著者らは、この記事の出版物でのヘルプとサポートのための伊Filareteに感謝しています。またTECNAI G2、透過型電子顕微鏡を使用するためのセントロEuropeoのディNanomedicinaに感謝したいと思います。

1。 ER蛍光タンパク質を用いて、プラスミド、細胞培養、およびトランスフェクション<ol><li>この研究で使用したプラスミドは、ラットシトクロムbのERアイソフォームのテール領域へのC-末端で融合GFPの拡張バージョンで構成され（5）リンカー配列を介して（bと（5）ここでは略す）。テール領域（5）は、アップストリームおよびダウンストリームの極性配列が隣接する17残基のTMD（膜貫通ドメイン）、（UPSとDPS）​​などのネイティブBのトリプシン切断の後に結合した膜のまま、全配列（Pro94-Asp134）が含まれています。リンカーは、[（グリシン）4セリン] 3、続いてmycエピトープから構成され、全体のcDNAを哺乳動物発現ベクターのpCDNA3-Hind3でののXba1部位に挿入される。このプラスミドの構造の詳細は、それがGFP-ER 16とも呼ばれる、以前の刊行物に記載されている。 </li><li> 10％フェタを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でCOS-7細胞を増殖させるLのウシ血清、2mMのL-グルタミン、37℃でインキュベーター中で1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％CO 2。 </li><li>トランスフェクション。製造者によって記載されているように、プレート3×10 5 6ウェルプレート中の丸いガラスカバースリップ上の細胞とは、次の日に、JetPEIシステムとトランスフェクト。我々の場合に、JetPEI：2:1のDNA比は、70〜80％のトランスフェクション効率をもたらす最適なJetPEI / DNA比は、使用されるプラスミドおよび細胞株に応じて、最大のトランスフェクション効率を確立するためにテストされていることに留意されたい。 </li></ol> 2。ライブ蛍光走査型共焦点顕微鏡<ol><li>生細胞イメージング。トランスフェクトされた細胞を10％FBS、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、25mMのHEPESを補充したW / OフェノールレッドDMEMで充填された24mmカバースリップ用スチール培養細胞チャンバ内に播種したカバースリップを置く退色からサンプルを防ぐために、50μg/ mlのシクロヘキシミドおよび1:100 OxyFluor。 SP5共焦点microscopd個の GFP-ERは、488nmレーザー及び50分の525バンドパス発光フィルターを用いて可視化した状態で温度制御されたCO 2インキュベーター（37℃、5％CO 2）を備えた電子は、生細胞イメージング実験のために使用される。 </li><li> （FRAP）を光退色後蛍光回復。 OSER構造に対応する、関心領域（ROI）を描き、それは（試料で5.5〜6μWに対応する、30 mWのアルゴンレーザーの100％）の20回の反復と488nmの組み合わせを使用し、405nmの漂白（30 mWのダイオード405のレーザーの60％が、サンプルで11.6μWに相当する）我々の経験では、効率的かつ迅速な光退色につながる、レーザーが。 </li><li> 10分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）のための単一フレームごとに10秒を取ることによって、漂白されたROI内の蛍光の回復を記録します。 </li><li> （フリップ）の光退色の蛍光損失。 OSER構造に対応するROI、上述したように漂白剤を描く。漂白は、30秒毎に繰り返される、とポスト漂白画像は30分（画素時間= 1.61秒/ピクセル）ごとに10秒を記録している。 </li><li> FRAPやFLIP分析。すべての画像は、ImageJソフトウェア（使用して分析する<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.htmlを</a> ）。 FRAP実験では、漂白されたROIの蛍光回復を経時的に測定され、常に経時的に一定であることがチェックされる漂白細胞の総蛍光に対して標準化。 </li><li> FLIP実験のために、漂白OSER外と細胞全体をカバーするROIを描画します。経時的に蛍光強度を測定し、撮像自体による蛍光の低下を補正するために前記未漂白のセルに描かれたROIの蛍光レベルに正規化する。 </li><li>全ての実験では、ROIの蛍光強度から（細胞の外側の領域で決定した）バックグラウンドシグナルを差し引く。最後に、Grのを使用して結果をプロットaphPad Prismソフトウェア。 </li></ol> 3。透過型電子顕微鏡を用いて超微細構造解析試薬の多くの毒性を考えると、すべての手順は、適切なラボを着て行われるべきである。ヒュームフードの下のコートと手袋。 <ol><li>ペトリ皿からカバースリップを除去した後、室温で10分間、0.1 Mカコジル酸緩衝液、pH7.4中で濾過し、2％グルタルアルデヒドを用いて単層として皿の底の上に成長した残りの細胞を固定する。 </li><li>テフロンスクレーパーを用いて細胞をこすり落とし、1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに転送します。 10分間9,000 gでの遠心分離により細胞をペレット化。上清を除去し、新鮮な固定を追加し、4℃で一晩のまま</li><li>次いで、室温で1時間カコジル酸緩衝液中の1％四酸化オスミウム溶液で後固定し、緩衝液でペレットを洗浄する。 </li><li>ミリQ水で洗い流し、とした一括染色エン20〜60の間分間蒸留水中1％酢酸ウラニル。 </li><li>エタノールシリーズ（70％、80％、90％、100％、10分ごとに、100％）の増加でサンプルを脱水し、プロピレンオキシド（15分毎）​​で二回簡単に洗浄する。 </li><li> （2時間から一晩）、プロピレンオキシド+エポン（1:1）の混合物中にサンプルを浸潤する。 </li><li>少なくとも24時間60℃で硬化さエポンエポキシ樹脂に埋め込む。 </li><li>セクション60から70ナノメートルの厚さの部分を取得するために45°のダイヤモンドナイフを装備したウルトラライカUC6を使用して手動でトリミングされた樹脂圏。 300メッシュ銅グリッド上のセクションを収集します。 </li><li>酢酸ウラニル（20分）の飽和溶液でグリッド上のセクションを染色し、クエン酸鉛（7分）、徹底的に再蒸留ろ過された水でそれらを浸漬することによってグリッドを洗浄し、それらを室温で乾燥させます。 </li><li>染色されたグリッドはTECNAI G2透過型電子顕微鏡を用いて観察し、画像がボットを使用して捕捉される（一般的には6,000-39,000 Xの範囲）異なる最終倍率でOMマウントされたCCDカメラ。 </li></ol>

<ol>
	<li>Fasana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+VAPB+mutant+linked+to+amyotrophic+lateral+sclerosis+generates+a+novel+form+of+organized+smooth+endoplasmic+reticulum.">A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum.</a> FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).</li><li>Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+architecture:+structures+in+flux.">Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).</li><li>Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+domain-dependent+partitioning+of+membrane+proteins+within+the+endoplasmic+reticulum.">Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum.</a> J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein+dynamics+in+living+cells.">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).</li><li>Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-directional+protein+transport+between+the+ER+and.">Bi-directional protein transport between the ER and.</a> 20, 87-123 (2004).</li><li>Snapp, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+stacked+ER+cisternae+by+low+affinity+protein+interactions.">Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions.</a> J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).</li><li>Papiani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restructured+endoplasmic+reticulum+generated+by+mutant+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+VAPB+is+cleared+by+the+proteasome.">Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome.</a> J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).</li><li>Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubic+membranes:+a+legend+beyond+the+Flatland*+of+cell+membrane+organization.">Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization.</a> J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).</li><li>Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+ER:+experimental+approaches+and+current+questions.">The dynamic ER: experimental approaches and current questions.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).</li><li>Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+causes+formation+of+ER+cisternal+stacks+in+transfected+fibroblasts+and+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells.</a> Neuron. 12, 327-342 (1994).</li><li>Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+study+of+rat+liver+and+liver+neoplasms+after+long-term+treatment+with+phenobarbital.">Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital.</a> Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).</li><li>Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+reversible+restructuring+of+the+endoplasmic+reticulum+induced+by+PDMP+in+cultured+cells.">Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells.</a> J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).</li><li>Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+tendency+of+fluorescent+proteins+to+oligomerize+under+physiologic+conditions.">Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions.</a> Traffic. 13, 643-649 (2012).</li><li>Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+distribution+of+high-avidity+LFA-1+detected+by+soluble+ICAM-1-coated+microspheres.">Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres.</a> J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+faces+of+protein+misfolding:+gain-+and+loss-of-function+in+neurodegenerative+diseases.">The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases.</a> EMBO J. 27, 336-349 (2008).</li><li>Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+a+tail-anchored+protein+to+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+outer+membrane+by+independent+but+competing+pathways.">Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways.</a> Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).</li><li>Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+perturbation+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells+FRAP,+photoactivation,+photoconversion,+and+FLIP.">Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).</li><li>Michida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+endothelin+1+in+hemorrhagic+shock-induced+gastric+mucosal+injury+in+rats.">Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats.</a> Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このホワイトペーパーで説明プロトコルおよびイメージングのアプローチは、生細胞の小胞体内に常駐トランスフェクションしたTAの蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用されてきた。我々はまた、超微細構造解析により、この細胞内区画のアーキテクチャにこれらのタンパク質の過剰発現の効果を分析した。 生細胞の共焦点イメージングおよび電子顕微...

緑色蛍光タンパク質（GFP）およびそのスペクトル変異体、および蛍光顕微鏡の並行開発の発見は、細胞におけるタンパク質の挙動の調査のための完全に新しい道を開いた。なぜなら強烈な照明の下での蛍光を消火する蛍光体の本質的な能力のために可能であるような（FRAP）を光退色後蛍光回復と（フリップ）の光退色の蛍光損失などの技術は、共焦点生細胞イメージングトランスフェクトの使用に基づいている蛍光融合タンパク質1-3。彼らは広く、その機能4に関する重要な手がかりを明らかにすることができ、タンパク質の局在だけでなく、彼らの機動性と小胞輸送だけでなく、を評価するために使用されています。 真核細胞のユニークな特徴は、特定の脂質およびタンパク質の組成物を有する細胞内コンパートメントの存在である。細胞小器官は、物理的に絶縁のあるですがオピニオン、それらは互いに通信し、細胞の恒常性を維持するために、分子成分を共有する必要がある。分泌経路は、ERで合成されたタンパク質や脂質は、彼らがその機能を発揮する正しい最終目的地に到達することが保証されます。細胞内小器官はまた、分子（脂質）が直接コンパートメントとの間で交換することを可能にする動的接触部位に接続することができる。さらに、多くのタンパク質は大きなヘテロ複合体で組み立てまたは機能的に活性になるか、その最終的な目的地に輸送されるために特定の脂質種（脂質ラフト/マイクロドメイン）に関連している。これらの生物学的局面の全てが大きく、タンパク質の動力学的特性に影響を与えるため、適宜、以下に記載される技術を用いて調べることができる。 我々のグループは、ERのアーキテクチャとその異なるサブを研究するために、電子顕微鏡と組み合わせ広く使われているFRAPやFLIPを持ってドメイン。 ER、分泌経路の最初のステーションであり、タンパク質および脂質5選別において重要な役割を果たしている。それは、その個別のサブドメイン（ すなわち 、タンパク質および脂質生合成および輸送、タンパク質の折り畳み、Ca 2 +の貯蔵と放出、および異物代謝）その多くの異なる機能を反映して非常にダイナミックな細胞小器官である。それらは形態学的に、空間的、および機能的に別個であるものの、これらのドメインは、互いに連続しており、それらの相対存在量は、生理学的および病理学的条件下で、細胞内で改変することができる。最もよく知られ、ERの通常空間的に分離されたドメインは、核膜、および平滑、粗ERであるが、我々及び他のER構造は、種々の細胞型におけるより精巧なアーキテクチャおよび三次元の組織に存在することが実証されているまた、低酸素症、薬物などのストレス刺激により誘導することができる、生理学的条件下での組織投与、またはERに存在する膜貫通タンパク質2,6の過剰発現（およびその中の参考文献）。 また、最近、ヒト疾患1,7の細胞モデルにおいて、このような構造の存在が実証されている。彼らはまた、彼らのような彼らのアーキテクチャに基づいてkarmellae、ラメラ 、及び晶質ERとして知られているが、滑らかなERの積み重ね嚢から発信さが、それらは、2003年6で編成滑面小胞体（OSER）の集合的な名前を与えられたサイズは、変えることができる。細胞が尾アンカー（TA）ERに存在するタンパク質（Dの EGFP-ER）の細胞質ゾル領域に融合GFPをトランスフェクトされた後、 トランスでGFPの弱い二量化傾向が劇的にERの組織や構造を変更します。 FRAPやFLIPの実験は、D EGFP-ERはOSERs内に拡散して自由であることを示した、それが&lt;OSERに網状ERから移動し、 その逆もあるという事実/ em&gt;は凝集体が周囲の網状のERと連続していることを示しています。超微細構造解析は、私たちは、ナノスケールレベルでのOSERアーキテクチャと組織の詳細な説明と蛍光データを相関させることができました。OSERsは、常に滑らかなERの対になった嚢のスタックで構成されていますが、このような規則的に正弦波に配置などの空間組織のさまざまな形態を有することができる配列や渦巻き、または六角形の「クリスタ」管状の配列。これらの再配列は、それらが生理学的条件下9および10低酸素症、薬物治療11、および癌9として以下の応力下で細胞中に見出されているように、超微細構造のマーカーとして大きな可能性を有していてもよい立方晶の形態8に導く。 GFP融合タンパク質を使用して、この最初の実証の後、我々は薬理学的治療12、ASSEに応答してERドメインの増殖を分析するためにイメージング実験を用いカテゴリーセル13にオリゴマー化するため、およびその病原1,8に関連し得るER由来の細胞内凝集体の形成における変異、ALS TA-結合タンパク質の役割を調べるために蛍光タンパク質の傾向。これは、（多くの神経変性疾患において生じる14）は、細胞内凝集物の形成が毒性変異体タンパク質及び周辺セル構成要素15との間の相互作用を防止するように設計された保護メカニズムであり得ることが示唆されている。 以下は、そのC末端疎水性ドメインはERの膜に挿入され、それらの動的挙動の解析およびERドメインに対するそれらの過剰発現の効果を調査するための構築物の光学および電子顕微鏡法の組合せの説明である培養細胞におけるアーキテクチャ（実験プロトコルのフローについては図1を参照）。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) w/o phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31053028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-Glutamine 200 mM solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus Transfection</td>
			<td>PP10110</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>OxyFluor</td>
			<td>Oxyrase Inc.</td>
			<td>OF-0005</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glutaraldehyde Grade I</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium Cacodylate Trihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0250</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Osmium Tetroxide 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Uranyl Acetate dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>73943</td>
			<td>slightly radioactive</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene Oxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>82320</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EPON embedding medium kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lead Citrate </td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>17800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bench top centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415 D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spectral Confocal Microscope </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Microscope Cage Incubation System </td>
			<td>OkoLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ultramicrotome </td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>UC6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Diamond knife </td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45 &deg;</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Transmission Electron Microscope </td>
			<td>FEI</td>
			<td>Tecnai G2</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad Software, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>steel culture cell chamber for 24 mm coverslip</td>
			<td>Bioscience Tools</td>
			<td>CSC-25</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electron Microscopy grids</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>G300Cu</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

visualization of endoplasmic reticulum subdomains in cultured cells

これらは強烈interorganelle分子のトラフィックにもかかわらず、彼らの独特の構成と機能を保持しているが、真核細胞での脂質とタンパク質が連続的に、細胞区画間で交換される。このホワイトペーパーに記載されている技術は、 生体内とその生理的な環境で、タンパク質や脂質の移動と人身売買を研究する強力な手段である。 （FLIP）の光退色で（FRAP）の光退色後の蛍光回復および蛍光損失が広くエキソ - エンドサイトーシス経路、オルガネラまたはサブコンパートメント間の連続性、タンパク質複合体の形成、およびタンパク質局在化を介して細胞内輸送を研究するための生細胞イメージング技術を用いている脂質ミクロドメインに、それらの全ては生理学的および病理学的条件下で観察することができる。これらのアプローチの限界は、主に蛍光性融合タンパク質の使用によるものであり、それらの潜在的な欠点は、過剰発現アーチファクトを含む細胞内のイオンと、タグ付きおよび天然のタンパク質のフォールディングおよびローカリゼーションの違いの可能性。最後に、光学顕微鏡（約200nm）の解像度の限界としてストレス下の細胞に由来することができERまたは特定のサブコンパートメントの微細構造の調査を許可していない（ すなわち低酸素症、薬物投与、膜貫通の過剰発現ER常在性タンパク質）または病理学的条件の下で、我々は超微細で培養されたトランスフェクトされた細胞の生細胞イメージングを組み合わせることは、透過型電子顕微鏡法に基づいて解析する。

図2は、タンパク質の移動の例FRAP研究を示しています。 dは EGFP-ERタンパク質の移動度は、漂白OSERsに光退色後蛍光回復急速によって実証される。定量分析のために、半分の時間、モバイル画分は、以下の単一指数の式を当てはめることによって実験的に測定されたデータから導出された。 F（T）= F ポスト +（F REC-Fポスト ）（1-E...

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Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

visualization-of-endoplasmic-reticulum-subdomains-in-cultured-cells

Research

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Biology

12.9K ビュー.  Fondazione Filarete. 私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。 

ビデオ: Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

カウントと培養細胞の生存率の決定

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

生物学

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

マウスにおけるカハール（ICC）ネットワークの間質細胞の可視化

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

培養細胞からの染色体の準備

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

培養中の細胞小器官輸送<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;細胞：S2細胞ラインと一次ニューロン。

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

ライブ初代細胞におけるG3BPストレス顆粒動態の可視化

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

培養哺乳動物細胞での超並列レポーターアッセイ

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the large size of the human BRCA2 protein (approximately 390 kDa). We report modifications of standard siRNA transfection and immunoblotting protocols to silence human BRCA2 and detect endogenous BRCA2 protein, respectively, in human epithelial cell lines. Key steps include a high siRNA to transfection reagent ratio and two subsequent rounds of siRNA transfection within the same experiment. Using these and other modifications to the standard protocol we consistently achieve more than 70% silencing of the human BRCA2 gene as judged by immunoblotting analysis with anti-BRCA2 antibodies. In addition, denaturation of the cell lysates at 55 &#176;C instead of the conventional 70-100 &#176;C and other technical optimizations of the immunoblotting procedure allow detection of intact BRCA2 protein even when very low amounts of starting material are available or when BRCA2 protein expression levels are very low. Efficient silencing of BRCA2 in human cells offers a valuable strategy to disrupt BRCA2 function in cells with intact BRCA2, including tumor cells, to examine new molecular pathways and cellular functions that may be affected by pathogenic BRCA2 mutations in tumors. Adaptation of this protocol for efficient silencing and analysis of other &#39;large&#39; proteins like BRCA2 should be readily achievable.

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

のサイレンシング<em&gt; BRCA2</em&gt;ヒト培養細胞における新規BRCA2-調節される生物学的機能を同定するために、

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...