩衝液およびリン源としての窒素源、ナトリウム、カリウム、リン酸アンモニウム、塩化マグネシウム、硫酸を含んでいる。ルリア - ベルターニ（LB）培地トリプトンからビタミン及び酵母抽出物からの成長因子のアミノ酸が豊富である。これは、M-9培地上で生育に必要なアミノ酸、ビタミンおよび他の成長因子を合成することができない栄養要求株の増殖を支持する。栄養要求株は、M-9培地中でLB培地ではなく、成長するのに対し、このようにして、原栄養は、LBとM-9培地中で成長します。細菌の栄養集団に変異を導入し、栄養要求性表現型を引き起こす変異した遺伝子を同定することにより、経口であるバクテリア株中での代謝の理解を得るためにssible。 トランスポゾン突然変異誘発は、M-9培地中のグルコース上での増殖に必要な遺伝子の多くを同定するために用いることができる。トランスポゾンは宿主ゲノム2に無作為に自分自身を挿入します。 M-9培地寒天プレート上にLB寒天プレートおよびそのめっきレプリカ上のトランスポゾン形質転換体をスポットすることにより、栄養要求株をスクリーニングすることが可能である。中断の遺伝子は、遺伝子の救助を介して同定されている。この研究は、市販のTn 5はトランスポゼース蛋白質と混合線形トランスポゾンDNAセグメントのソリューションとして出荷されているトランスポを由来使用しています。 DNAセグメントは、トランスポザーゼ遺伝子を欠くが、カナマイシン耐性遺伝子、R6Kγ複製起点とセグメント3,4の各端に結合トランスポザーゼのためのDNA配列である2モザイクモチーフを含む。トランスポザーゼタンパク質は、DNA、単独のDNAセグメントに直接添加されているのでトランスポゾンとして定義され、DNA /トランスポザーゼタンパク質複合体は、トランスポとして定義される。トランスポはカナマイシン感受性ホスト（ 図1A）にエレクトロ5によって変換される。カナマイシン（LB館）を含有するLB寒天プレート上で増殖したコロニーを、カナマイシン（M-9館）栄養要求株であるを含むM-9培地寒天プレート上で増殖しなかっトランスポゾン挿入（ 図1B）、レプリカプレーティングし、形質転換体（Figireを持つ図1C）。変異体からのゲノムDNAを精製し、部分的に、4塩基切断制限エンドヌクレアーゼ、BFU CI（ 図1D）を用いて消化される。連結したDNAはそれはpir遺伝子 （ 図1E）を含有する大腸菌（E. coli）株に形質転換する。この遺伝子は、新たなプラスミド、トランスポゾンを含有するE.において複製する宿主の染色体領域に隣接することができ大腸菌 6。カナマイシン耐性遺伝子は、として機能新しいプラスミドについてelectableマーカー。最後に、中断された遺伝子の同一性を決定するために使用されるトランスポゾンおよび得られた配列の基本ローカルアラインメント検索ツール（BLAST）分析7,8の各端部に相補的なプライマーを用いて配列決定する。 このトランスポ突然変異誘発戦略は3つの利点3を提供しています。トランスポゼース蛋白質がトランスポゾンに直接結合されているのでまず、挿入は宿主内のトランスポザーゼ遺伝子の発現に依存しません。トランスポゾンは、宿主ゲノム中にそれ自体を組み込むと、トランスポザーゼはトランスポゾンのさらなる移動を防止する、分解される。ホストは、内因性のTn 5 transpositional要素を有している場合は、追加の動きを防止することができない。第二に、エレクトロポレーションによってトランスポの導入は、多種多様な宿主で使用することが可能となる。また、細菌接合によりやviによってトランスポゾンを導入する必要がなくなりRAL感染。両方のプロセスは、ホストの感受性を必要とする。第三に、カナマイシン耐性遺伝子およびトランスポでR6Kγ複製起点を含めることは、簡単に中断された遺伝子を同定することを可能にする。トランスポゾン中断領域が格納され、遺伝子同定のための逆ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を使用する必要がなくなり、プラスミドのように配列決定することができる。 このビデオで提示プロトコルは、 エンテロバクター属のトランスポゾン突然変異誘発のための各ステップを説明しています。それが中断された推定遺伝子の同定に細菌細胞への導入からトランスポを使っYSU 9。以前に公開されたプロトコル-3,4,10-に加えて、栄養要求株をスクリーニングするために、レプリカ平板法を使用するための詳細な方法が提示される。この変異誘発技術は、identのために、細菌の異なるタイプ、例えば抗生物質や金属抵抗など他の表現型を調査するために使用することができる合成生物学研究における定義された培養条件下で増殖に必要な遺伝子の数を最小限に抑えifying、または遺伝学の実験用コンポーネントまたは微生物生理学コースを教えるために。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="707">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">EZ-Tn5 R6K&#947;ori/KAN-2 Tnp Transposome Kit</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">TSM08KR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir+ Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">ECP09500</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a low copy number</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:145px;">Epicentre (Illumina)</td>
			<td style="width:119px;">EC6P095H</td>
			<td style="width:227px;">Capable of replicating plasmids with an R6K&#947; replication origin at a high copy number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5X M-9 Salts</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">DF048517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lennox LB Broth</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1427-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agar</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J637-1KG</td>
			<td style="width:227px;">Solid media contained 1.6% (w/v) agar</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Kanamycin Sulfate&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0408-25G</td>
			<td style="width:227px;">When required, media contained 50 &#956;g/ml kanamycin sulfate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">D-Glucose Monohydrate</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">0643-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast Extract</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J850-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptone</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">J859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4504-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X190-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgSO2</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP213-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:227px;">0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BfuC I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0636S</td>
			<td>Partial digestion of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xho I</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0146S</td>
			<td>Plasmid digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nuclease Free Water</td>
			<td style="width:145px;">Amresco, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">E476-1L</td>
			<td style="width:227px;">For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GenomeLab DTCS - Quick Start Kit</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">608120</td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Genomic DNA Purification Kit</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1120A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td style="width:145px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1460</td>
			<td>Plasmid purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Replica Plating Block</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Velveteen Squares</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">09-718-2</td>
			<td>Replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PetriStickers</td>
			<td style="width:145px;">Diversified Biotech</td>
			<td style="width:119px;">PSTK-1100</td>
			<td>Grid for replica plating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Pulser II</td>
			<td style="width:145px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Electroporation Cuvettes &#8211; 2 mm</td>
			<td style="width:145px;">BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">E-5010-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CentriVap DNA Vacuum Concentrator</td>
			<td style="width:145px;">Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970010</td>
			<td>Drying DNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CEQ 2000XL DNA Analysis System</td>
			<td style="width:145px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NTI Advance 11.5.0</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12605099</td>
			<td>DNA sequence analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of enterobacter sp. ysu auxotrophs using transposon mutagenesis

栄養細菌は、炭素及びエネルギー源として使用される培地グルコース（M-9培地）を補充したM-9最小塩、上で成長する。栄養要求株は、トランスポを用いて生成することができる。このプロトコルで使用される市販のTn 5由来のトランスポはR6Kγ複製起点を含むDNAの線形セグメント、カナマイシン耐性遺伝子から成る二つのモザイク配列は、トランスポザーゼ結合部位として機能する、終了する。 DNA /トランスポザーゼタンパク質複合体として提供されるトランスポは、原栄養株、 エンテロバクター属にエレクトロポレーションによって導入される。 YSUし、無作為に、このホストのゲノムに自身を内蔵しています。形質転換体をカナマイシン（LB-館）を含む寒天プレートルリア - ベルターニ上にプレートレプリカとカナマイシン（M-9館）を含むM-9培地寒天プレート上にある。 M-9館プレート上LB-館プレート上で増殖ではなく、形質転換体は、栄養要求株であると考えられている。精製したゲノム栄養要求株からのDNAを部分的に消化されたライゲーションおよびpir +大腸菌（E. coli）株に形質転換する。 R6Kγ複製起点は、プラスミドがPIR + E.内で複製することができますcoli株 、およびカナマイシン耐性マーカープラスミドの選択を可能にする。各形質転換体は、中断された染色体領域により隣接トランスポゾンを含む新たなプラスミドを保有する。サンガー配列決定および基本的なローカル配列検索ツール（BLAST）が中断された遺伝子の推定アイデンティティを示唆している。このトランスポ突然変異誘発戦略を使用して、3つの利点がある。まず、ホストによってトランスポザーゼ遺伝子の発現に依存しない。第二に、トランスポはエレクトロポレーションによってではなく、コンジュゲーションによって、または形質導入によって、標的宿主に導入されるため、より効率的である。第三に、R6Kγ複製起点は、それが簡単に突然変異したグラムを同定することを可能にする部分的組み換えプラスミドにおいて回収されるエン。この技術は、 エンテロバクター属の他の特性に関与する遺伝子を調べるために使用することができる。 YSUまたは細菌株の幅広い種類の。

エンテロバクター属の形質転換。トランスポとのエレクトロポレーションによるYSUは、宿主ゲノム（ 図1A、B）にランダムゲノム挿入を開始した。成功したエレクトロポレーションは、LB-館のプレート上で増殖した数千の形質転換体が得られた。 300-400を得るためには、プレートあたりコロニーをよく間隔、各LB-館寒天プレート上で形質転換混合物スプレッドの量が最適化?...

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Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定される。

の世代<em&gt;エンテロバクター</em&gt;エスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

13.8K ビュー.  Youngstown State University.  エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定さ?...

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNAを含むオリゴヌクレオチドを​​使用して変換によるゲノムDNAのRNA / DNAハイブリッドの世代

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

異種哺乳動物細胞で発現したイオンチャネルの変異導入と機能解析

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

ワームの研究室の紹介：培養ワームから変異へ

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

内タンパク質の定方向進化のための変異導入と機能選択プロトコル E.大腸菌</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

高解像度メルト解析を用いたPCRを使用して、迅速かつ効率的なゼブラフィッシュ遺伝子型決定

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

ハイスループットシーケンシングを利用し全体プロテイン飽和突然変異誘発ライブラリの機能評価のためのプロトコル

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...