We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. pic d&#39;émission et de la Croix-talk Détermination (voir également la figure 2) <ol><li> Afin de déterminer les pics d&#39;émission et le montant de la diaphonie entre le donneur (coumarine dérivé V450) et l&#39;accepteur (fluorescéine) colorants, effectuer des analyses spectrales de cellules marquées par deux fluorophores individuelles à 405 nm excitation. </li><li> Déterminer une largeur de bande de 10 nm à l&#39;intérieur de la pointe de chaque colorant qui sera utilisée pour les canaux de donneur et d&#39;accepteur (455 à 465 nm et ici de 525 à 535 nm). Tracer l&#39;intensité normalisée plus la longueur d&#39;onde et calculer le pourcentage moyen de diaphonie du donneur de colorant dans le canal de l&#39;accepteur et vice versa (Figure 2). </li></ol> 2. Préparation de Y. enterocolitica souches pour la culture cellulaire Infection <ol><li> Utilisez les souches suivantes: WA-314-pMK ovules (WA-314 transformé avec les plasmides pMK-bla 17 et PMK-ovules 17, respectivement) et WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformé avec le plasmide pMK-bla 17) </li><li> Au moins deux jours avant l&#39;infection série Y. enterocolitica souches WA-314 pMK-ovules, WA-314 pMK-bla et WA-314ΔE pMK-bla de cryo des stocks sur des plaques d&#39;agar-LB contenant les antibiotiques nécessaires (kanamycine pour WA-314 pMK-bla et WA-314 pMK-ova ; kanamycine et la tétracycline pour WA-314ΔE pMK-bla) et de grandir O / N à 27 ° C. Garder ensuite les plaques pendant jusqu&#39;à une semaine à 4 ° C. </li><li> Un jour avant l&#39;infection inoculer 3 ml de milieu LB contenant les antibiotiques nécessaires avec une colonie des souches respectives et incuber O / N à 27 ° C dans un agitateur à 180 rpm. </li><li> Le jour de l&#39;infection inoculer 2 ml de la culture O / N dans 40 ml de milieu LB frais sans antibiotiques et incuber pendant 90 min à 37 ° C dans un agitateur à 180 tours par minute pour induire l&#39;expression du système de sécrétion de type III. </li><li> Transférer les cultures dans un tube approprié et garder les cultures sur de la glace ou à 4 ° Cà partir de maintenant. Centrifuger les cultures pendant 10 min à 5000 xg et 4 ° C. </li><li> Reprendre le culot bactérien dans 2-3 ml de PBS glacé. Diluer la suspension bactérienne à une concentration de 8 x 10 8 cfu / ml en utilisant un spectrophotomètre. Déterminer la densité optique correspondant individuellement. Gardez cette suspension sur la glace jusqu&#39;à ce que l&#39;infection des cellules HeLa. </li></ol> 3. Les cellules HeLa Placage <ol><li> Un jour avant la graine de l&#39;infection de 1,5 x 10 4 cellules des cellules HeLa dans du DMEM 200 ul contenant inactivé sérum de veau foetal 10% de la chaleur (FCS) dans les puits d&#39;une plaque de 96 puits et de cultiver dans un incubateur à CO 2 de 5% à 37 ° C. Ensemencer trois puits pour chaque souche (trois temps d&#39;incubation différents). </li></ol> 4. Infection des cellules HeLa et chargement avec CCF4 <ol><li> Infecter des cellules HeLa en ajoutant 3,5 ul de la suspension bactérienne dans le milieu et le mélanger doucement par pipetage du milieu deux fois. Permettre aux bactéries de sédimentspour les cellules à une MOI (fragment d&#39;infection) d&#39;environ 100 bactéries par cellule. Pour un cours de temps de démarrage infections à -90 min -60 min -30 min et et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% jusqu&#39;à 0 min pour atteindre un point final commun. </li><li> Quand l&#39;incubation est terminée, aspirer soigneusement le moyen sans enlever les cellules HeLa et ajouter 50 pi de PBS contenant 20 pg / ml de chloramphenicol pour arrêter l&#39;expression des effecteurs et 2,5 mM de probénécide pour réduire l&#39;exportation de CCF4. </li><li> A ce point de transférer la plaque de 96 puits dans la platine du microscope et de définir des points appropriés pour une analyse ultérieure dans chaque puits. Terminer cette étape en 10 min (pour plus de détails de l&#39;acquisition voir rubrique 5.1). </li><li> Par puits, ajouter 70 pi de solution CCF4 / AM de chargement (solution 0,24 pi A, 1,2 ul solution B, 18,56 ul solution C (solution A, B, et C fourni dans le kit / AM de chargement CCF4) et 50 pi de PBS (contenant 20 ug / ml de chloramphenicol et 2,5 mM de probénécide) à l&#39;aide d&#39;un multiple pipette et incuber pendant 5 min à température ambiante. A partir de maintenant sur le travail sans interruption. </li><li> Aspirer la solution de charge et ajouter 100 ul de PBS contenant 20 ug / ml de chloramphenicol et 2,5 mM de probénécide en utilisant une pipette multiple. Puis transférer rapidement la plaque à 96 puits dans la platine du microscope et de démarrer l&#39;acquisition à 10 min de l&#39;aspiration de la solution de chargement. </li></ol> 5. balayage laser et analyse des données <ol><li> L&#39;acquisition des images <ol><li> Définissez les conditions d&#39;imagerie de manière à maximiser le nombre de photons totale et de réduire la phototoxicité, photoblanchiment et de contre-excitation. <ol><li> Dans un laser microscope confocal à balayage moderne, utiliser un objectif ambitieux de l&#39;ouverture d&#39;immersion numérique 20X, ouvrir le trou de détection à 2,5 unités Airy (c.-à-large sectionnement optique), choisissez haute sensibilité GaAsP-détecteurs avec donneur et accepteur canaux actifs simultanément, profondeur de 8 bits , ~ 750 nm taille de pixel, 3 fois trame moyenne et EXCITe avec 10% d&#39;une diode laser à 405 nm. </li><li> Pour assurer la bonne quantification régler le gain du détecteur des deux canaux sur la même valeur et d&#39;éviter toute pixels saturés. Remarque: Ici, les gains ont été fixés à 150%. </li></ol></li><li> Assurer une immersion continue par diffusion milieu d&#39;immersion au fond des puits, par exemple avec une seringue de 1 ml, et d&#39;éviter le piégeage de bulles d&#39;air. </li><li> Activer la lumière transmise et de trouver un champ de vue représentatif dans chaque puits. Utilisez une étape automatique correctement calibré et marquer la position dans le logiciel. </li><li> Après le retrait de la plaque pour la coloration (voir rubrique 4.3), remettre la plaque et ajouter un poids sur le dessus pour éviter la dérive focale. Passez en revue les positions enregistrées avec le mode de balayage laser et la mise au point et la position latérale correctement. </li><li> Régler le laps de temps de 2 min, la durée de 2 heures et commencer à l&#39;acquisition. </li></ol></li><li> Image quantification (exemples seront donnés pour Bitplane Logicielssont tels que Imaris) <ol><li> Importer l&#39;ensemble de données dans un logiciel qui permet des calculs arithmétiques de matrices de pixels. Pour ce faire, par glisser-déposer le fichier source contenant à la fois le donneur et le canal de l&#39;accepteur sur l&#39;icône du logiciel. </li><li> Soustraire le fond dans les deux canaux en utilisant le même décalage. Pour ce faire, cliquez sur Menu, puis cliquez sur Image&gt; Traitement&gt; Baseline soustraction. Sélectionnez chaque canal et entrez la valeur de référence. </li><li> Corrigez la purge par le biais du canal des bailleurs de fonds (K1) dans le canal de l&#39;accepteur (CH2) avec le facteur de correction f pré-déterminé (voir 1.1), la création d&#39;une nouvelle chaîne: Ch2 &#39;= CH2 - K1 * f REMARQUE: une purge par de l&#39;accepteur dans le canal de donneur était non détectable sur le niveau de bruit. <ol><li> Cliquez sur Menu&gt; Traitement d&#39;image&gt; Canal Arithmétique et entrez abs (CH2- (CH1 * 0,33)). Ensuite supprimer Channel 2 en cliquant sur Menu&gt; Modifier&gt; Supprimer des chaînes. Veiller à ce que lasaigner à travers le canal-accepteur corrigée reste comme le nouveau canal 2. Facultatif: Changez la couleur de canal du gris à la couleur originale en allant à Menu&gt; Édition&gt; Propriétés de l&#39;image. Sélectionnez Channel 4&gt; mappé Couleur&gt; Couleur de base et changer pour par exemple, vert. </li></ol></li><li> Créer une nouvelle chaîne avec l&#39;opération suivante pour déterminer le coefficient relatif FRET: Ch3 = CH2 &#39;/ (Ch1 + Ch2&#39;) <ol><li> Allez dans Menu&gt; Image Processing&gt; Canal Arithmétique et entrez CH2 ./ (CH1 + CH2) </li></ol></li><li> Pour visualisation correcte du canal FRET dans une image de 8 bits, de créer un quatrième canal: CH4 = 255 * Ch3 <ol><li> Allez dans Menu&gt; Image Processing&gt; Canal Arithmétique et entrez 255 * CH3. Changez la couleur de canal en allant à Menu&gt; Propriétés Modifier&gt; Image. Sélectionnez Channel 4&gt; fichier mappé Table Couleur&gt; Couleur&gt; Jet. </li></ol></li><li> Appliquer un filtre médian 3x3 aux canaux CH3 et CH4 that permettra de réduire le bruit dans les images. Pour ce faire, cliquez sur Menu&gt; Traitement d&#39;image&gt; Lissage&gt; filtre médian. Sélectionnez les deux canaux et d&#39;appliquer une taille de filtre &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Pour la quantification des signaux cellulaires, de détecter les cellules de CH4 configuré correctement le décalage et de filtrer les structures de la taille d&#39;exclure trop petites structures. <ol><li> Sélectionnez la vue Surpass et cliquez sur l&#39;icône &quot;Ajouter de nouvelles surfaces&quot;. Définir les paramètres de l&#39;algorithme de détection dans la fenêtre de la surface. Pour un traitement plus rapide, activer le deux cases à cocher &quot;Segment seulement une région d&#39;intérêt» et «toute image de process enfin&quot;. Définir la région d&#39;intérêt en modifiant ses dimensions. </li><li> Sélectionnez Channel 4 que le canal de source et régler le seuil par seuillage&gt; soustraction de fond (contraste local) et définir un diamètre de 10 um. Réglez le seuil d&#39;intensité moins manuellement à 0 et le seuil maximal à l&#39;intensification maximaleTy. Filtrer les structures par zone et définir la valeur minimum par exemple, 187 μm². Terminez la détection de surface. </li></ol></li><li> Extraire les valeurs moyennes de l&#39;intensité de la fluorescence du donneur (CH1) et le coefficient de FRET relatif (CH3) et leurs écarts-types de l&#39;entité cellulaire. Pour ce faire, allez dans les propriétés de surface. Changer l&#39;apparence des structures en sélectionnant Surfaces Style / Qualité&gt; Surface. Sélectionnez toutes les structures en cliquant sur l&#39;onglet Filtres. Unifier les structures détectées en allant à Processus de sélection&gt; Unify. Exporter les statistiques de production en surface vers MS Excel en cliquant sur l&#39;onglet Statistiques&gt; Exporter toutes les statistiques de fichier. </li><li> Tracer ces valeurs au fil du temps. Identifier l&#39;intervalle de pente maximale d&#39;augmentation de fluorescence de canal des donateurs pour chaque condition comme un paramètre raisonnable pour représenter la quantité d&#39;effecteur une translocation 10 min. Calculer la pente comme Δ m = intensité de fluorescence du donneur / Δ temps (min). </li></ol></li&gt; </ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Nous ici appliqué avec succès un essai à base TEM-1 bêta-lactamase reporter pour l&#39;analyse quantitative des effecteur translocation par Y. enterocolitica. De nombreuses variantes de cette technique sensible, spécifique et relativement simple ont été décrits dans la littérature. Dans cette étude, la microscopie à balayage laser a été réalisée pour la détection plus sensible et précise de signaux de fluorescence. Plus précisément, la correction de diaphonie entre les colorants donn...

III systèmes de sécrétion de type sont spécialisés machines protéines exportation utilisées par les différents genres de bactéries gram-négatives de livrer directement des protéines effectrices codées par des bactéries dans les cellules cibles eucaryotes. Bien que la machinerie de sécrétion lui-même est hautement conservée, des ensembles spécialisés de protéines effectrices ont évolué entre les différentes espèces bactériennes à manipuler voies de signalisation cellulaire et faciliter les stratégies de virulence bactériennes spécifiques 1. En cas de Yersinia, jusqu&#39;à sept protéines effectrices, que l&#39;on appelle (protéines extérieures Yersinia) Yops, sont transportés au moment du contact de la cellule hôte et d&#39;agir de concert pour renverser les réponses des cellules immunitaires telles que la phagocytose et la production de cytokines, à savoir, pour permettre la survie extracellulaire des bactéries 2-4. Le processus de translocation est étroitement contrôlée à différents stades 5. Il est établi que l&#39;activation de la SST3 primaire est déclenchée par le contact de la cible thisll 6. Cependant, le mécanisme précis de cette ouverture n&#39;a pas encore été élucidé. Dans Yersinia un deuxième niveau de ce qu&#39;on appelle de réglage fin de la translocation est réalisé par haut ou bas-régulation de l&#39;activité des protéines cellulaires Rho GTP Rac1 ou RhoA. L&#39;activation de Rac1 par exemple invasine ou cytotoxique facteur nécrosante Y (CNF-Y) entraîne une augmentation de la translocation 7-9, tandis que le GAP (GTPase activating protein) fonction de translocation YopE down-régule l&#39;activité Rac1 et diminue en conséquence la translocation par un type de rétroaction négative mécanisme de 10,11. Méthodes valides et précises sont la condition préalable pour étudier comment la translocation est régulée au cours Yersinia interaction de la cellule hôte. De nombreux systèmes différents ont été utilisés à cet effet, chacune des avantages et des inconvénients spécifiques. Certaines approches reposent sur la lyse de cellules infectées par des bactéries, mais pas différents détergents suivie d&#39;une analyse par transfert de Western. The inconvénient commun de ces méthodes est que la lyse bactérienne mineure mais inévitable contamine éventuellement le lysat cellulaire avec des protéines effectrices bactéries associées. Cependant, le traitement des cellules avec de la protéinase K pour dégrader les protéines effectrices extracellulaires et l&#39;utilisation ultérieure de la digitonine pour la lyse sélective des cellules eucaryotes ont été proposés pour 12 minimiser ce problème. Surtout, ces essais dépendent de façon cruciale sur les anticorps anti-effectrices de haute qualité, qui ne sont généralement pas disponibles dans le commerce. Les tentatives d&#39;utilisation de fusions traductionnelles des protéines effectrices et les protéines fluorescentes comme la GFP pour suivre la translocation ont échoué probablement dû à la structure tertiaire des protéines globulaires fluorescents et l&#39;incapacité de l&#39;appareil de sécrétion de les déplier avant 13 sécrétion. Cependant, plusieurs mots-clés différents rapporteurs comme le cya (calmoduline-dépendante l&#39;adénylate cyclase) domaine de la toxine de Bordetella pertussis cyclolysin 14 ou Flashtag ont été utilisés avec succès pour analyser translocation. Dans le premier essai de l&#39;activité enzymatique de cya est utilisé pour amplifier le signal de la protéine de fusion intracellulaire, tandis que la balise de Flash, une étiquette de motif très court tétracystéine (4Cys), permet pour l&#39;étiquetage avec le colorant de Flash biarsénicale sans perturber le processus de sécrétion 15. L&#39;approche appliquée ici a été signalé pour la première fois par Charpentier et al., Et est basé sur la conversion intracellulaire de la Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) colorant CCF4 par translocation effecteur TEM-1 bêta-lactamase fusions 16 (figure 1A). CCF4 / AM est un composé de cellules infiltrant dans laquelle un dérivé de la coumarine (donneur) et une fraction de fluorescéine (accepteur) sont reliées par un noyau de céphalosporine. Lors de l&#39;entrée passive dans la cellule eucaryote, la non-estérifié composé fluorescent CCF4 / AM est traitée par les estérases cellulaires au CCF4 chargé et fluorescent et ainsi piégédans la cellule. Excitation de la fraction de coumarine à 405 nm de résultats FRET à la fraction de fluorescéine, qui émet un signal de fluorescence verte à 530 nm. Après clivage du noyau de céphalosporine par la bêta-lactamase FRET est perturbé et l&#39;excitation de la fraction de coumarine conduit à l&#39;émission de fluorescence bleue at460 nm. Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l&#39;analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, la technique a été utilisée dans un modèle d&#39;infection de la souris pour identifier les populations de leucocytes ciblées pour la translocation in vivo 17-19. Compteur de signaux peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Il faut noter que le procédé prévoit également la possibilité de contrôler la translocation en temps réel par microscopie des cellules vivantes au cours de la 20,21 processus de l&#39;infection. Ici, la microscopie par fluorescence à balayage laser a été appliquée pour readout des signaux de fluorescence comme il offre la plus élevée sensibilité et la précision. En particulier, la capacité d&#39;ajuster la fenêtre d&#39;émission avec une précision nanométrique en combinaison avec des détecteurs de haute sensibles facilite optimisé détection par fluorescence et minimisé la diaphonie. En outre, cette configuration de microscopie peut être adapté pour la surveillance en temps réel de la translocation et permet potentiellement pour l&#39;analyse simultanée de interaction hôte-pathogène au niveau cellulaire. Dans cette étude, les taux d&#39;un Y. de translocation enterocolitica souche de type sauvage et un mutant de deletion YopE présentant un phénotype de hypertranslocator 10,11 ont été analysés de manière exemplaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

De nombreuses bactéries gram-négatives, y compris pathogène Yersinia spp. Emploient de type III systèmes de sécrétion de translocation des protéines effectrices dans des cellules cibles eucaryotes. A l&#39;intérieur de la cellule hôte les protéines effectrices de manipuler les fonctions cellulaires au profit des bactéries. Pour mieux comprendre le contrôle de sécrétion de type III lors de l&#39;interaction de la cellule hôte, sensible et dosages précis pour mesurer la translocation sont obligatoires. Nous décrivons ici l&#39;application d&#39;un dosage basé sur la fusion d&#39;un fragment de protéine effectrice Yersinia enterocolitica (protéine extérieur Yersinia; YopE). Avec TEM-1 ß-lactamase pour l&#39;analyse quantitative de translocation Le test repose sur le clivage d&#39;une cellule de permeation FRET colorant (CCF4 / AM) par une translocation fusion bêta-lactamase. Après avoir clivé le noyau de Cephalosporine de CCF4 par la bêta-lactamase, de la coumarine FRET est perturbé à la fluorescéine et l&#39;excitation de la fraction de coumarine conduit à l&#39;émission de fluorescence bleue.Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l&#39;analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, dans un modèle de souris. La détection des signaux de fluorescence peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Dans l&#39;installation décrite ici, à la translocation in vitro de fusions effectrices dans des cellules HeLa par des mutants de Yersinia différents est contrôlée par microscopie à balayage laser. Enregistrement conversion intracellulaire de la journaliste de FRET par la bêta-lactamase effecteur fusion en temps réel fournit des résultats quantitatifs robustes. Nous montrons ici des exemples de données, ce qui démontre la translocation accrue par un Y. enterocolitica YopE mutant par rapport à la souche de type sauvage.

Pour démontrer la capacité de la méthode décrite pour analyser quantitativement effecteur translocation dans les cellules cibles, deux souches de Yersinia avec des cinétiques différentes de translocation ont été étudiés: Y. enterocolitica souche de type sauvage WA-314 (sérogroupe O8, hébergeant le plasmide de virulence pYVO8 22) et son dérivé WA-314ΔYopE (WA-314 hébergeant pYVO8ΔYopE 23). Des travaux antérieurs ont montré que Y. mutants dépour...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analyse de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l&#39;aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K vues.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Recherche

Immunologie et infection

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

La détection des toxines translocation dans le cytosol hôte par résonance plasmonique de surface

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induction de murin inflammation intestinale par transfert adoptif de effecteur CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Haute</sup&gt; T cellules dans des souris immunodéficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Application de long terme de culture interféron-γ-enzymatique immunospot Essai d&#39;évaluation de mémoires et effectrices réponses des cellules T chez les bovins

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

Application Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour examiner effecteur translocation efficacité par<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Pendant siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Démêler la fonction d&#39;un effecteur bactérien à partir d&#39;un non-cultivable Pathogen usine utilisant une levure de l&#39;écran à deux hybrides

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Un modèle chronique auto-immune de rat à oeil sec avec augmentation de la cellule Effect Memory T dans le tissu Eyeball

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Analyse temporelle de la Translocation nucléaire-à-cytoplasmique d’une Herpès Simplex Virus 1 protéine par microscopie confocale par immunofluorescence