この作品は、国立衛生研究所HL44485とHL28607を付与することによってサポートされていました。

倫理の声明：すべての手順を検討し、施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 マイクロピペット、レストレーナー、およびブロッカーの1予備作製<ol><li>引っ張ったときにそのように調整電子プラーを使用して半分にいくつかのきれいなホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを引っ張り、チューブの延伸部分の長さは約1cmであり、2つの半体がいくらか対称的です。テーパーは、 図1の寸法と一致していることを確認してください。マイクロピペット、レストレーナーとブロッカーの両方の半分を使用してください。 <ol><li>ベベル水で浴び0.5μmの研磨紙で空気駆動砥石 30 を用いて、マイクロピペット。それは水平から約30度になるようにマイクロピペットホルダーの角度を設定します。 </li><li>徹底的に先端を通って、シャフトまできれいなアセトンを引っ張るために吸引を使用してマイクロピペットを洗浄し、乾燥させます。 （マイクロピペットを点検ワニ口クリップのマイクロピペットホルダーと接眼レチクルを装着した4×40×目標に小さな直立顕微鏡を用いて図1A）。 </li><li>約50μm、長、長さ/幅の比が3.1〜3.5と腸間膜にタフなコラーゲン繊維に浸透するのに役立ちます鋭くテーパー点であるベベルと先端開口部を持つマイクロピペットを選択します。 </li><li>無塵箱に少し様々なサイズの15〜20マイクロピペットを格納します。 </li></ol></li><li>ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用して、レストレーナーを作ります。平滑末端（ 図1B）を形成するためにマイクロフレームの近くに簡単に引っ張らガラスキャピラリーチューブを保持します。ダストフリーボックス内のいくつかを保管してください。 </li><li>ステップ1.1で調製した引っ張っ毛細管）を使用してmicrooccludersを行います。 （例えば、チューブアダプタを使用して、23G）マイクロフレームの下に引っ張らキャピラリーチューブを握り、ゆっくりと曲げ先端の細い（先端から約4mmに）軸に近い120度の角度を作るために（ <strong&gt;図1C）。作成し、いくつかの格納します。 </li></ol> 2.動物の準備と手術<ol><li>皮下注射を介してペントバルビタールナトリウム（80〜100ミリグラム/キログラム、Sigma-Aldrich社、P3761）と男性（350〜450グラム）または雌性Sprague-Dawleyラット（200〜300グラム）を麻酔。腹腔内注射を使用しないことで腸間膜を保護します。 </li><li>外科的手法と実験プロトコルを通して、必要に応じて補助的な注射（30 mgの/ kg）で麻酔を維持します。つま先のピンチや角膜反射によって麻酔の深さを決定します。実験手順の完了後、ペントバルビタールの過剰投与または麻酔下で飽和塩化カリウムの心臓内注射を介してラットを安楽死させます。 </li></ol> 3.フローマーカーとして使用するためのソリューションおよび赤血球を準備<ol><li> 10 mg / mlの脂肪酸を含むsuperfusateための哺乳類リンゲル液を調製し、灌流解決を制御する（通常は哺乳類リンゲル液無料のウシ血清アルブミン、BSA）。 <ol><li>マイクロピペットチップをブロックする可能性があります小さな粒子を除去するために0.2μmのシリンジフィルターを通して灌流液フィルタ。小さなきれいな容器にフィルタリングします。 </li></ol></li><li> 0.05ミリリットルのヘパリン（千U / ml）を含む小型の注射器に20G針に麻酔をかけたラットの尾静脈から約0.2ミリリットルの血液を描画することにより、赤血球を準備し、約14 mLの哺乳類リンゲル液溶液を含む15mlの遠心チューブに移します。 <ol><li>優しく（7分間最大200×gで約）赤血球をパックする遠心分離機。上清をオフに描画し、リンゲル液中の赤血球を再懸濁。 </li><li>上清3回遠心分離し、除去した後、後で使用するために、チューブの底に詰め赤血球を残します。この手順が正常レベル31の0.1％未満に、最終的な灌流液中の血小板が減少することに注意してください。 </li></ol></li></ol> 4.動物の組織をアレンジトレイ<ol><li>剣状突起にへそ下から麻酔したラットの腹部を剃ります。髪はよく組織の外にsuperfusateを描画するために芯を形成しないように剃った領域（右側に配置されたラットのための）右側の周りに延びていることを確認してください。濡れたガーゼパッドまたは組織でカット毛を削除します。 <ol><li>鈍鋸歯状の鉗子で皮膚を持ち、頑丈なハサミを用いて皮膚を通して（2-3センチ）中心線切開を行います。ファイン（アイリス）はさみを使用すると、腸の損傷を防ぐために、鋸歯状の鉗子で腹壁を持ち上げる、白線を通して同様の切開を行います。 </li><li>動物トレイにその側の動物で、優しくリンゲル液及び鈍鋸歯状の鉗子に浸した綿棒アプリケーター（木の棒）を使用して腹腔から腸を引き出します。腸間膜は腸間膜に触れないように注意しながら顕微鏡で観察するための柱に掛けられるようにウェル組織で腸を配置（potentially鉗子または綿のいずれかで）微小血管を損傷させます。 注：動物トレイ（ 図2A）はプレキシグラスから構成され、（約3ミリメートルの深）組織ウェルを必要とすることができ、光学的に透明な柱（例えば、研磨石英約2cmの直径と高5ミリメートル。）、加温パッド動物の体温を維持するように調整しました。柱の厚さは、目的の作動距離を超えてはなりません。 </li></ol></li><li>腸間膜が接眼レンズを通して見えるように顕微鏡ステージ上の動物トレイを置きます。 </li><li>連続して35〜37℃に維持哺乳類リンゲル液で腸間膜を表面かん流するために重力供給ドリップラインを配置します。 、所定の位置に腸を保持する水分を保持に役立ち、かつ表面から過剰リンゲル液を吸い上げるために、ガーゼパッドを使用してください。流れを調整し、一貫性のあるsuperfusateの厚さを維持するための廃液を吸引します。 </li><li>あるターゲット細静脈微小血管を識別収束流れ下流分岐していないセグメント、真の毛細血管の遠位に一つまたは二つの分岐。分岐していない容器を探す（理想的には、長さが600〜1000μm）の活発な血流と血管壁に付着する白血球の自由を持ちます。 </li><li>顕微鏡視野の中心にテスト微小血管の位置を調整し、選択されたカニューレ挿入部位近くの位置に拘束具を移動します。 </li></ol> 5.ホルダーにマイクロピペットとマウントを記入<ol><li>ただ、カニューレを挿入する前に、灌流液中の赤血球を中断。きれいなホウケイ酸試験管に0.5ミリリットル灌流液にパックされた赤血球の7μLを加えます。注意：1〜3％のヘマトクリットを使用することができますが、一貫性のヘマトクリットが赤血球から放出された任意の物質の一貫性の灌流液の濃度につながります。 </li><li> 23GチューブアダプタとPE 50チューブ（5-15センチの長さ）を1mlシリンジを取り付けます。注射器に赤/灌流液細胞混合物を描画します。ミックスし、チューブからすべての気泡を排出するために注射器を逆さにし、アダプタ。効率向上のために、実験開始前のいくつかの注射器に、フィットチューブと埃のない箱やビニール袋に保管してください。 </li><li>それはテーパ領域に当接するまでマイクロピペットの大端部にチューブを前進させることによって、マイクロピペットを埋めます。マイクロピペットチップを埋めるために、シリンジプランジャに優しい迅速なプッシュを適用します。注：小さなストリームまたは液滴が完全な充填を証拠する先端に表示されるはずです。 </li><li>静かにマイクロピペットシャフトの広い部分を埋めるために、プランジャーを押しながらチューブを撤回。慎重にマイクロピペットシャフトをフリックすることにより、広いシャフトの小さな気泡を除去。注：同様の手順32に示されています。 </li><li>水圧力計への連続的な流体接続を可能にするサイドポートを備えたピペットホルダーにマイクロピペットを置きます。マイクロピペットの非常に微細な進歩を制御するために使用される油圧ドライブに接続されているホルダは、わずかな角度（15〜25°）であることを確認します水平にマイクロピペットのテーパーのエッジは、腸やトレイに当たらないようにします。 </li><li>試験容器（ 図2）に近い位置合わせを可能にするためにx、y、zのドライブが可動マイクロマニピュレーター、上油圧ドライブをマウントします。 </li><li>約40 CMH 2腸間膜上記Oに圧力計の水柱内の流体の高さを変更するために、注射器や水を充填したゴム球を用いて、マイクロピペット内の流体に適用される静水圧を調整します。 </li><li>ピペットを充填した後、できるだけ早く微小血管にカニューレを挿入。約40分後に非常に少数の赤血球が血管内に流入するように、赤血球は、ピペットの底に沈殿。 </li></ol> 6. Microcannulationと微小血管の圧力測定<ol><li>顕微鏡下で満たされたマイクロピペットを配置する前に、そっと握りに組織を十分な力を付与する微小血管の近くの組織に拘束具を押してください。ドロー拘束後、腸間膜コラーゲン繊維の応力を容器に整列されるように、わずかに微小血管に沿って組織を伸ばします。 <ol><li>容器をマイクロピペットの位置を合わせ、接眼レンズを通してビューにそれを下げます。選択したカニューレ挿入部位のすぐ上流の先端を置き、それが部分的に血管内の流れを阻害するが、それを閉塞しないように、組織上にそれを下げます。 </li></ol></li><li>油圧ドライブを使用して血管内腔にゆっくりとピペットチップを駆動することにより、血管にカニューレを挿入。容器の下側を通ってプッシュしないように注意してください。 注：マイクロピペットは、内腔に入ると、灌流液が急速に内腔の外に血管内の血液を洗浄し、自由に灌流液下流の血管中の正常な血液灌流の一部を移動させる、テスト微小血管に動物の循環遠位に流れ込みます。 </li><li>示されているように（血液まで、圧力計を調整することにより、灌流圧を下げます灌流セグメントに引き戻されている）動物の赤血球によります。これは、赤血球を穏やか血管腔に振動バランス圧を決定し、微小血管セグメントの遠位端に微小血管静水圧力（P C）を測定します。このバランス圧力以上のすべての圧力で血管灌流を維持します。 </li></ol> 7. Microocclusionとデータの収集<ol><li>オプションの手順：先端が繰り返さマイクロ中の実験容器を保護する組織の微パッドが蓄積するように遠い任意の容器から腸間膜の未使用領域における組織にそれを押して、血管をブロックするために、マイクロ閉塞器を使用する前に閉塞。 </li><li>顕微鏡視野の下縁部の近くに灌流容器の上にブロックを配置します。 </li><li>ビデオとオーディオを次のように記録します。 <ol><li>接眼レチクル上に見られるように口頭でブロック部位の位置と下画面の端を記録します。 </li><li>先端でただ微小血管の上方に配置されたブロッカーの、容器内の流れが閉塞されるまで、そっとブロッカーを低下させるためにマイクロマニピュレータの細かいZコントロールを使用します。オーディオの圧力計の圧力（P cを）注意してください。 3-10秒間、通常、閉塞を適用し、その後放し、自由な灌流を復元します。時間に基づいて5〜10ミクロンのステップでピペットの先端に向かって血管までブロックサイトを移動します（&gt;サイトの最初のブロックの後5分）閉塞の、番号（3-5）、ブロックサイトで血管壁の損傷を防ぐために。 </li></ol></li></ol> L pのデータと測定の8解析（透水） <ol><li>ビデオの再生時には、ステージマイクロメーターと画像上の既知の位置の画像を用いて閉塞部位にマーカー赤血球から初期距離（ℓ0）を決定します 。記録画像の3-10秒の間にいくつかのフレーム内の位置からマーカーセルの初期速度（dℓ/ dt）を決定します。阻止します鉱山閉塞時に撮影した画像から血管の半径（R）（ 図3）。 </li><li> （dℓ/ dt）は、各閉塞するためのJ V / Sを算出×（1 /ℓ0）×（R / 2）。駆動圧で割った（JのV / S）などの一定の圧力で、L pを計算する（微小血管の圧力-効果的なコロイド浸透圧、ディスカッションを参照してください）。 </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

L pの計算の詳細。容器が自由に灌流されている間経流体運動が起こるが、それは通常、血管灌流速度の0.01％未満であるため、そのような交換は無料灌流の間に測定することがあまりにも小さいです。しかし灌流は一過性微小血管を閉塞することにより停止したときのように、マーカー赤血球や閉塞部位との間の流体の列が短くなるように、経フロー（ すなわち...

血管系における微小灌流は、通常、直径が40μm未満の血管内にマイクロピペットを介し既知の組成の人工灌流液の流れを制御する確立することを伴います。灌流容器は通常の組織環境内のままで、挿管時に動物の血液を上にして灌流されます。ビデオイメージングまたは蛍光技術の範囲と併せて使用される場合、 その場での微小灌流にこれらのフローのための駆動力が知られており、血管壁の透過性特性があることができる条件下で、微小血管の壁を横切って水と溶質の流れを測定することができます直接評価。さらに、組織（灌流液とsuperfusate）で微小血管の周囲の流体の組成を制御することにより、微小血管の透過性や為替の規制は、電子の多様にさらされる微小血管の壁を形成する内皮細胞を有効にして調べることができますxperimental条件の時間の正確に測定期間（時間秒）のために（アゴニスト、修正された灌流条件、蛍光指示薬は、細胞内の組成およびシグナル伝達を測定します）。加えて、障壁を調節する重要な細胞の分子構造の超微細または細胞化学的評価は、透過性が直接測定されるのと同じ微小血管に調べることができます。アプローチは、それによって、培養内皮細胞単層および無傷の微小血管における調査に内皮バリア機能を変更するための細胞および分子メカニズムの調査の間にブリッジを形成しています。さらなる評価1-6については、以下のレビューを見ます。 微小灌流の制限は、それだけで、薄く透明であり、ガラスマイクロピペットでのカニューレ挿入を可能にするのに十分な構造的完全性を有している微小血管床で使用することができることです。初期の研究は、腸間膜と薄い皮膚狭心症Mにカエルの微小血管を使用している間7,8 uscle、はるかに哺乳動物のモデルの中で最も一般的に使用される製剤は、ラットの腸間膜9-15です。ほとんどの調査は1-4時間の期間にわたって研究し、血管透過性の急性変化に焦点を当ててきたが、より最近の研究は、初期灌流12,16の後に個々の容器での測定に24〜72時間を拡張されています。血管透過性の調節17を研究するためのより多くの遺伝的に改変されたラットモデルを利用できるようにすることを約束し、最近開発されたCRISPR技術は、これらの重要な新しいラットモデルで腸間膜の細静脈微小血管に適用されるこの通信に記載されている方法を有効にする必要があります。 方法は、動物の準備と灌流容器に近い位置のマイクロツールに使用される少なくとも三つのマイクロマニピュレーターの両方を保持するために、容器に灌流マイクロピペットを整列させるために十分な大きさの特注の顕微鏡ステージを備えた倒立顕微鏡を必要としますルーメン。例えばXY顕微鏡ステージ（約90×60センチメートル）のカスタムプラットフォームは防錆コーティングで厚さ1cmの鋼板から製造することができます。ステージは、エンジニアリングインデックステーブルまたは水平面内での移動のためにテフロンピラーやボール転送に直角に取り付けられており、サポートされている2つの鳩尾スライドに取り付けられています。典型的なリグ（図2参照）は、血管平滑の単一血管の血流およびヘマトクリット、血液灌流微小血管による局所的酸素運搬、規制を測定するものなど生体内微小循環実験の範囲に使用する顕微鏡や微細位置決め装置と多くの共通点を持っています筋緊張、および全体の循環に注入された蛍光トレーサーの局所的な微小血管の蓄積。18-26 技術の基本的な側面は、微小血管壁の定義された表面積（S）全体の体積流量（JのV）の測定です。達成するためにこれは、本明細書に記載の修正ランディス技術によって、単純な倒立顕微鏡で十分です。小型ビデオカメラは、追加された時間基準と、画像ポートとビデオ信号上に搭載されたビデオモニタに表示され、コンピュータ上のデジタル形態又はビデオレコーダのデジタルまたはアナログ信号のいずれかとして記録されています。微小血管がカニューレを挿入されると、カメラに見える微小血管の一部が挿管を中断することなくユニットとしてステージとマニピュレータを移動することによって変更することができます。 経フローの測定はまた、溶質透過性の測定に使用リグ、蛍光細胞質カルシウムまたは他の細胞機構の比率を監視し、共焦点イメージング6,12,13、などの適切なフィルタを使用して洗練された蛍光顕微鏡を使用して、より詳細な調査と組み合わせてもよいです27。すべての微小灌流アプローチの重要な利点は、同じ容器に、反復測定を行うことができることですこのような静水圧および膠質浸透圧、または炎症状態に血管応答の誘発性変化として駆動力の制御された変化の下で。最も一般的な設計は、第二のピペットで、その後、ベースラインの透過性の状態を確立するために、第一の制御灌流液と赤の細胞懸濁液を充填したマイクロピペットを介して灌流容器と同じ容器に測定透水（のL p）の一対比較であります試験薬剤と灌流液に加えます。複数のカニューレ挿入は、制御ピペットで再灌流後に繰り返しサイクルで可能です。 現在のプロトコルでは、微小血管の壁を越えた水フラックスを記録し、血管壁のL P、そのまま全体の水と溶質のための共通の経路の透過性の有用な指標を測定するために、ラットの腸間膜に小静脈血管のカニュレーションおよび微小灌流を実証内皮障壁。手順が変更されたランディスtechniqと呼ばれています灌流がブロックされた後、経流体の交換の目安として、赤血球の相対的な動きを使用して、元のランディス原理は28に保存されているので、UEが、実験条件（例えば、微小血管壁全体の静水圧およびアルブミン膠質浸透圧の差）の範囲微小灌流後に使用可能にuncannulated血液灌流微小血管8,29に比べてはるかに大きいです。

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td></tr><tr><td>narrow diameter, long working distance objective: example</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&amp;times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td><td>welding shop</td><td></td><td>this should be heavy to reduce vibration</td></tr><tr><td>Unislide x-y table: dove tail slides</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD video camera: example</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (no longer available)</td><td>no color needed</td></tr><tr><td>video capture system with audio--generic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>small microphone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (no longer available)</td><td></td><td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td></tr><tr><td>hydraulic probe drive, one way</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>need to buy either manual drive or electronic drive</td></tr><tr><td>manual drum drive&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>or hydraulic drive, 3 way</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td><td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td></tr><tr><td>connectors/rods/holders</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>pin vise</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>to hold restrainer</td></tr><tr><td>pipette holder</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>water manometer ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPE TRAY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>custom</td><td>&amp;nbsp;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td></tr><tr><td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>medical adhesive for tissue well</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&quot; L x 2&quot; W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td></tr><tr><td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MANUFACTURE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vertical pipette puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 with nichrome filament</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td><td></td><td></td><td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Machine</td><td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; with ceramic sharpening disc</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>use &quot;as is&quot; or attach lapping film</td></tr><tr><td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td><td>3M</td><td>part no. 051144 80827</td><td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

個別灌流微小血管の透過性を測定するための実験は、培養内皮細胞単層全体微小血管床の機能交換特性における血管透過性を調節する分子・細胞メカニズムの調査の間のブリッジを提供します。カニューレを挿入し、ラット腸間膜の細静脈微小血管を灌流し、微小血管壁の透水係数を測定する方法が記載されています。必要な主要機器は、3つの異なるマイクロツールを配置するためにマイクロマニピュレーターをサポートし、大きな修正段階で生体顕微鏡含まれています：微小血管にカニューレを挿入し、潅流する（1）面取りガラスマイクロピペットを、 （2）ガラスマイクロオクルーダ一過かん流を遮断し、測定された静水圧で経水流の運動の測定を可能にし、（3）鈍いガラス棒は、カニュレーション部位で腸間膜組織を安定化させることにします。修正されたランディスマイクロ閉塞techniqUEは、微小血管を横切るように、これらの実験条件は変更される流れと静水圧とコロイド浸透圧の差の繰り返し測定を慎重に制御される可能も経流体運動のマーカーとして人工灌流液中に懸濁させた赤血球を使用し、。第一制御灌流液を使用して、透水係数の測定、試験灌流液と同じ微小血管の再挿管後に、これらのよく制御された条件下での微小血管応答の一対比較を可能にします。なぜなら、マウスの腸間膜に長いストレートと分岐していない微小血管の不在で厳しく制限された血管透過性を変更することが予想遺伝子改変マウスでの腸間膜に微小血管にメソッドを拡張しようとしますが、使用して、同様の遺伝子改変ラットの最近の可用性CRISPR / Cas9技術は、本明細書に記載の方法を適用することができる研究の新しい分野を開くことが期待されます。 </P&gt;

図4は、4つの灌流液で連続的にカニューレを挿入微小血管細静脈ラットにL Pにおける変化の時間経過を測定し結果を示す。33定圧で算出さL pの大きさは、微小血管壁の透過性の変化の指標として使用された、第一容器を10 nMのBkのを含む第二のマイクロピペットを用いて炎症剤のブラジキニン（BK）に暴露したときに1％ウシ血清アルブミンを含有する灌流?...

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Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K ビュー.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

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Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

自動ワイヤの筋運動記録法を用いた腸間膜動脈の収縮と弛緩の研究

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

医学

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

アン<em&gt; ex vivoで</em&gt;メソッド培養ラット腸間膜微小血管ネットワークのタイムラプスイメージングのための

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

発生生物学

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

ラット間膜の血管新生アッセイ

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

生物学

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

ラット腸間膜具象化：血管新生に関与する細胞のダイナミクスを調べるためのモデル

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

分離抵抗性ラットの動脈のビデオ顕微鏡を用いた血管制御機構の評価

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

免震を用いた消化管ホルモン分泌のメカニズム潅流ラット小腸

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, such as gastric dilatation volvulus (GDV), mesenteric torsion, and colic, are observed in animals such as dogs and horses. An initial interruption of blood flow causes tissues to become ischemic. Although necessary to salvage viable tissue, subsequent reperfusion can induce further injury. The main mechanism responsible for IRI is free radical formation upon reperfusion and reintroduction of oxygen into damaged tissue, but there are many other components involved. The resulting local and systemic effects often impart a poor prognosis. 
Intestinal IRI has been the subject of extensive research over the past 50 years. An in vivo rodent model in which the base of the superior mesenteric artery (SMA) is temporarily ligated is currently the most common method used to study intestinal IRI. Here, we describe a model of intestinal IRI utilizing isoflurane anesthesia in 21% O2 medical air that yields reproducible injury, as demonstrated by consistent histopathology of the small intestines. Tissue injury was also assessed in the colon, liver, and kidneys.

We describe how to generate a widely used surgical model of intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) in rodents. The procedure involves occlusion of the superior mesenteric artery followed by the restoration of blood flow. This model is useful for studies investigating occlusive causes of intestinal IRI in both veterinary and human medicine.

上腸間膜動脈閉塞による腸虚血再灌流傷害のげっ歯類モデル

Intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI) is associated with a myriad of conditions in both veterinary and human medicine. Intestinal IRI conditions, ...

<meta charset="utf8"></head><body>内臓臓器灌流研究のためのラットモデル

Controlled Reversible Visceral Arterial Ischemia, Venous Congestion and Combined Malperfusion via Midline Laparotomy in Rats

Besides sepsis and malignancy, malperfusion is the third leading cause of tissue degradation and a major pathomechanism for various medical and surgical conditions. Despite significant developments such as bypass surgery, endovascular procedures, extracorporeal membrane oxygenation, and artificial blood substitutes, tissue malperfusion, especially of visceral organs, remains a pressing issue in patient care. The demand for further research on biomedical processes and possible interventions is high. Valid biological models are of utmost importance in enabling this kind of research. Due to the multifactorial aspects of tissue perfusion research, which include not only cell biology but also vascular microanatomy and rheology, an appropriate model requires a degree of biological complexity that only an animal model can provide, rendering rodents the obvious model of choice. Tissue malperfusion can be differentiated into three distinct conditions: (1) isolated arterial ischemia, (2) isolated venous congestion, and (3) combined malperfusion. This article presents a detailed step-by-step protocol for the controlled and reversible induction of these three types of visceral malperfusion via midline laparotomy and clamping of the abdominal aorta and caval vein in rats, underscoring the significance of precise surgical methodology to guarantee uniform and dependable results. Prime examples of possible applications of this model include the development and validation of innovative intraoperative imaging modalities, such as Hyperspectral Imaging (HSI), to objectively visualize and differentiate malperfusion of gastrointestinal, gynecological, and urological organs.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:生理学的組織および灌流不良組織のスペクトル特性評価の促進

This article introduces a standardized procedure for controlled, reversible malperfusion of visceral organs in rat models. The aim is to induce these malperfusion states with a high degree of methodological certainty and control while maintaining technical simplicity and error resilience.

ラットの正中開腹術による可逆性内臓動脈虚血、静脈うっ血、および複合灌流不良の制御

Besides sepsis and malignancy, malperfusion is the third leading cause of tissue degradation and a major pathomechanism for various medical and surgical ...