This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.

1.試薬およびソリューション<ol><li>フライ食品やメディアの準備<ol><li>熱フライ成分90℃に設定したホットプレートで水にw / vの0.79パーセント寒天11％の砂糖、2％自己消化酵母、5.2％のコーンミール、。均質やや密な混合物が得られるまで定期的に攪拌します。各食品を飛ぶmlの5と100バイアルの合計フライ食品の550ミリリットルの最終容量を準備します。 </li><li> 、加熱源から削除食品がダウン80℃に冷却するまで、時々攪拌し、95％エタノールに溶解した0.2％tegosept-4-ヒドロキシ安息香酸メチルを加えます。 </li><li> 2等量の食品を分割します。他のボリュームへの1つのボリュームとエタノール1.1 mlにエタノールに溶解したラパマイシンの50mMの1.1ミリリットルを追加します。ラパマイシンおよび食品へのエタノール溶液を攪拌します。温度が薬を追加する前に、50℃に低下していることを確認してください。 </li></ol></li><li>分離バッファ<ol><li>単離緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの3-（N &lt;500mlのを準備します/ em&gt;のモルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2.5 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）]水に。 </li><li>水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。 </li><li>ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。 </li></ol></li><li>洗浄バッファー<ol><li>水で洗浄緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの塩化カリウム、10mMのトリスHClおよび5mMのKH 2 PO 4]の500ミリリットルを準備します。 </li><li>水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。 </li><li>ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。 </li></ol></li></ol> ショウジョウバエ株の2飼育<ol><li> 、開発中の幼虫密度を制御培養瓶に両親の25組を配置し、それらが48時間の卵を産むことを可能にします。 </li> &lt;LI&gt;卵の密度を調整するために48時間後の親オブジェクトを削除します。 </li><li>繰り返しは、新興のF1子孫を使用して、2.1と2.2の手順ので、この濃度制御の二世代が達成されます。 </li><li>大人を収集するには、二酸化炭素（CO 2）と性別によって別々に使用してハエを麻酔。 <ol><li> 5 PSIの連続的な流れで高圧のタンクから、純粋なCO 2を配信するために単段レギュレータを使用してください。静電気を避けるために、水を用いてフラスコをフィルタリング500ml中にCO 2を触媒するためにプラスチックチューブを使用します。 </li><li>フラスコを密封するために一つの穴にゴム栓を使用してください。 CO 2パッドにフラスコの側方開口部を接続するためのプラスチック製のチューブを使用してください。 </li><li> 10〜15分を超えないためのパッドでハエを置きます。実験条件でそれらを配置する前に24時間、麻酔から回復できるようにします。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの濃縮された画分のための十分な代謝物を生成するには、サンプルあたり300ハエを使用しています。ここでは、女性を使用していますが、genderは他の実験では異なる場合があります。自家製1Lの人口統計ケージに150ハエを転送します。バイアル中のフライ食品の5ミリリットルへのアクセスを許可します。 </li><li>別の1リットルケージに残りの150ハエを転送します。 150以上のハエでケージを人口過剰にするしないでください。 </li><li>実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用してください。全動物の抽出物は、動物全体の1サンプルを生成するために、より多くの代謝物を得ているので隔離し、転送50女性は1ケージに飛びます。ミトコンドリアの分離株については、実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用しています。 </li><li> 12時間の光と12時間の暗のサイクルで25℃でのケージを置きます。 </li><li>食品の品質を維持するために、食品の5 mlのバイアル中で2〜3日ごとに新鮮な食品を提供します。 </li><li> 10日間の食品のハエを維持します。このステップは、ラパマイシン処理7のために必要とされます。他の治療法や条件が異なります。 </li></ol>ミトコンドリア画分の3の単離<ol><li> 1ケージ（150ハエ）からハエをダンプ冷却した単離緩衝液1mlを充填したガラス - テフロンダウンスホモジナイザー。 </li><li>ダウン15ストローク用乳棒アップとを移動させることにより、均質化します。無傷ミトコンドリアを維持するために氷の上にモルタルを続けます。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで1.5mlチューブと遠心分離機にホモジネートを転送します。 </li><li>ミトコンドリアを濃縮するために4℃で10分間6000×gで上清および遠心してください。 </li><li>上清を細胞質画分を含んでいるので、上清を廃棄または別の実験のためにそれを使用しています。洗浄バッファー300μlの中にペレットを再懸濁。 </li><li>第2のかご用3.5 - を繰り返して、3.1を繰り返します。極低温マイクロチューブの両方でケージの再懸濁したペレットを組み合わせます。 </li><li> 4℃で10分間、6,000×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、液体窒素中でペレットをフラッシュ凍結。 </li><li> -80℃以下の温度で濃縮されたミトコンドリア画分を保管してください。 <ol><li>また、動物全体の事前のためのparation、極低温マイクロチューブに大人を配置します。 -80℃以下の温度で液体窒素や店舗成人のバイアルをフラッシュ凍結。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).</li><li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria--a+nexus+for+aging,+calorie+restriction,+and+sirtuins.">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li><li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathology:+stress+signals+from+the+energy+factory.">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li><li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+evolution,+changes+and+challenges.">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li><li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).</li><li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila.">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li><li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila.">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li><li>Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#215;G&#215;E+for+Lifespan+in+Drosophila:+Mitochondrial,+Nuclear,+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity.">G&#215;G&#215;E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).</li><li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells.">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254 (2014).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material.">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li><li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer:+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology.">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li><li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics.">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020 (2012).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルの中で最も重要なステップは次のとおりです：1）豊かな空間に十分なハエを飼育します。これは、150以上のハエそれぞれと人口統計ケージを人口過剰にするしないことが非常に重要です。 2）食品の競争と栄養ストレスを避けるために頻繁にケージの食品を変更します。 3）ミトコンドリア画分の単離の間に整合性を確保するために4℃ですべてのサンプルを維持します。また?...

この手順の目標は、 キイロショウジョウバエを用いたメタボロミクス研究のために十分なミトコンドリア代謝物を得濃縮されたミトコンドリア画分を開発することです。我々の経験では、全細胞抽出法を用いたメタボロミクス解析は、 ショウジョウバエの微妙なミトコンドリアの代謝産物の変化を検出することができません。しかし、従来メタボロミクス解析にミトコンドリア分画、ミトコンドリア代謝産物シフトを同定するための感度を増加させます。 ミトコンドリアは、細胞が正常な機能1に必要なエネルギーの90％を提供する責任細胞小器官です。近年では、ミトコンドリアが単にアデノシン三リン酸（ATP）を産生するよりも細胞および生物機能においてはるかにダイナミックな役割を果たし、現在は代謝恒常性2,3の調節のためのハブとして認識されていることが認識されています。ミトコンドリアは、DISいる内共生プロセスの結果であります着色した微生物の系統は、15億年前の4〜合併しました。ミトコンドリアは、真の細胞小器官へと進化したように、内部共生からの遺伝子は、新興核ゲノムに組み込まれました。 37遺伝子は酸化的リン酸化5の酵素複合体のサブユニットであるミトコンドリアのタンパク質をコードする13の、ミトコンドリアDNAに残したままの動物では、今日、約1,500ミトコンドリアタンパク質は、核コードです。ミトコンドリアおよび核コンパートメント間の調整は、適切なミトコンドリア機能を維持するために必要とされます。 ここに記載された方法を用いて、我々は、ミトコンドリアと核ゲノムとの間の調整の操作から生じるショウジョウバエにおけるミトコンドリアの代謝変化を検出することができました。私たちは、その姉妹種DからするのmtDNAにショウジョウバエのひずみを使用しましたシミュ単一D.上に配置しました核背景6 メラノ 。この「中断」mitonuclear遺伝子型はDの 「ネイティブ」、または共進化mitonuclear遺伝子型と比較しましたそのネイティブDに同じ核ゲノムを運ぶメラノミトコンドリアDNAをメラノ 。 D.ショウジョウバエとD.シミュの mtDNAsは〜100アミノ酸とmitonuclear通信7,8に影響を与える &gt; 500同義置換により異なります。私たちは、薬理学的なストレスに応答して代謝物のシフトを研究するために全体のフライを抽出し、ミトコンドリアの濃縮された抽出物を生成しました。ここでは、ミトコンドリアに富む画分を使用した場合、我々はDを運ぶネイティブ、共同発展の遺伝子型との間にミトコンドリアの代謝物の顕著なシフトを検出することを示しますショウジョウバエの mtDNAs と D を運ぶ破砕遺伝子型シミュのmtDNA。対照的に、これら2つの遺伝子型の間で代謝産物の変化は、全体のハエ抽出物を利用する通常の方法を用いて微妙です。したがって、この方法はmtDNAsがでミトコンドリアの変化を仲介する方法を理解するためのパスを提供しました異なる薬剤への応答。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA14289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>38057&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris HCL&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RES3098T-B7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pads to anesthetize flies</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 liter cage&#160;</td>
			<td>Web Restaurant Store</td>
			<td>999RD32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 liter cage lid&#160;</td>
			<td>Web Restaurant Store</td>
			<td>999LRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a glass-teflon dounce homogenizer&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9661231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rapamycin&#160;</td>
			<td>LC Laboratories&#160;</td>
			<td>R-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-porin</td>
			<td>MitoSciences</td>
			<td>MSA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-alpha tubulin</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>12G10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Tritech Research, Inc</td>
			<td>MINJ-DROS-FP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter flask</td>
			<td>enasco</td>
			<td>SB08184M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber stopper</td>
			<td>enasco</td>
			<td>S08512M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mitochondrial enriched fractions for metabolic analysis in drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

プロトコルを使用して上記で説明し、我々は発散mtDNAs 7にラパマイシン薬物の効果をテストするために、ミトコンドリアの濃縮された画分および全動物抽出物にメタボローム解析を行いました。私たちは、フライ食品で薬物を溶解することにより、ラパマイシンの200μMを配信しました。ハエは、10日間ラパマイシンに曝露しました。全フライ抽出物からの?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila at JoVE.com

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で<em&gt;ショウジョウバエ</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

9.4K ビュー.  Adelphi University. Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster. 