とボストン小児病院で心臓伝導基金への拠出、この作業は、研究の国立衛生研究所からの補助金（HL088206 HL068915）によってサポートされています。

パート1：準備のソリューションと分離された灌流心臓システム<ol><li>以前に[5、6]を説明するように実験の朝に、クレープス-ヘンゼライト溶液の4.0 Lが用意されています。 </li><li> 11ミリモル/ L 2,3 - ブタンジオンmonoxime（BDM）は手順1.1で作成した灌流液からデカントクレープス - ヘンゼライト溶液の1.0 Lに溶解させる。 </li><li>クレブス - ヘンゼライトの追加の150mLの手順1.1で作成した灌流液から除去し、5モル/ Lジ- 8 - ANEPPS（ジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した10ミリモル/ Lストックから希釈）と混合される。 </li><li> 5％のCO 2ガスを、これらの3ソリューションは、それらが41.0℃に予め温めておいたし、0.2μm、フィルタ処理された95％O 2を用いて水中バブラー（ラド）と酸素化されている水ジャケット付きガラスリザーバー（ラド）に転送されます。 3ストック貯水池からのソリューションは、MasterFlex™L / S蠕動ポンプと低吸収シリコーンチューブ（コール - パーマー）と壁掛けランゲンドルフシステムに圧送されています。 </li><li>組立て前に、ランゲンドルフシステムガラス製品（ラド）は細心の注意を払って、E - TOXA - CLEAN試薬（Sigma - Aldrich社）で洗浄し、徹底的に0.1 M / LのHCl、100％エタノール、蒸留水でリンスする。 </li><li>非循環ランゲンドルフ装置は、水ジャケット加熱コイルとバブルトラップ（ラド）[7]で心臓から分離される3つの別個の酸素貯蔵所、約70ミリメートルHg定圧を提供するために構築した。 3つの独立した灌流ラインは私達が正確に1.3〜ステップ1.1で作成したソリューションの配信を制御できるように、2つの3ウェイコックで心臓の上に収束する。水ジャケットガラス製品はMasterFlex PharMed BPTチューブ（コール - パーマー）と直列に接続し、℃の蒸留水で2 E100サーキュレータ（ラウダ）を使用して39に加温する。加熱コイルとバブルトラップに圧力ヘッドタンクを接続する白金硬化シリコンチューブ（コール - パーマー）による熱損失は、37℃灌流液が心臓に到達するまでになりました。 </li></ol>パート2：収穫ラットの心臓とセットアップランゲンドルフ灌流<ol><li> 200〜250グラムのルイスラットで深い全身麻酔を誘導するために、100 mg / kgのケタミンおよび10 mg / kgのキシラジンを腹腔内腔に注入される。この混合物に、我々は、植手順の実行中に血液凝固や心筋虚血を防ぐために、500 U / kgのヘパリンを追加します。 </li><li>心臓や大血管へ簡単にアクセスするには、前胸壁が削除されます。その後、周囲の組織は注意深く切開し、心膜袋が開かれます。 </li><li>下大静脈の同定に続いて、この容器は、5から0絹（エチコン）と連結されており、全体の心肺ブロックは、外植されています。組織はすぐに氷上に50 mLのビーカーに含まれる氷冷クレブス - ヘンゼライト溶液中に配置されます。 </li><li>上行大動脈を素早く特定し、周囲の組織から解剖される。適切なサイズのカニューレは、（ハーバード装置）大動脈基部に遠くカニューレを挿入することによって冠状動脈の義務灌流を中断しないように注意しながら、大動脈に挿入されます。カニューレは、5から0絹（エチコン）で上行大動脈に固定されている。 </li><li>ラットの心臓は、カニューレ内に気泡を導入することなく、ランゲンドルフ装置上に配置されます。逆行性冠血管灌流は、現在のステップ1.6に説明した圧力ヘッドから暖かい、酸素クレブス - ヘンゼライト溶液を用いて確立されます。 </li><li>肺を含む余分な組織が、、今削除され、心臓は、機能の回復を可能にし、リズムを安定させるために20分間灌流される。この時間の間に、非常に薄い熱電対温度プローブ（コール - パーマーは）左室内腔に導入し、5から0 Prolene縫合糸（エチコン）で所定位置に縫合。プローブは、心臓の温度が水の循環ポンプの設定を調整することによって37℃に維持されるようにサーモコントローラー（Digi - Keyはセンス）に接続されています。心尖​​部から滴り落ちる灌流液からの動きは、排水容器にガーゼを配置することによって最小化されます。 </li></ol>パート3：電位差色素で心臓をロードし、電子写真、光信号を取得する<ol><li>ジ- 8 - ANEPPS（Invitrogen）を三方活栓を用いて蛍光色素を混合したクレブス - ヘンゼライトを含む灌流ラインに切り替えることで、心臓にロードされます。さらに、18Gカニューレは、左及び/または右心房に配置され、それらが十分に冠状動脈を介して導入された染料で灌流されていないため、色素溶液の追加の50mLを徐々にこれらのチャンバーのそれぞれに投与される。 </li><li>ロード手順3 ECGのリード線（ハーバード装置）の間に穏やかにマッピングするのに使用される光学系を向いていない心臓の表面に配置されます。電極N O 1は、後部尖左心室の一部、N左心房のO 2、およびN上に位置している<su<html>大動脈基部（図1）の参照電極としてp&gt; O 3。心房と心室の電子写真信号はその後、増幅、デジタル化、およびソフトウェア（留年選手イメージング）（図2）を用いた光信号の横に表示されています。オシロスコープ（テクトロニクスモデルTDS 1002）もリアルタイムで表面ECGのを視覚化すると、適切なペーシングを保証するために使用されます。 </li><li> ECGアンプ（ヒューゴサックスElektronik社）の設定：ハイパスフィルター：0.1 Hzの ローパスフィルタ：150Hzの</li><li> CMOSカメラ（留年選手イメージング）とmacroscopeは、心臓の表面に焦点が合っていると買収のフレームの中央になるようにXYZの調整を使用して配置されている。カメラと光学系は共振周波数を最小限に抑えるために（マイナスKテクノロジー）防振テーブル上に搭載されています。それと同時に、同軸ペーシング電極（ハーバード装置）は、隔離された、S48電気刺激装置（グラス）で制御右心房上に配置され、心臓は毎分300ビート（図1）でのペースです。 </li><li>電気刺激（グラス）の設定： レート：1秒あたり5パルス ディレイ：0.2ミリ秒 期間：2ミリ ボルト：6月12日V モード：リピート パルス：シングル</li><li>収縮からのモーションアーチファクトを欠いている光学録音の場合、心臓に電気機械的に非結合する必要があります。我々は再び11ミリモル/ LのBDMを含むクレブス - ヘンゼライト溶液に灌流ラインを切り替えることによってこれを行います。買収の間に、心臓は、準備の生存を守るために純粋なクレブス - ヘンゼライトで灌流される。 </li><li>記録パラメータは、次の買収の設定でソフトウェア（留年選手のイメージング）を使用して設定されます。 設定：2,000 Hzの、128 × 128ピクセルの配列 フレームの間隔：0.5ミリ秒 カメラのアンプ利得：5倍 オンチップゲイン：8X - 12Meウェル シャッター：500ミリ秒の遅延 フレーム数：4000 期間：2000ミリ秒</li><li>すべてのお部屋と設備のライトがオフになっているか、録音中にバックグラウンドノイズを除去するためにシールドされています。 LEDライトは光退色と色素の毒性を軽減する唯一の光記録中に、心を照らす。光源のシャッターは、コンピュータのD -対基板（留年選手イメージング）の方法でコントロールパネルを介して配信5 Vのパルスで制御されます。 </li></ol>パート4：赤シャツ党員のイメージングソフトウェアを使用して取得する情報を分析<ol><li>買収後、データが異なるフィルタ設定を使用して処理されます。我々は一般的にバンドが44.0で左の境界と98.0で右の境界に設定されているフィルタを、ストップ/合格調整する場合を除いてデフォルト設定を使用します。その後記録された情報が処理され、ムービーが（留年選手の画像）が生成されます。 </li><li> 1回の収集からのデータは2秒の期間にわたって心臓の表面上の16384のサイトで地元の電気的活性化に対応しています。ソフトウェアは、これらのローカル信号を直接互いにと心房と心室の電子写真記録と比較することができます。データは、色に地元の電気的活性化をマッピングし、心臓の表面上に時空間の電気的活性化を示すアニメーションとしてこの情報をレンダリングにより可視化です。このようなアニメーションを作成するために、我々はソフトウェアを使用します。 <ul><li>時間的および/または空間的にデータをフィルタ</li><li>アニメーションの開始時刻と終了時刻を選択</li><li>各ピクセルの静止光強度に基づいて、色にマップされた光信号</li><li>心臓の絵と結果の色のデータをオーバーレイ</li><li>アニメーションを生成する</li></ul></li></ol>パート5：代表的な結果灌流心臓標本の記録中に静止していた場合、光信号は、ジ- 8 - ANEPPSの発光強度の変化に関係するすべてのピクセルの1つの異なるピークを示す。対応する動画（図3および4）心臓の心外膜面だけでなく、同​​時に取得した電子写真記録（図2）を介して伝播する励起波の前面を示す。 <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="図1" /> 図1。ランゲンドルフ灌流心臓標本の写真は、右心房のペーシング電極の位置を描いたとECGは、ステップ3.2で説明つながります。 <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="図2" border="0" /> 図2。灌流ルイスラットの心臓からの代表的な光信号と電子写真記録。パネルは、光学イメージングに使用心外膜面の像を示しています。パネルBの時間をかけて蛍光発光の変化を示すために選択した画素の位置は、色付きの矢印で示されている。電子写真の信号は心房興奮及び心室の信号に対応するライトブルーのラインを示す赤い線とパネルCに示されています。してくださいve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg&quot;&gt;この図の拡大バージョンを見るにはここをクリックしてください。

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction.">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li><li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution.">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li><li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system.">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li><li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling:+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha.">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li></ol>

動物実験は、ボストン小児病院での動物実験使用の委員会が定めるガイドラインおよび規則に従って行った。

麻酔ラットから心臓の除去は、心筋虚血を避けるために迅速に実行する必要があります。虚血または不十分な冠灌流が発生した場合、心臓はおそらく不整脈を開発し、梗塞になることがあります。さらに、これらの心は有益なレコーディングとその後の分析のための不十分な蛍光発光が表示されます。色素をロードする前に、心筋細胞は電気的な刺激の安定のための生理的電解質の環境を確?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CardioCMOS-SM128f</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CardioPlex Software</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LUXEON LED Light Source 460-490 nm </td>
<td>Equipment</td>
<td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td>
<td>LXHL-PB02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>730149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic Mirror 505 nm</td>
<td>Equipment</td>
<td>Semrock, Rochester, NY 14624 USA</td>
<td>FF505-SDi01-25x36</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Emission Filter 605 nm Long Pass</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>THT Sideways</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA</td>
<td>25 BM-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Ball Joint Holder</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Stimulation Electrode Set</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform</td>
<td>Equipment</td>
<td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td>
<td>25 BM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monopolar ECG Electrode</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump SCI 400</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>401U/D1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump MasterFlex Easy Load II</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>Model 77201-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing Marprene #14</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>902.0016.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MasterFlex Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td>
<td>06485-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S48 Square Pulse Stimulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model SIU5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA </td>
<td>120142-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Heating Coil</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>158822</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compliance Bubble Trap</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>130149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Disconnect Cannula</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>72-1444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 72-2630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocouple Thermometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>WU-91100-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe </td>
<td>Equipment</td>
<td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td>
<td>IT-24P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td>
<td>Equipment</td>
<td>Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA</td>
<td>TDS 1002B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione monoxime </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA</td>
<td>RL-0065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Lloyd Inc., Iowa 51601 USA</td>
<td>LB15705A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-TOXA-CLEAN&reg;</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA </td>
<td>E9029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA</td>
<td>D-3167</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical mapping of langendorff-perfused rat hearts

電位感受性蛍光色素による心臓の表面の光学的マッピングは、実験モデルでの電気的励起を調べるために重要なツールとなっているその細胞培養物からの全体の臓器へのスケールの範囲<sup&gt; [1、2]</sup&gt;。最先端の光学イメージングシステムを使用して、正常な心臓のリズムの間にまたは不整脈の開始と維持を通して活動電位の発生と伝播はほぼ瞬時に可視化することができます。<sup&gt; [1]</sup&gt;。最新の市販のシステムは非常に高い時空間分解能で情報を提供することができますし、当初より、従来の電気生理学的方法によって課される障害を克服するために開発された特注の機器に基づいていた<sup&gt; [1]</sup&gt;。高解像度と高速相補型金属酸化膜半導体（CMOS）カメラと極度に明るい、発光ダイオード（LED）だけでなく、電位感受性色素、光学、およびフィルタの進歩は、電気信号​​の取得を行うために始めているより多くの顕微鏡での作業に慣れている心血管細胞の生物学者のための実用的。 CMOSカメラの最新世代は、試料調製の種類に応じて、16,384ピクセルのアレイ上にフォトダイオードアレイ、レーザースキャニングシステム、および冷却電荷結合素子（CCDなどの老舗蛍光取得の技術を毎秒10,000フレームを取得することができますが、 ）カメラはまだダイナミックレンジに関しては、信号対雑音比を持ついくつかの明確な利点を持っている、と量子効率<sup&gt; [1、3]</sup&gt;。本研究では、ルイスラットの心臓を灌流した<em&gt;生体外で</em&gt; 37晶質灌流液（クレブス - ヘンゼライトソリューション）°変更ランゲンドルフ装置上にCと。 20分の安定期間の後、心臓を断続的に画像取得時の収縮に関連した動きを排除するために11ミリモル/ L 2,3 - ブタンジオンmonoximeで灌流した。光学マッピングでは、高速応答電位差プローブジ- 8 - ANEPPSと心をロードし<sup&gt; [4]</sup&gt;（5マイクロモル/ L）と簡単には475 ± 15 nmの励起光で準備を点灯。照明の典型的な2番目の期間中に、心の準備から放射される&gt; 605 nmの光は水平macroscopeに接続された高速のCMOSカメラで撮像した。このデモでは、心が分離された電気刺激装置に接続される同軸電極を毎分300ビートでペースだった。同時バイポーラ電子写真記録は、容易に利用可能なソフトウェアを使用して電圧信号と一緒に取得し、分析した。このように、ランゲンドルフ灌流ラット心臓の表面の活動電位は可視化と電子写真の信号に登録することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts at JoVE.com

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

この記事では、電位差色素（ジ- 8 - ANEPPS）を使用してランゲンドルフ灌流ラット心臓の表面に光学的に画像のアクション潜在的な動きに高い時間および空間分解能のテクニックを説明します。

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K ビュー.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. この記事では、電位差色素（ジ- 8 - ANEPPS）を使用してランゲンドルフ灌流ラット心臓の表面に光学的に画像のアクション潜在的な動きに高い時間および空間分解能のテクニックを説明します。

ビデオ: Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

顕微鏡の適切な手入れとクリーニング

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

生物学

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

光学顕微鏡の主要なコンポーネント

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

位相コントラストおよび微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

スモールハーツの半自動光ビート解析

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

ゼブラフィッシュにおける単一の細胞運命のマッピング

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

ハイスループットのアプリケーションのための大人のゼブラフィッシュハーツの回復

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.