オーストラリア原子科学技術学会のサポートが認められています。 TCKはAINSE賞を受賞しました。エピ医学研究所は、国立保健オーストラリアの医学研究評議会（566559）でサポートされています。この作品は、オーストラリア政府の共同研究センター（CRC）プログラムの下で設立され、サポートされている医学開発株式会社、のためのCRCによって運営されている。 LMは、メルボルン研究所（メルボルン大学）と医学のCRCの補助金によってサポートされています。モナッシュマイクロイメージング（博士スティーブンコーディとISKAカーマイケル）のサポートは、この仕事のための非常に貴重でした。

細胞の準備<ol><li>ヒト赤白血病K562細胞は37℃、加湿5％CO 2環境で10％（v / v）のウシ胎児血清および20 mg / mlのゲンタマイシンを添加したRPMI - 1640培地℃で栽培されています</li><li>染色前の約18時間37に新鮮な培地と引き換えに再懸濁さ生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝と指数関数的に成長している細胞（5 × 10 5細胞/ mlで最適な）洗浄° C、5％CO 2。 </li><li> 5分間で約1500rpmで遠心分離によって二回PBSで細胞を洗浄し、新鮮な培地に再懸濁します。 </li><li>細胞をカウントし、約5 × 10 5細胞/ mlに細胞密度を調整する。 </li></ol>細胞は自動化された方法（例えばシスメックスまたは5〜20ミクロンの間のフィルタサイズはコールターカウンター）またはトリパンブルー排除法とhaemocytometerを使用するかのいずれかをカウントすることができます。細胞の過剰な数が（&gt; 800細胞/ cm 2）不均一な染色につながる可能性があります。 照射と免疫蛍光染色<ol><li>適切なラベリングでサイトスピンクリップ、フィルタのカードとスライドを組み立てます。 </li></ol>サイトスピン装置を組み立てるときにフィルタカードに穴が漏斗と一致することを確認してください。 <ol start="2"><li> γ線またはX線（この例では2Gy）のどちらかに細胞をさらす。 </li></ol>照射中の巣の形成を防止するために、前へと照射中、5〜10分間氷上で細胞を維持する。 以下の照射は、37℃で細胞をインキュベート° C、5％に必要な時間（ピークγH2AXレベル30分〜1時間、この例では1時間）のためのCO 2。 <ol start="3"><li>新鮮なPBSで遠心分離と再懸によって冷PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 5分間500rpmで各サイトスピン漏斗とスピンに細胞懸濁液100〜150μLを分注する。 </li><li> cytospinsからスライドを分離し、細胞が適度に約15分間風乾します。 </li></ol>細胞は細胞形態が崩壊する可能性があるため、完全に乾燥させないでください。 <ol start="6"><li>疎水性のペンで細胞の周りに円を描きます。 </li><li>室温（RT）で5分間、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。 </li></ol>我々の経験では、パラホルムアルデヒドで固定、エタノールまたはメタノールで固定に優れています。長い固定時間（15〜20分）は、接着細胞の最適な固定のために必要とされるのに対し、浮遊細胞は、室温で5分間固定を必要とする。 我々は、その染色がすぐに一般的に高いバックグラウンドの蛍光をもたらす-20℃で固定されたスライドを格納するよりもよい結果が得られます見つける。 <ol start="8"><li>各5分間PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 0.1パーセント、5分間室温でトリトンX - 100で細胞を透過処理。 </li></ol>のTween - 80に比べて我々は通常、トリトンX - 100で透過性細胞におけるより良いシグナルを観察。細胞の種類によってはそれがpermeabilisationの時間を変更する必要があります。付着細胞で15分の透過処理が必要とされるのに対し、例えば、K562細胞では、室温で5分間透過化は十分です。 <ol start="10"><li>各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li>室温で30分（3 × 10分）のための1％BSAで細胞をブロックする。 </li></ol>我々は、血清（二次抗体と同じ種に由来）とPBSのウシ血清アルブミンを使用して、ブロッキング効率を比較した。 BSAは血清に比べて二次抗体の非特異的結合を最小限に抑えることで、より効率的であった。我々は、室温で一晩℃で3に比べて× 10分、3 × 20分間のブロッキングのステップ4で、ブロッキング、異なるブロッキング時間を比較し、3 × 10分間ブロックして最適であると判断した。 <ol start="12"><li>各スライドに：一次抗体50μL（500 1％BSAで希釈した1）を追加します。 </li></ol> 4℃で一晩インキュベーションに比べて減少したバックグラウンド染色で60分の結果℃、RTで一次抗体とインキュベート<ol start="13"><li>別のマーカーを染色するために、同時に別の種（この例では、例えばマウス抗γH2AXとウサギ抗メチル化H3K4）で産生された抗体を使用してください。 </li><li> 250rpmでロッキングプラットフォーム上で室温で90分間一次抗体でインキュベートする。 </li></ol>すべてのインキュベーションは加湿染色トラフで実施されています。 <ol start="15"><li>各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li> 50μLの追加（1：1000は、1％BSAで希釈した）二次抗体を各スライドに。 </li></ol>同じスライド上の別のマーカーに染色するには、dと二次抗体を使用してくださいifferent種特異性（一次抗体に応じて）と蛍光発光波長（例えば抗マウスアレクサ488（緑）および抗ウサギこの例では、アレクサ- 546（赤））。 <ol start="17"><li> 250rpmで振盪プラットフォーム上でRTで60分間細胞をインキュベートする。 </li></ol>それは二次抗体の退色や乾燥を避けるために暗い湿室で細胞をインキュベートすることをお勧めします。 <ol start="18"><li>各5分間、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li>各スライドに50μL（PBSで希釈1:500）TOPRO - 3を追加。 </li><li> 3X 5分間PBSでスライドを洗浄します。 </li><li>スライド上の過剰な水分を取り除くと耐フェードソリューションを追加します。 </li></ol>それは完全にアンチフェードソリューションを追加する前に、細胞を乾燥しないことをお勧めします。 <ol start="22"><li>カバースリップ、マニキュアとシールし、室温で暗所で一晩スライドを残す。 </li></ol>それは、共焦点特定のカバースリップ＃1.5（厚さ0.16〜19ミクロン）と明確なマニキュアを使用することをお勧めします。 スライドにカバースリップを配置しながら、ケアは気泡の形成を避けるために注意すべきである。 画像の取得<ol><li>ツァイスLSM510メタ共焦点顕微鏡は、標準のGFP（緑色、488 nmの）、PI（赤色543 nm）と（青色633nmの）はるかに赤色レーザーを使用して画像を取得するために使われます。 </li></ol>画像は、より良い空間分解能を明らかに共焦点顕微鏡を用いて取得した。 γH2AX病巣の大きさが0.5μicronsより低くなる場合がありますので、Z軸に沿って少なくとも0.5μicronのステップサイズで画像を取得することをお勧めします。 63 ×油浸対物レンズは、どちらかより高いまたはより低い倍率と比較して好ましい。イメージング多くの細胞のための病巣が、それをカウントするためのスキャン8の速度と1024 × 1024ピクセルの画像サイズを使用することが好ましい。異なる核タンパク質間の空間的関係を説明するために、それは2048 × 2048ピクセルの画像サイズで6のスキャン速度を使用することをお勧めします。 複数のチャネルからの画像は、ラインスキャンの買収は、フレームのスキャンと比較することをお勧めされている場合。これは、漂白し、より良い分解能が達成される回避。シーケンシャルスキャンは、チャネル間を通してブリードを防止するために使用されます。 カウント巣画像解析と巣のカウントは、様々なソフトウェアパッケージを（Metamorph、画像- JとImarisをinlcuding）を使用して実行できます。 Metamorphを使用して、巣のカウントのための手順はここで説明されています。 <ol><li>直接ファイルメニューから、またはビルド番号のスタックオプションを使用してγH2AXの画像スタックを開きます。 </li><li>メニューを処理するために移動して、スタック演算を選んだ。 </li><li>最大投影を選択し、含まれる平面を選択し、[OK]をクリックします。 </li><li> γH2AXTIFFのような結果の画像を保存します。 TOPRO - 3（青）画像を提出して開きます。 </li><li>地域に移動し、地域の描画ツールを選択し、原子核の周りの領域を描きます。 </li><li> γH2AXのTIFF画像をクリックし、プロセスのメニューに移動し、モフォロジーフィルタを選択します。 </li><li>トップハットを選択し、ソースイメージとしてγH2AXイメージを選択します。 </li><li>トップハットフィルタと結果の画像を適用するには、巣の強度のノイズが少ないと低変動とのバイナリイメージになります。 </li></ol>トップハットの値を選択する際には注意が必要です。最適な値は、前とフィルタ適用後の画像を視覚的に比較することによって得ることができる。 <ol start="9"><li>プロセスのメニューに移動し、しきい値のイメージを選択します。 </li><li>包括的なしきい値を選択し、より低く、高いしきい値]を選択します。 </li></ol>それは一般的に巣の数に影響を与えるしきい値です。しきい値を選択する際にそのため、非常に注意が必要です。これは、最高のγ線照射とその後の下が2 Gyに曝露した細胞で異なるしきい値を使用してカウント巣の数は手動カウント（目で）と病巣数を比較することによって達成することができます。最適なしきい値は、背景のインクルードを最小限にし、巣の包含を最大化するものです。 <ol start="11"><li> TOPRO - 3画像を選択して、地域のメニューに移動し、転送領域]オプションを選択します。 TOPRPO - 3のようなソースイメージとトップハットのような目的地を選択し、[OK]をクリックします。 </li><li>核の領域は、トップハットの画像に転送されると測定のメニューに移動してIntegrated形態計測分析を選択します。 </li><li>ポップアップウィンドウで、地域によって、ソースイメージ - トップハットとメジャーを選択します。 </li><li>すべての領域を測定し、トップハットの画像に対応する核のすべてで巣の数を取得するための措置をクリックし選択してください。 </li><li>各地域から巣の番号は、ログ- dataオプションを使用してMS - Excelファイルにエクスポートすることができます。 </li></ol> 3D画像再構成 Metamorphを使用してスタックから3D画像を作成するには： <ol><li>スタックメニューに移動し、3D再構築を選択します。 </li><li>回転の角度（例えば160℃、320℃）を選択します。 </li><li> 3次元再構成型最大]を選択します。 </li><li>回転面（水平または垂直）を選んだ。 </li><li> Z -調整距離を選びました。 </li></ol>それは、（最適な0.5μicronsである）Z -距離指定されたユーザーを使用することが好ましい。 <ol start="6"><li> 3次元再構成を作成するために[OK]を選びました。 </li></ol>ラインスキャン分析 Metamorphを使用して、ラインスキャン解析のための： <ol><li>単一平面のイメージまたはスタックファイルのいずれかを開きます。 </li><li>コマンドを測定するツールバーに移動し、ラインスキャンの分析を選択します。 </li><li>細胞全体に線を引くとこれが自動的に線のパスに沿って各マーカーの蛍光強度との距離を明らかにする。 </li></ol>様々なクロマチンのマーカーの空間的関係を明らかにするために、例えば、γH2AX巣とヒストンメチル化は、それはこれらのマーカーに密集し、貧しい人々の両方ある地域にまたがる線を描画するのが好ましい。 代表的なデータこのデモンストレーションの目的のために我々はγH2AX巣に対する抗体を使用し、積極的にユークロマチンを転写するのエピジェネティックな決定要因にDSBが空間分布を評価するために、H3K4meする。として2Gyで照射後、図1に示すように、γH2AX病巣は両方H3K4me染色のためにとTOPRO - 3染色DNA（明るく染色されたDNA領域のヘテロクロマチンの指標である）のための鈍いした地域で主に形成。 <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。γH2AX巣の形は主にユークロマチンの電離放射線への返信です。 （A）ヒト赤白血病細胞K562のγH2AX病巣（緑）、γ線照射（2 Gy）を1時間後の免疫蛍光可視化する。 γH2AX病巣は、積極的にユークロマチン（赤）を転写表す、H3K4meに関連して示されています。 DNAはTOPRO - 3（青）で標識されている。マージされた画像（青、赤と緑）は、ヘテロクロマチン領域から除外γH2AX病巣を示しています。ラインスキャン分析（蛍光強度対距離）は、単一平面内のマーカーの相対的な分布を示している。上記のマージされた画像の3D再構成とは異なる面での（B）のスライス。

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

DNA二本鎖切断（DSB）の初期の分子応答は、ヒストンH2AXの1,2の端子SQEYモチーフ内のセリン- 139残基のリン酸化である。 H2AXのこのリン酸化は、ホスファチジル- inosito 3 -キナーゼ（PI3K）タンパク質のファミリー、毛細血管拡張性運動失調変異（ATM）、DNA -プロテインキナーゼ触媒サブユニットとATMとRAD3関連（ATR）3によって仲介される。 γH2AXと呼ばれるH2AXのリン酸化形態は、、immunofluorecence顕微鏡3で簡単に可視化する離散的な病巣を形成する、DSBのサイトからクロマチンの隣接地域に広がっています。 γH2AX巣の分析と定量は、広く、特に電離放射線に応答して化合物と細胞毒性化合物4を修正する様々な放射線の有効性を評価するため、DSBの形成と修復を評価するために使用されています。 DSBがこのデノボマーカーの絶妙な特異性と感度を考えると、それはクロマチンの文脈におけるDNA損傷と修復のプロセスに新たな洞察を提供しています。例えば、放射線生物学の中心的なパラダイムは、核DNAは、放射線感受性に関する重要なターゲットであるということです。確かに、フィールドの一般的なコンセンサスは、主としてDNA損傷と修復のための均質なテンプレートとしてクロマチンを表示することであった。しかし、DSBが分子マーカー、ユークロマチンとヘテロクロマチンにおけるγ-照射誘起γH2AX巣の形成における格差としてγH2AXの使用5-7観察されている。最近、我々はモノ、どちらジ - または構成的ヘテロクロマチンと転写サイレンシングとリシン4のエピジェネティックな痕跡であるリジン9時、トリメチル化ヒストンH3（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3）（H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3に対する抗体のパネルを使用）、しっかりと電離放射線8次のγH2AXの空間分布を調査するために、真正染色質領域を転写積極的に相関している。クロマチン生物学に関する現行の考え方に準拠して、我々の調査結果はγH2AX形成し、活発に転写9の間の密接な相関関係を示した。ここでは、他のエピジェネティックなマーカーと共局在、画像解析と3D -モデリングに特に焦点を当て、非接着細胞のγH2AX病巣の検出および定量のための私達の免疫蛍光法を示しています。

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of the Spatial Distribution of Î³H2AX following Ionizing Radiation at JoVE.com

Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

DNA二本鎖切断に対する応答のSer - 139のH2AXのリン酸化に続いてフォームγH2AX巣、、の顕微鏡分析は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、核内の放射線誘発γH2AX形成の空間分布を評価するために、積極的に転写ユークロマチンのエピジェネティックマーカーとしてリジン4でモノメチル化ヒストンH3に対する抗体を使用。

電離放射線は、次のγH2AXの空間分布の評価

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K ビュー.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. DNA二本鎖切断に対する応答のSer - 139のH2AXのリン酸化に続いてフォームγH2AX巣、、の顕微鏡分析は、放射線生物学における非常に貴重なツールとなっています。ここでは、核内の放射線誘発γH2AX形成の空間分布を評価するために、積極的に転写ユークロマチンのエピジェネティックマーカーとしてリジン4でモノメチル化ヒストンH3に対する抗体を使用。

ビデオ: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

電離放射線への応答でγH2AX病巣の定量化

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

生物学

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

外植片培養での歯胚の開発に続いてのためのスライス培養法

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

タバコ一過性発現系を使用したMAPKシグナル伝達経路の空間再編のイメージング

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

SCAPの分析<em&gt; N</em&gt;ヒト細胞における-glycosylationと人身売買

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

の用法<em&gt; ex vivoで</em&gt;全体の臓器イメージングと定量的組織組織学は、蛍光標識分子のバイオ分布を決定します

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

脂質豊かさとナイルの赤とオイル赤 O 染色により線虫の脂質分布評価の定量化

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

オルソ電圧(40-300 kV)X線設備を用いた細胞照射用線量測定

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するUV放射および化学物質の毒性の決定

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...