This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

動物に関わるすべての手続きは、カリフォルニア大学デ​​ービス校の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所によって公開実験動物の管理と使用に関する指針に付着させました。 1.準備<ol><li> 4℃に予め、店舗で修正されたタイロード液の2集中（25X）の株式を準備します（1）株式のI（MM中：NaClの3205、CaCl 2を32.5、塩化カリウム117.5、のNaH 2 PO 4 29.75、のMgCl 2 26.25）と（2）株式II（MM中：のNaHCO 3 500）。 <ol><li> NaClの128.2、 塩化カルシウム1.3、塩化カリウム4.7、MgCl 2を1.05、のNaH 2 PO 4 1.19、NaHCO 3で20、脱イオン（DI）の1840ミリリットルを組み合わせることにより、11.1グルコース：たて（MM）で、以下の組成の2 Lのタイロード溶液を調製水、80ミリリットル証券私、証券IIの80ミリリットル、およびグルコースの4グラム。直接株式私と証券IIを混在させないでください。加えます沈殿を回避するために1840ミリリットルのDIにメートル。 </li></ol></li><li>事前に無水ジメチルスルホキシド（DMSO）中に10mg / mlで興奮収縮脱共役剤のブレビスタチンの原液を調製し、4℃で保存溶液を保存します。 </li><li>蛍光色素のストック溶液を準備します（1）電位感受性色素RH237（DMSO中1mg / ml）及び（2）低親和性のカルシウム指示薬フルオ-5N AM、製造業者の推奨に従って（DMSO中に2mg / ml）を。積載量のその後の損失と分解を避けるために、すぐに準備を使用してください。 </li><li>プライム酸素（95％O 2、5％CO 2）タイロード溶液で再循環ランゲンドルフ灌流システム。 7.4±0.05でタイロード液のpHを維持するために、O 2 / CO 2の流れを調整します。継続的に灌流液をフィルタリングする：イン・ラインナイロン織りネットフィルター（11μmの孔サイズ）を使用します。 <ol><li>その後のLOADIとして内閣総理RTで灌流システム、Fluo-5N AMのNGを室温で行われます。フルオ-5N AMローディングのために、再循環灌流液の少量（〜150ミリリットル）を使用します。色素負荷後、灌流液の大量使用（1 - 2 Lを、 図1Cを参照）。 </li></ol></li><li>データ収集システムの電源をオンにし、ECGおよび灌流圧を連続的に監視するための準備。圧力監視システムを準備します。灌流ラインに圧力変換器を接続し、transbridgeアンプで灌流圧を監視します。心臓が灌流システムに接続されていないとき0 mmHgのベースライン潅流圧を調整します。 </li><li> V mとSRのCa 2+シグナルとの間の空間的な位置合わせを確実にするために、光学マッピングカメラの位置を合わせます。 <ol><li>まず、灌流皿にルーラーやテキストを使用してオブジェクトを配置することによって、カメラの焦点を合わせます。ライブビューモードにマッピングカメラを回して、テキストはくっきりと鮮明になるまでフォーカスを調整します。各カメラから単一のフレーム画像を取得します。 </li><li>オーバーレイこれらの画像との両方の画像が表示されるように、トップ画像の透明度を調整します。画像内のテキストが正確にオーバーラップする必要があります。完全に整列していない場合、2つの画像が位置合わせされるまで、ダイクロイックミラーまたは各カメラの位置の角度を調整します。 </li></ol></li></ol> 2.ウサギの心の収穫、灌流、および色素ローディング<ol><li>承認されたウサギの制止にウサギを固定します。深くペントバルビタールナトリウム（50mg / kg）およびヘパリン（千IU）の静脈内注射（辺縁耳静脈）を介して麻酔。 <ol><li>ウサギは、侵害受容反射の欠如を表示する場合は、胸骨と肋骨を露出するために正中線皮膚切開を行います。胸骨柄の剣状突起から鈍い先端の外科ハサミで胸骨を切断。胸骨を開いている間に心を傷つけないように注意してください。心臓を露出するためのリブを広げます。 </li><li>すぐに急速にすべての血管および結合組織を切断することにより、全体の心肺ブロックを切り出します。 Immediately氷冷タイロード溶液中に心肺ブロックを配置します。 </li></ol></li><li>逆行性灌流のための大動脈の位置を確認します。大動脈弓の3支店のすぐ近位上行大動脈をカットします。灌流システムに接続された8 Gカニューレに大動脈にカニューレを挿入。カニューレ上に大動脈を確保するために、USP 0絹縫合糸の一部を使用します。 </li><li>慎重に心臓から気管、肺、および心外膜脂肪を分析。鋭いピンセットと解剖ハサミで、僧帽弁を見つけて、慎重に左心室内の溶液の混雑を防ぐために、1リーフレットを損傷したり、削除します。 </li><li>イメージングのために上向きに心臓の前面と水平にガラスジャケット付き灌流チャンバーに心を沈めます。マッピング（ 図1D）の間、心臓の動きを防止するために皿のシリコン底部にU字型ピンとシルガードの片にカニューレを固定します。必要に応じて、STAのための心の頂点に小さな虫ピンを挿入bilization。 </li><li>ポジション心電図（ECG）は、心臓の右側と左側にバス内の電極。完全に浴に電極を浸し、彼らがリード私の構成に類似したボリューム行わ心電図を提供するために、心臓の表面に接触していないことを確認します。通常のリードI ECG形態を確認してください。 70 mmHgの - 大動脈圧は60に維持されることを確実にするために - （35ミリリットル/分25）の流れを調整します。 </li><li>部屋の照明をオフにして、0.3を追加 - （ - 20μMの最終濃度10）灌流液にブレビスタチン原液（ステップ1.2）の0.6ミリリットルを。 <ol><li>ブレビスタチンの光不活性化を回避するために、部屋の照明をオフにします。必要に応じて、小さなスポットライトやヘッドランプは、作業照明を提供するために使用することができます。 注意：ブレビスタチンは、ミオシンATPアーゼ阻害剤および興奮収縮脱共役剤です。フルオ-5Nの荷重が延長（60分）、RT（低体温）条件（ステップ2.8を参照してください。 - 2.10）を必要とするので、心臓のエネルギー生産が損なわれることがあります。目ereforeは、ロードを染める前に灌流液へのブレビスタチンの添加は、エネルギー需要16を削減し、その後の光学記録17の間にモーションアーチファクトを除去することができます。 </li></ol></li><li>心臓の収縮が停止した場合（10 - 大動脈圧の記録に検証15分）、小容量循環灌流システム（ステップ1.4.1を参照）に切り替えます。 </li><li>準備したFluo-5N AMのローディング溶液をロード：0.25ミリリットル暖かい20％プルロニックF127にフルオ-5N AM原液（ステップ1.3）の0.25ミリリットルを追加します。 0.5mlの混合物に暖かいタイロード液を加えよく混ぜ、および小容量循環灌流システムに追加します。 </li><li>連続灌流圧と心電図をモニターし、必要に応じて流れを調整します。色素負荷は、室温で約1時間かかります。ロードが開始された45分後、37℃に灌流システムおよび灌流液を暖め始めるために循環水浴をオンにします。 </li><li>フルオ-5N AM搭載の60分後、SWI大容量循環灌流システムに灌流をTCH（ステップ1.4を参照）。 </li><li>温かいタイロード液1mlに電位感受性色素RH237ストック溶液（ステップ1.3）、50μlの希釈し、カニューレに注入口の近位に（〜5分かけて）ゆっくりと加えます。 </li></ol> 3.光学マッピング<ol><li>色素負荷の最後の瞬間の間に、心を合わせて、実験用のビューの適切なフィールドを確保するために、光学マッピングカメラの焦点を合わせます。 </li><li>必要に応じて、ペーシングのために心臓の心外膜表面に双極ペーシング電極を配置します。 </li><li>灌流液の循環に存在することができる液面にモーションアーチファクトを低減するために灌流チャンバーの表面のプラスチックまたはガラスカバースリップを置きます。 注意：カバースリップに代わるものとして、クリーンなプラスチック製の50ミリメートルのペトリ皿のカバーを使用しています。 </li><li>均一Eで心臓の表面を照明する光ガイドをフォーカスxcitation光。 495 nmのバンドパスフィルタ（ 図1A） -青色発光ダイオード（LED）光源を使用し、さらに475の光をフィルタリングします。 </li><li>マクロスコープ及び二つの相補型金属酸化膜半導体（CMOS）光学的マッピングカメラで放出された蛍光を集めます。 545 nmのダイクロイックミラーで放出された光を分割します。 <ol><li>ロングパスは700 nmで、V mの信号を含む、より長い波長成分をフィルタ。 534ナノメートル（ 図1A） -バンドパス502から、SR の Ca 2+シグナルを含む、短波長成分をフィルタリングします。 1 kHzの - 0.5に光データ収集の頻度を設定します。 </li></ol></li><li>各光記録のために、第1の所望のペーシングプロトコルを開始し、励起光をオンにし、1収集 - データの4秒。必要に応じて、ペーシングプロトコルとデータ収集を同期させます。 注：これは、再ロードのFluo-5N AMすることは不可能であるので、信号対雑音比（SNR）がdecreaますSE、SRからの漏れを染料による実験を通して。高いSNR値を確保するために、2時間 - 1に実験プロトコルを制限します。 </li><li>実験の後、DI水で再びDI水、70％の試薬アルコールの順序で灌流システムを洗浄し、。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、市販のソフトウェアパッケージを使用した空間ガウスフィルタ（半径3ピクセル）と各データセットをフィルタリングします。 </li><li>必要に応じて、空間V mとSR の Ca 2+のデータセットを整列させます。ステップ1.6のように、各カメラからの画像をオーバーレイし、検証し、そのビュー（ すなわち、カニューレ、ペーシング電極）の分野における心臓の解剖学的構造（すなわち、冠血管系、心房のエッジまたは心室）、またはその他の項目を正確に重複。そうでない場合、データセットの空間的な位置合わせが必要です。 </li><li>正確なオーバーラップが達成されるまで、画素数のノートを作り、x軸とy方向に上部の透明画像をシフト画像は、それぞれの方向にシフトしなければなりません。トップ画像（V mまたはSRのCa 2+のいずれか）に対応するデータセット全体は、その後、V mとSRのCa 2+データセット間の正確な位置合わせを保証するために、各方向の画素の決定された数だけシフトする必要があります。 </li></ol>

<ol>
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M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+determines+Ca2++alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology.">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart.">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

成功のFluo-5Nの色素負荷への鍵は、色素の大量を必要とせずに高いのFluo-5N濃度を可能にする小容量循環灌流セットアップ、ロード時間（1時間）の長さ、およびロードを実行していますRTで。ロードが生理的温度、細胞の酵素活性で実行された場合、色素が細胞質ゾルに染料分子を捕捉し、それらは、SR膜を通過することができない、細胞膜を横切るときに迅速-AMタグを切断します。 RTで、しか...

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S271-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">CaCl2 (2H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">C79-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S217-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MgCl2 (6H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">M33-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaH2PO4 (H2O)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S369-500</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">S233-3</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">D16-1</td>
			<td style="width:423px;">Component of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">95% O2 5% CO2</td>
			<td style="width:167px;">AirGas</td>
			<td style="width:151px;">carbogen</td>
			<td style="width:423px;">For oxygenation and pH of Tyrode&#39;s solution</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Blebbistatin</td>
			<td style="width:167px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:151px;">1760</td>
			<td style="width:423px;">Excitation-contraction uncoupler</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">RH237</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">61018</td>
			<td style="width:423px;">Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Fluo-5N AM</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">F-26915</td>
			<td style="width:423px;">Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pluronic F127</td>
			<td style="width:167px;">Biotium</td>
			<td style="width:151px;">59004</td>
			<td style="width:423px;">For Ca2+ indicator loading; Warm until the solutiion is clear before use</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">D2650</td>
			<td style="width:423px;">For dissolving blebbistatin and dyes</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Filter</td>
			<td style="width:167px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:151px;">NY1104700</td>
			<td style="width:423px;">11um in-line filter</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Pressure Transducer</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">BLPR2</td>
			<td style="width:423px;">For measuring perfusion pressure</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Transbridge Transducer Amplifier</td>
			<td style="width:167px;">WPI</td>
			<td style="width:151px;">SYS-TBM4M</td>
			<td style="width:423px;">For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">PowerLab 26T</td>
			<td style="width:167px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">For continuous recording of pressure and ECG signals</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">THT Macroscope</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Macroscopic optical setup. Details: 0.63x objective (NA=0.31), 2x condensing objective, resultant field of view = 3.1x3.1 cm, depth of focus = ~1.5mm</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">MiCam Ultima-L CMOS</td>
			<td style="width:167px;">SciMedia</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td style="width:423px;">Optical mapping cameras</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Precision LED Spot Light</td>
			<td style="width:167px;">Mightex</td>
			<td style="width:151px;">PLS-0470-030-15-S</td>
			<td style="width:423px;">LED light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

図1Aは、二重のV mおよびSR の Ca 2+マッピングの光学的構成の概略図を示します。この設定では、V mの完全なスペクトル分離とSRのCa 2+シグナル （ 図1B）があります 。フルオ-5N染料ロードに使用デュアルループ灌流システムの図を図1Cに示されている。 図1Dは 、灌流皿の中の心の水平方向を示して?...

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

この記事では、ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における詳細なプロトコルおよび膜貫通電位 （Vm）のデュアル光学マッピングとフリーイントラ筋小胞体（SR）のために必要な機器のCa 2+を説明しています。この方法は、無傷の中心部にあるV mとSRのCa 2+動態の直接観察と定量化を可能にします。

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

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Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.1K ビュー.  University of California Davis. この記事では、ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における詳細なプロトコルおよび膜貫通電位 （Vm）のデュアル光学マッピングとフリーイントラ筋小胞体（SR）のために必要な機器のCa 2+を説明しています。この方法は、無傷の中心部にあるV mとSRのCa 2+動態の直接観察と定量化を可能にします。 