ほとんどの研究のための財政支援は、スウェーデンの医学研究評議会（助成金5942）によって提供されていました。

1。動物<ol><li>このようなラット、マウス、およびモルモットなどの小齧歯類は、動物モデルとして使用されている。残念なことに、成体マウスでは、（多くのマウス系統が評価されている）が不足する傾向があるまたは信頼性の低いマウスを用いた研究を行う彼らの腸間膜窓内電位親血管（血管新生の起源となりうる）、ののみは非常に低い数値を持っている。このため、アッセイは、主にラット用に開発されています。 </li><li>ブリーダーからの送達後少なくとも7日間の標準環境に順応しているラットは、通常は水とペレットへの無料アクセス、12時間明/暗サイクル下での標準ケージでペアに収容されています。各動物がマークされます。様々なブリーダーから得られた、私たちは、主に若い成人のラット（生後5-6週より若いラットではネイティブ微小血管の数が低くなる傾向がある、典型的に70から10まで様々な菌株の週齢が、通常雄Sprague - Dawleyラット）を使用します。前の実験と実験を通しての期間では、動物は一日おきに秤量し、常に犠牲の日にされています。動物は同時にIP（血管新生を誘導するために、以下を参照）と皮下または静脈または経口治療をしている場合、それらは毎日秤量する。これは、実験の開始時に同じ体重の実験群と対照群の設置が可能となり、実験の過程で体重ゲインに対する治療の影響のモニタリングが可能になります。成体雄ラットは、（株の種類に応じて週当たり約40〜60 gを得る）生理学的に確実に成長するので、体重増加の遅滞は、毒性、全身幸福、食欲不振、および成長障害の敏感な代替マーカーです。 </li></ol>我々は、高標準の動物管理施設で働くとかなりの努力が、動物が経験するストレスのレベルを最小限に抑えるために作られています。現在の倫理ガイドラインは、ワークマンP. らによって確立されたものです。（がん研究における動物の愛護及び使用に関するガイドライン。 臭素。J.がん102、1555年から1577年、2010）。ヨーテボリ大学の動物倫理委員会は、これらの研究を承認した。 2。血管新生促進腹腔内治療<ol><li>テストする候補の血管新生促進因子は、患者の点滴（さらに非常に低レベルで、エンドトキシンが血管新生促進である）のために使用されるエンドトキシンフリーの生理食塩水に溶解し、希釈される。すべてのソリューションは、注射の日、滅菌濾過（ミリポア0.22μmのろ過）に新鮮な構成中性pH（7.1〜7.3）をチェックし、室温で使用されています。 テストエージェントは、低または非常に低い濃度で注入されます。例えば、ラットrVEGF 164（564-RV/CF、R＆Dシステムズヨーロッパ社、オクソン、イギリス）優勢なVEGF -ラットのアイソフォームである、、凍結、エンドトキシンフリーの生理食塩水で96ピコモル/ mlに希釈されそして解凍し、5mlの体積は、ラットへのIP注入されます。我々は腹腔内投与で0.8 mmの針（緑色の針、21G）で5 mlのシリンジを使用してください。 4.5日、 すなわち 1日2回与えられる。、月曜日の朝（0日）から金曜日の朝（4日目）にこの治療法は、、21日目前後をピークに、腸間膜の試験組織で堅牢な萌芽血管新生応答を誘導する。 ソリューションのIPを管理するボリューム全体が腹腔内（としない​​腸、膀胱や他の臓器への）に配信されることを保証します。 5mlの急速な注入は、液体ジェットが腹腔内に腹壁を通過したことをオペレータによって触覚確認することができます。 以下、前のIP血管新生促進治療にまたは同時に、選択した任意のテストエージェントは、全身的に投与することができます。 </li></ol> 3。血管新生調節剤の全身Administation <ol><li> IP治療は炎症の誘導を介して、または可能性の強い血管新生促進反応につながることができるテストの組織、の肥満細胞を活性化することによって、継続的な血管新生反応に影響を与える可能性があるので、IPルート以外のルートは、使用することができます。経口投与または単回注射皮下または静脈内に加えて、我々は多くの場合、最大2つまたは数週間のために一定の速度でソリューションを提供するために浸透圧ミニポンプ（1つ以上の、ボリュームを変え、時代をポンピングで）使用して、SCの管理を使用してください。 </li><li> テストエージェントの持続皮下注入 浸透圧ミニポンプの充填と注入 Alzet浸透圧ポンプ、マウンテンビュー、カリフォルニア州、通常14から15日間5.0μL/ hの一定の排気速度と5日目、 すなわち、IP VEGFの治療の終了後1日、浸透圧ミニポンプ（例えば、モデル2ML2、上、米国）は、テストエージェントまたは適切な車両との無菌条件下で充填される。 37滅菌0.9％（w / v）のNaClを一晩で貯蔵した後° C、ポンプ（s）は外科（脊椎coluの側の背中に皮下に注​​入されるイソフルランガスを（Isoba獣医を使用して麻酔されているラットの肩甲骨の地域におけるMn）、気​​密透明チャンバー内に最初は、シェリングプラウアニマルヘルス、メルク社、ホワイトハウスステーション、ニュージャージー州、米国）とその後、マスクを介して（それが再利用される前に、次の動物に起因するストレスを最小限に抑えるために、チャンバーは、空気でフラッシュされます）。ポンプの注入のために作られた皮膚の切開は、絹糸を使用してすぐに着床後縫合する。 動物は、実験期間中に生理的に体重が増えると、テストエージェントが一定の速度で投与され、体重1kg当たりの試験薬のために選択された実際の用量は、投与期間の開始時の平均投与量よりも高いと低いので注入期間の終了時の平均投与量よりも。 ここで説明するように連続的な注入は、、メトロノームの治療の拡張形式とみなすことができます。 </li></ol> 4。実験の終了<ol><li>一度に一匹が急速に動物を殺すCO 2ガスでフラッシュされる透明な気密室に置かれます。チャンバーは、再び使用される前に空気でフラッシュされます。 </li></ol> 5。収穫組織サンプル<ol><li> DVDに示すように、腹壁が開かれ、小腸腸間膜は、回腸盲腸弁（小腸と大腸の接合部）に達する最も遠位の部分を含めて、識別されます。最も遠位にある&quot;窓&quot;の4つは（またはそれ以上）客観的な基準未処理Superfrostプラス - スライド（DAKOデンマークA / S、グロストラップ、デンマーク）の上に番号が付けられ、広がっています。これは血管のその後の免疫組織化学的可視化を無効にしていないものの、これらの材料は、非特異的に染色されている場合をそれは、血液、腸の内容や他の体液のサンプルを汚染し、可能であれば、避けることが重要です。 </li><li>添付の小腸セグメントと各腸間膜ウィンドウ片をスライド上に広げ、20分間室温で乾燥させる。無傷の膜性腸間膜の標本が長時間-20℃で保存している間にし、腸の切り株は、遮断される。これはDVDに示されています。 </li></ol>それは組織と特許血管が透過光生体顕微鏡を収穫する前に可視化できるという点を考慮する必要があります。 6。血管の免疫組織化学的染色のためのプロトコル<ol><li> 0日目 検体を1時間60℃でキャビネットに乾燥し、室温、に-20℃から融解させ、室温で一晩保持されます。 </li><li> 日1 染色瓶にスライドホルダーを（秒毎のトラックで）染色でスライドを配置し、室温で10分間TBS（pH7.8）中で2回洗浄。解決策は、次のソリューションで、そしてそのすべては、次のステップのために破棄され、置き換えられます。 </li><li> トリプシン処理 トリプシン溶液（25℃20分間）で染色スライドホルダーを抱いているだろう染色瓶を埋める。液を捨て、2.5％ショ糖溶液（各時間10分、室温）で2回インキュベートする。液を捨て、 アクアdestに （数分ごとに、室温）で数回すすぎます。 </li><li> ブロッキング メタノール中のH 2 O 2（30分間、室温）は0.5％の染色スライドホルダーを抱いているだろう染色瓶を埋める。液を捨て、 アクアdestに （数分間、室温）ですすいでください。液を捨て、TBS（pH 7.4）中（各時間8分、室温）で2回すすいでください。 </li><li> インキュベーション すべてのインキュベーションは室温で加湿チャンバーになります。以下のソリューションの各約150μlをスライドごとに使用されています。スライドを湿式チャンバー内に配置され、ソリューションは、標本（非膜部分は、ソリューションでカバーする必要はありません）にピペットでされています。 その後のソリューションが追加される前に、以下のステップのそれぞれについて、慎重にソリューションのすべてを振り落とす。 <ol><li> ノーマル（ブロッキング）血清 （馬）（ABCキット）3 とのインキュベーションでは、 黄色の溶液 / 20分間10 mlの希釈バッファーを廃棄します。 </li><li>ラット血管内皮細胞を標識する一次抗体 ARU0181、 とのインキュベーション 。抗体希釈バッファー（バイオソース）（100μlの希釈は40倍[冷凍]に加えて900μlの希釈バッファー）で1:600​​に希釈し、インキュベーションを4℃で一晩行わ℃をされ</li></ol></li><li> 日2 スライドを湿式チャンバーから除去され、一次抗体は破棄され、スライドが染色瓶に浸漬し、TBSで2回リンスされる染色スライドホルダーに配置されます8分間（pH7.8）中。 <ol><li> ビオチン化抗体とのインキュベーション （ABCキット） スライドを加湿チャンバー内に水平に配置され、 青色の溶液 / 30分間10 mlの希釈緩衝液の1滴でインキュベートする。液を捨て、染色瓶に浸漬染色スライドホルダーにス​​ライドを置き、8分間TBS（pH7.4）で二回リンス。 </li><li> ABC試薬とのインキュベーション スライドは再び加湿チャンバー内に水平に配置され、以下の溶液は、試料の膜の部分にピペットでされています： オレンジ色の溶液を2滴加えて30分間茶色の溶液 / 10ミリリットルTBS（pH 7.4）に2滴。 30分使用する前に慎重にミックス！液を捨て、染色瓶にスライドホルダーにス​​ライドを置き、8分間TBS（pH7.4）で二回リンス。 </li></ol></li><li> DABで染色し（0.05％） このステップは、換気、化学フードで実行する必要があります！ スライドを配置し、3,3 -ジアミノベンジジン（DAB; Sigma - Aldrich）を追加するピペットを使用してソリューション：TBSの0.1％DAB溶液（pH 7.4）[冷凍]10μlのH 2 Oの混合液で1:1に希釈され2と7.5ミリリットルTBS（pH 7.4）に。このソリューションは、（顕微鏡写真を不明瞭にする可能性のある粒子を除去するために）使用直前に滅菌ろ過されています。 8分の試料を染色する。液を捨て、染色瓶に浸漬染色スライドホルダーにス​​ライドを配置する。数分間水道水を流して下にしてから、 アクアdestにすすいでください。 </li><li> 脱水 スライドは染色のスライドホルダーに保持されます。捨てることで、すすぎ、 水をdest /エタノールを入れた染色瓶補充：各溶液中で2分で、 アクアdestに 、70％アルコール、95％アルコール、無水アルコールを。 </li></ol> 7。イメージングと血管内皮細胞の免疫組織化学的染色後の各腸間膜窓標本で微小血管ネットワークの評価として映画に示すように、微小血管を顕微鏡無傷の組織でin situで可視化されています。 <ol><li>最初に、我々は腸間膜ウィンドウごとに（VA）ホワイトペーパーに鉛筆を14から34（ライカワイルドM 3Z）に倍率の範囲をウィンドウ全体の領域だけでなく、全体の血管領域を描画顕微鏡を使用してください。 VAは、全体の面積の割合として、簡単にコンピュータまたは非コンピュータ化された面積測定（または単に切り出すことにより、重みウィンドウ全体の画像、およびそのすべての血管部分の画像）を用いて測定される。 </li><li>別の図面の顕微鏡を使用して、容易に識別される個々の微小血管のプロファイルは、ランダムに選択されたフィールド内の80倍で、白い紙に黒インクで描かれています。これは基本的には微小血管密度の測定である微小長さの、その後のコンピュータ化された形態学的評価（MVL）、のための出発点です。 </li><li>オプションで、微小パターン形成に関連する変数だけでなく、 微小血管芽と個々の微小血管芽 （それぞれ第SPとル。SP、） の長さの数を評価するためのものを求めることができる。 - 描かれた黒い容器の構造間の最適なコントラストと白の背景には、ほとんどの市販の形態計測、コンピューターのプログラムで画像の詳細な分析を容易にします。 </li><li>ほとんどの場合、主要な変数は、 全体の微小血管の長さ （TMVL）を生成掛け合わVAとMVL、です。 </li></ol> 8。統計的分析我々は通常、不対（両側）の観測を分析する標準的なノンパラメトリックMann - WhitneyのU検定を使用してください。動物ごとに4つの腸間膜の窓の平均値は、腸間膜ウィンドウの各変数の独立したデータポイントとして使用されます。統計的有意性の基準は、P≤0.05である。

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	<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+testing+with+angiogenesis+models.">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li><li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast-cell-mediated+angiogenesis:+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery.">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+and+angiogenesis.">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li><li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+meteronomic+chemotherapy:+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A.">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo.">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li><li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp;amp, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF(165)-mediated+angiogenesis+in+the+rat.">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis.">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li><li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dalteparin,+a+low-molecular-weight+heparin,+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo.">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis.">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis.">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

アッセイは、1986年3で導入され、連続してさらに発展し、我々の研究室7,10-12で洗練されています。としてレビュー論文（招待講演）1、2で説明したように、アッセイは、特に成人の試験組織として重要な機能に関してin vivo での血管新生アッセイでは他の哺乳類とよく比較してネイティブに血管化であり、生理的血 ​​管新生を欠いている、最小限の外傷、もしあれば、です。真に定量的な変数が測定され、用量反応および分子活性研究に関する健全な統計的分析を可能にする;組織には強制正常組織と腫瘍で優位なされている、発芽血管新生は、発生、および毒性のデータが簡単に確実に成長ラットに蓄積されています生理的に成人インチそれはマウスのほとんどに適していることと、それはreal-time/serial観察を許可していないこと、不利な特徴は、個々の微小血管のセグメントと微小血管芽の数と長さを評価する場合は特にアッセイは、比較的時間がかかるという事実が含まれる場合がありますマウスでは多くの腸間膜のウィンドウが新たな毛細血管の起源となりうる潜在的な親の微小血管を欠いているので。 リアルタイム観測が、しかし、動物は麻酔のときに体外が無傷の腸間膜の窓が、1で述べたように、顕微鏡のステージ上からスプレイされている生体顕微鏡で有効になっています。 血管新生研究の著しい進歩は有用ですが、最終的に限られたツールであるような角膜micropocket、ニワトリ漿尿膜、およびSCマトリゲルプラグアッセイのようなモデルを用いて過去数十年間で達成されている。抗血管新生と血管新生促進療法の今後の臨​​床応用は、現在のレポートで説明したように、より敏感と生物学的に関連した、真に定量的な前臨床モデルの確立と検証を必要とする。

バッファーと試薬 0.5 Mトリス- HCl（pH 7.8）のストック溶液 トリス（ヒドロキシメチル）aminomethanは（60.57グラム）〜900ミリリットル水をdestに溶解され、25％塩酸（濃縮）の〜45mlをアクアdestが 1リットルに希釈し、次いでpHが7.8を達成するために追加されます。 トリス緩衝生理食塩水（TBS、pH7.8）中 ストック溶液200mlに18グラムのNaClがアクアdestの 2リットルに希釈し、続いてストック溶液を、使用して7.8〜pHの調整に〜1800ミリリットル水をdestに溶解して追加されます。 TBS（pH 7.4）に ストック溶液を200 mlにアクアdestの 2リットルに希釈し、続いてストック溶液を、使用して7.4のpHの調整に〜1800ミリリットル水をdestに溶解中に溶解した18グラムのNaClを追加されます。 トリプシン溶液（0.05％トリプシン、0.1％のCaCl 2） 200ミリリットルTBS（pH7.8）中で0.1グラムトリプシンと0.2グラムのCaCl 2が含まれています。 ショ糖溶液2.5パーセント 200ミリリットルTBS（pH7.8）中に5 gのショ糖が含まれています。 TBSで1％のアジ化ナトリウム（pH7.4）中ストック溶液 TBS（pH7.4）で100mlに1グラムのNa -アジドを含んでいます。 希釈バッファー：0.1％BSA、0.01％のNa -アジド （ベクタステインABCキットで抗体を希釈するのに使用）。 TBS（pH7.4）で100mlに希釈し、0.1gのウシ血清アルブミン（BSA）と1％のNa -アジドの1 mlを含んでいます。 ABCキットステインPK 4002、ABCペルオキシダーゼマウスIgG 正常ウマ血清、血清ブロッキング、 黄色溶液 ：3 drops/10 mlの希釈バッファー。 ビオチン化抗体、抗マウスIgG、 青色溶液 ：1 drop/10 mlの希釈バッファー。 ABC -試薬： 橙色溶液 、2滴加えて褐色の溶液 2 drops/10ミリリットルTBS（pH 7.4）に。 20分使用前にこれらのソリューションをミックス！ マウス（モノクローナル）抗ラット内皮細胞 （バイオソースインターナショナル、カマリロ、カリフォルニア州、米国） <table border="1"><tbody><tr><td>カタログ＃ </td><td> ARU0181 </td></tr><tr><td>クローン＃ </td><td> MRC OX - 43 </td></tr></tbody></table>この抗体は、脳内のものを除いて、ラットではすべての血管内皮細胞に対して向けられている。 ステインペルオキシダーゼアビジンビオチン複合体（ABC）キット キットには、一次抗体、ビオチン化二次抗体、アビジン - ビオチン化酵素複合体（ABC）、および酵素の基質が含まれています。参照してください<a href="http://www.vectorlabs.com/">www.vectorlabs.com</a>または<a href="http://www.immunkemi.se/">www.immunkemi.seの</a>プロトコルのために。 ウシ血清アルブミン （BSA）（Sigma - Aldrich社、カタログ＃- 4503）。 DAB = 3,3&#39; -ジアミノベンジジンIsopac（Sigma - Aldrich社、カタログ＃D 9015）。 ウシ膵臓（Sigma - Aldrich社、カタログ＃T 4665）からトリプシン 。 ステインペルオキシダーゼABC -キット 、マウスIgG（Immunkemi F＆D AB、Jarfalla、スウェーデン）

rat mesentery angiogenesis assay

成体ラットの腸間膜のウィンドウの血管新生アッセイは、生物学的に適切であり、非常によく、in vivoで血管新生を萌芽の研究に適している、ヒト腫瘍および非腫瘍組織における血管新生の支配形態である、として招待レビューで議論[総説を参照してください]論文1,2。血管新生促進因子の腹腔内（ip）注射によって膜性腸間膜の部分に誘導される血管新生は、皮下（sc）、静脈内（iv）または経口（PO）の選択の変性剤による処理によって変調することができます。腸間膜の各膜部分は、それをウィンドウのような外観を与え、半透明や脂肪組織に囲まれています。 アッセイは、以下の有利な特徴を持っています：（i）のテストの組織は、まばらとはいえ、ネイティブ血管形成であり、そしてそれは非常に薄いので、微小血管のネットワークは、ネットワーク全体がその場で顕微鏡的に評価することができるようになる、実質的に二次元であり、（ ⅱ）成熟ラットでの試験組織では、ほとんどの正常な成体哺乳動物の組織を特徴づける重要な生理的血 ​​管新生を、欠けている、ネイティブ血管新生の程度は、、しかし、、1で説明した年齢と相関関係である。外傷誘発性の血管新生の（ⅲ）無視できるレベル高感度を確保、血管新生を調節する試験薬を全身投与し、反応はすべての代謝、携帯電話、および処理による分子変化の正味の効果を反映して観察しているとして（IV）アッセイは、臨床状態を複製すること、（v）アッセイは、それによって、用量効果と分子構造活性相関の堅牢な統計分析を可能にするだけでなく、発芽毛細血管のように、微小空間の拡張、密度、およびネットワークのパターン形成の客観的、定量的、公平な変数の評価を可能に、および（vi大人のラットは確実に成長するにつれて）アッセイは、生理学的な体重増加の減少率で、高感度での治療の毒性または有害な影響を明らかにする。 マスト細胞媒介血管新生は、最初にこのアッセイ3,4を用いて実証した。 （i）は、低用量、多様な、薬物特異的な効果をもたらすmetronomically投与標準化学療法：モデルには含め、投与量 - 効果関係と全身投与化学的または機能的に密接に関連する薬物と蛋白質の測定の効果に関する差別の高レベルを示しています（ すなわち 、血管新生抑制、中性または血管新生を刺激する活動5）、（II）阻害VEGF -介した血管新生6を刺激する自然な鉄飽和ヒトラクトフェリン、、そして自然な鉄不飽和ウシラクトフェリン、VEGF -介する血管新生7、及び（iii）様々な手段8,9によって生成された低分子量ヘパリン画分。さらに、このアッセイは非常に同時または順番に全身投与されている薬剤の血管新生に対する複合効果の研究に適しています。 彼は我々の研究室を訪問し、例示されている方法論を目撃したときにこのビデオを作るというアイデアは、故ユダフォークマンに由来する。 レビュー論文は、（招待講演）議論と分析を鑑定血管新生のin vivoモデルノルビ、K.。 J.セル。モル。メッド。 10、588〜612（2006）。 ノルビ、血管新生モデルとK.薬物検査。専門家Opin。薬。 Discov。 3、533〜549（2008）。

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Rat Mesentery Angiogenesis Assay

生理的な血管新生とそれを欠いている正常な成体血管化哺乳動物の組織を研究するために使用される外科的介入にさらされていません：（i）の開始とテストエージェントの腹腔内投与後の血管新生の開発、との全身投与後の血管新生の（II）修正テストエージェントを選択した。

ラット間膜の血管新生アッセイ

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K ビュー.  University of Gothenburg. 生理的な血管新生とそれを欠いている正常な成体血管化哺乳動物の組織を研究するために使用される外科的介入にさらされていません：（i）の開始とテストエージェントの腹腔内投与後の血管新生の開発、との全身投与後の血管新生の（II）修正テストエージェントを選択した。

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

クリストファーヒューズ：血管新生の研究のためのin vitroモデル（インタビュー）

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

生物学

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

E18ラット脳の器官型スライス培養

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

ランゲンドルフ灌流ラット心臓の光学的マッピング

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

成体ラットの心筋細胞の初代培養

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

ラット腸間膜具象化：血管新生に関与する細胞のダイナミクスを調べるためのモデル

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.