ショウジョウバエメラノガスターにおけるクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイ

ショウジョウバエはミトコンドリア機能を研究するための良いモデルシステムとして機能します。ここでは、成体ハエからホモジネート組織におけるクエン酸シンターゼ活性を測定するためのプロトコルを提示する。このプロトコルはミトコンドリアの分離を必要としません。

それは速く、簡単で、幼虫、培養細胞および哺乳類組織のクエン酸シンターゼ活性を測定するのに適している。各サンプルの成虫ハエを収集し、各遺伝子型の少なくとも三重サンプルを収集することを確認します。20ミリモルHEPES、1ミリモルEDTA、および0.1%トリトンX-100を各サンプルに対して1.5ミリリットル試験管で500マイクロリットルの氷冷抽出バッファーを調製します。

成人は麻酔パッドに二酸化炭素を持って飛ぶ麻酔をします。胸郭を分離するには、鉗子で固定し、はさみで胸郭と腹部の境界に沿って切断することによってハエ腹部を分離します。クエン酸シンターゼ活性アッセイのためのフライソアサックスを収集します。

10個の成体フライソラックスを100マイクロリットルの氷冷抽出バッファーにすぐに移し、氷の上の害虫でそれらを均質化します。氷の上で5〜10秒間均質化し、5秒間氷の上に座らせ、すべての組織が完全に均質化されるまで繰り返すことによって、サンプルを冷たく保ちます。アリコート 10 マイクロリットルの各均質化サンプルを新しいチューブに入れ、タンパク質含有量測定を行い、これらのチューブを氷上に保ちます。

残りのサンプルに400マイクロリットルの氷冷抽出バッファーを加え、合計体積500マイクロリットル、ピペットを上下に加え、穏やかに混合します。各反応に対して、1マイクロリットルの希釈した細胞溶解液を、作製した反応液の150マイクロリットルに加える。穏やかにピペット処理を行い、泡の形成を避け、プレートリーダーを使用して摂氏25度で4分間、10〜30秒ごとに412ナノメートルの吸光度を測定します。

時間の経過に従って吸光度としてデータをプロットし、曲線の直線部分の傾きを計算します。最後に、反応速度または傾斜をサンプルタンパク質濃度で割り、クエン酸シンターゼ活性を正常化する。ショウジョウバエの筋肉におけるdRNF34のノックダウンはミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を増加させ、dPGC-1のノックダウンはこの増加を逆転させると仮定された。

初期線形酵素速度はアッセイごとに確立され、トレンドラインの傾きは、異なる遺伝子型の最大クエン酸合成酵素活動と同等の最大反応速度を表す。最大クエン酸シンターゼの活動は、運動曲線から計算し、タンパク質濃度によって正規化した。結果は、ハエのthoraxの合成酵素活性が実際に筋肉特異的dRNF34ノックダウンで増加し、増加が筋肉特異的dPGC-1ノックダウンによって逆転したことを示した。

サンプルを均質化する際には、チューブにチップを入れ、ホモゲン酸をチェックして、血栓がなく、チューブ内の組織が完全に均質化されていることを確認することが重要です。サンプル採取後、すべてのサンプル処理は氷上で行う必要があります。クエン酸シンターゼ活性アッセイは、無傷のミトコンドリア質量を定量するために使用される。

ミトコンドリアの機能を評価するためには、ミトコンドリア質量の適切な定量化が非常に重要です。