とチューレーン高血圧とNIHの助成金によって賄わエクセレンスの腎センターP20RR017659-08（PI：この作品は、ルイジアナ州LEQSF（2009-12）-RD-A-19（WL Murfee PI）の状態の理事会によってサポートされていました：L.ガブリエルナバー）。

1。外科手術セットアップノート<ol><li>手術前に手術物資や機器を滅菌する。各ラットのための無菌外科手術のために使用される電源は、機器の配置のための滅菌表面のようにレイアウトされるために1ドレープを含む、中央にあるのx 1.5の約0.5プレカット穴付きドレープ1は、ラットの上に配置すると、ガーゼ。ドレープの事前カット穴がラットで行われた切開で整列します。手術に必要な機器は、縫合糸材料をカットするために使用するハサミの1標準ペア、鉗子、縫合糸の処理と把持用穿刺ホルダー、ブレードとメスが含まれています。我々は、特定の手術材料とツールのテーブルに私たちの研究室で使用される一般的なツールを記載しています。しかし、最終的なツールの選択は、実験者の好みに依存しています。 </li><li>手術空間を準備します。確保するために加熱パッドの下に100 mLの0.9パーセント、滅菌生理食塩水バッグを置き、その連絡先wに来る生理食塩水i番目の腸間膜組織は約37にあらかじめ温め℃で生理食塩水の代わりに、リンゲル液または他の生理学的緩衝液を使用することができます。具象化手順の実行中に簡単にアクセスするための滅菌ドレープを滅菌手術器具および消耗品をレイアウトします。また、滅菌綿チップアプリケーターと縫合の適切な3種類（4-0、5-0、および7-0）が必要となります。必ずパッケージには、材料は滅菌処理を使用してアクセスすることができるように事前に開かれていることができます。最後に、少なくとも5分間、100％エタノールに浸漬することにより事前に変更されたプラスチック製のステージを駆除。ステージでは、中央（ 図1）でカット楕円形の穴に100ミリメートルのペトリ皿である。ドレメルツールは、最初に行うと、必要に応じて、穴を広げるために使用することができます。穴が行われた後、カットプラスチックのエッジは、異なる粒子のサンドペーパーを使用して滑らかな作られています。ステージはその後洗浄し、最終的に、不活性粘土（地元の工芸品店から購入）のいずれか、またはsilicされてい接着剤で発生し、滑らかな表面を提供するために、穴の端に追加されます。組織と接触させる前に、ステージでは、十分に滅菌生理食塩水ですすいする必要があります。 </li><li>血管新生のこのモデルでは、我々は、通常、成人の雄Wistarラット（350±25 g）を使用しています。他のラット系統と年齢を使用することができます。当研究室では、ラットはケタミン（80 mg / kg体重）、キシラジン（8 mg / kg体重）、およびアトロピン（0.08 mg / kg体重）を筋肉内注射を介して麻酔する。約5分後、麻酔の効果が確認されており、ラットの腹部皮膚を剃毛されています。 </li></ol> 2。ラット腸間膜具象化モデル<ol><li>体温を維持するために加熱パッドの上に背中に麻酔したラットを置きます。無菌テクニックは外科手術中に使用されます。滅菌手袋を着用し、楽器や消耗品は、ラットの組織以外の非滅菌表面に接触することはできません。 </li><li>ワイプUSIを交互に腹部をきれいにngの70％イソプロピル、ヨウ素に浸した滅菌ガーゼ。 </li><li>手術用メスの刃を使用して、皮膚に沿って小さい（約0.75インチ）縦切開し、胸骨下の白線は約1インチを行います。 </li><li>開口部は切開と揃うように腹部の節以上プレカットドレープを配置します。 </li><li>優しく切開周囲の圧力を適用します。これは通常、それは簡単に識別するための十分な小腸の露出になります。 </li><li>綿チップアプリケーターを使用して、静かに小腸の部分を引き出し、回腸を見つけます。腸間膜が引き出されているとして、それは穏やかにプラスチック製のステージ（ 図2）にレイアウトする必要があります。 </li><li> 6月8日血管腸間膜のウィンドウを識別します。腸間膜のウィンドウが小腸（ 図2）栄養動脈/静脈のペアの間の薄い半透明の膜として定義されています。 </li><li>具象化の開始時間を記録します。 mesenteを残すRYセクションでは、20分間体外。具象化期間の間、断続的に組織を浸漬のままで乾燥させないようにするためのペトリ皿の中で生理食塩水を補充するために無菌の注射器（5 mL）を使用しています。 </li><li> 20分の露光時間の間に、無菌の7から0縫合糸で2中心部に位置する腸間膜窓をマークします。マークは、腸の近くに脂肪領域でなされるべきである。 </li><li>腹腔内に腸間膜の体外領域を返します。 </li><li>中断のパターンで5から0モノフィラメント縫合糸で腹部の筋肉を閉じます。 </li><li>中断のパターンで4から0モノフィラメント縫合糸で皮膚を閉じます。 </li><li> 70％isopropoylとヨウ素に浸した滅菌ガーゼを使用してワイプを交互に縫合エリアを拭いてください。 </li><li>ラットの両眼に眼の潤滑油ゲルを広げた。眼を潤滑の目的は、外科手術と回復の間に角膜の乾燥を防ぐためです。眼潤滑剤の適用が適用されるべきである外科的介入の開始前に。必要であれば、回復のために、そのケージにラットを返す前に目の潤滑剤を再適用します。 </li></ol> 3。組織の収穫と固定<ol><li>利益のポスト刺激の日に、ラットを麻酔し、安楽死させる。当研究室では、ラットはケタミン（80 mg / kg体重）、キシラジン（8 mg / kg体重）、およびアトロピン（0.8 mg / kg体重）を筋肉内注射を介して麻酔しbeuthanasiaの心臓内注射を介して安楽死させています。 Beuthanasiaは、迅速かつ無痛の安楽死のために使用することができますペントバルビタールナトリウム/フェニトインソリューションです。 0.2ミリリットル - ラットあたりの私たちの研究室では、一般的に0.1を挿入します。 </li><li>腹腔内を再度開くと優しく小腸を取り外し、2つのマークの付いたウィンドウを探します。 </li><li>鉗子、マイクロはさみを使用して体外に腸間膜の各ウィンドウを切り取ります。脂肪ごとのウィンドウの境界線を含むことは顕微鏡スライド上に拡散後の組織のために有利である。すぐに、PBSで各ウィンドウを浸す。切断の際、窓の充填潜在的な血を最小限に抑えるために、Windowsの脂肪枠内動脈/静脈のペアを切断しないようにしてください。また、腸の内容の結果がウィンドウに接触することが腸を通り抜ける最小限に抑えることができます。 </li><li>正に荷電した顕微鏡スライド上の組織を広げるために鉗子を使用しています。二つの組織は、スライドごとにマウントすることができます。 </li><li>組織が部分的に乾燥させ、手術用メスの刃を使用して、余分な脂肪を除去することができます。 </li><li>組織は、現在では修正する準備ができました。典型的な固定方法を使用することができます。私たちの研究室では、一般に30分間、メタノール（-20℃）でスライドを修正します。成功した標識は、また未定の組織で行われてきた。固定方法は、好ましい抗体に依存する場合があります。 </li></ol> 4。組織の免疫標識<ol><li>組織は、現在一般的に免疫組織化学用抗体ごとの指示に従って、ラベルを付けることができます。の役割を識別するのに我々の関心を与え血管新生時に血管周皮細胞、内皮細胞および血管周囲細胞のために我々の研究室、一般的にラベル10、12、13。微小血管ネットワークの階層に沿って血管内皮細胞を識別するための便利なラベルは抗PECAM抗体またはBSI-レクチンである。この組織で使用されている血管周囲の細胞マーカーNG2、デスミン、SM-αアクチン、PDFGRβ、クラスIIIβ-チューブリンが含まれています。以下、3.3節では、我々は比色や蛍光PECAMの免疫標識プロトコル用のプロトコルを記載しています。 </li><li>最初の一次抗体のインキュベーションの前に、スライドは、過剰の緩衝液を除去するために真空乾燥しています。また、組織が最初に離れて組織からの抗体溶液の制御フローを防止するためにワックスペンで概説されています。最後に、すべてのラベル付けの手順は、洗浄工程に続いています。手順を洗浄するために、スライドを染色瓶の内側に配置されています。緩衝液は、洗浄期間中に3回交換されます。 </li><li>内皮細胞抗体のラベリングの手順：&lt;Pクラス= &quot;jove_step&quot;&gt; PECAM比色Lableing <ol><li>一次抗体のインキュベーション：各組織の上に約100〜200 mLの一次抗体溶液（抗体緩衝液で希釈1:200マウスモノクローナルビオチン化CD31抗体（PBS + 2％BSA 0.1％サポニン））ドリップ、全体の組織があることを確認してください抗体溶液で覆われている。室温で1時間インキュベートした。 </li><li> 30分間、PBS +0.1％サポニンで組織を洗浄します。 </li><li>二次抗体のインキュベーション：ドリップ二次抗体溶液（ベクターラボラトリーズからベクタステインエリートABC溶液、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ二次抗体溶液）組織の上に。室温で1時間インキュベートします。 </li><li> 30分間、PBS +0.1％サポニンで組織を洗浄します。 </li><li> 15分間のベクトルノヴァレッド組織をインキュベートします。その後水で組織を上昇。 </li><li>マウントスライド：95％エタノールでディップスライド10倍。に浸し、2分間、100％エタノールでスライドします。別の100％エタノールに浸しスライドので、徒歩2分のためにlution。その後2分ごとの連続した​​100パーセントキシレン溶液にスライドを浸す。 VectaMountの薄層とカバーガラスで組織を乾燥させてカバーすることができます。 </li></ol> PECAM蛍光標識<ol><li>一次抗体のインキュベーション：各組織の上に約100〜200 mLの一次抗体溶液（抗体緩衝液で希釈1:200マウスモノクローナルビオチン化CD31抗体（PBS + 2％BSA 0.1％サポニン））ドリップ、全体の組織があることを確認してください抗体溶液で覆われている。室温で1時間インキュベートした。 </li><li> 30分間、PBS +0.1％サポニンで組織を洗浄します。 </li><li>二次抗体のインキュベーション：組織の上にドリップ二次抗体溶液（（1:100抗体緩衝液で希釈したストレプトアビジン - CY3（0.1％PBS + 2％BSA中のサポニン））室温で1時間インキュベートします。 </li><li> 30分間、PBS +0.1％サポニンで組織を洗浄します。 </li><li>マウントスライド：組織の上にグリセロールを50:50 PBSドリップ。カバーカバースリップである。その後、カバースリップとスライドの間のギャップを封止するためにマニキュアを使用します。 </li></ol></li></ol> 5。代表的な結果免疫組織化学的にPECAMのために標識ラット腸間膜組織の代表画像を図3に表示されます。 PECAMラベリングは、微小血管ネットワークを改造の階層に沿ったすべての容器の種類を識別し、特定の時間点後の刺激で血管新生メトリクスを定量化するために使用することができます。 PECAM標識はまた、動脈に対して静脈の決定が可能になります。摂食動脈は、通常、ペア静脈（ 図4）に比べて小さい直径細長い内皮細胞の形態を示す。毛細血管および毛細血管もやしは、その血管径およびネットワーク内の相対位置に基づいて識別することができます。リフォームネットワークの典型的な特性が増加した発芽毛細血管、血管密度、血管領域と細静脈tortuosを含むITY。様々な血管新生メトリクスの定量化は、ネットワークの成長（ 図5）の経時変化を識別します。既存の船舶、3日と5日と10日目で刺激レベルに戻りの間にピークから発芽キャピラリー。発芽には、この一時的な増加は、血管密度と血管面積の増加が続いている。このモデルの大きな血管のリモデリングのための証拠として、細動脈と細静脈のセグメントの数も時間の経過とともに増加します。 当研究室では、このモデルは、このモデリングプロセス10、11中の特定時点での携帯電話表現型の変化を識別するために使用されています。たとえば、クラスIIIβ-チューブリンは、新生血管に沿った周皮細胞（ 図6）を識別します 。刺激を受けていない組織では、クラスIIIβ-チューブリンの発現は、神経特異的である。対照的に、発芽キャピラリーのピーク時には、クラスIIIβ-チューブリンは血管周囲の細胞によって発現されています。このタイプの結果の血管新生過程に関与する新規細胞型を識別するには、このシンプルかつ堅牢な血管新生モデルの使用を強調しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" /> 図1プラスチックステージ事前·事後修正の画像。変更前の段階では100mmのペトリ皿で​​ある。変更は、中央に楕円形の穴のカットと引き上げ、滑らかな表面を作成するための穴の縁に粘土やシリコン接着剤のその後の加算が含まれています。この表面は体外に腸間膜窓の灌流を容易に内側の境界を提供します。スケールバーは1cmである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" /> 図2。体外に腸間膜領域の画像。腸間膜窓が小腸を供給する動脈/静脈のペアの間の薄い半透明の膜のように定義されています。具象化中期間は、腸間膜領域は、レイアウトと変更されたペトリ皿の内側に生理食塩水に浸漬されています。不活性黄色の粘土は、事前にカットホールを介してプルアップすることが腸間膜のために滑らかな表面を提供します。スケールバーは1cmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" /> 図3刺激の組織や組織の3時と腸間膜の10日後に具象化から腸間膜微小血管のネットワークの代表的な画像。 PECAM標識は、動脈（A）、静脈（V）と毛細血管（C）を含む、血管ネットワークの階層構造を同定した。ポスト刺激は、微小血管ネットワークが毛細血管発芽（矢頭）と血管密度の増加が表示されます。スケールバーは100μmである。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" /> 図4成体ラット腸間膜微小血管ネットワーク内の細動脈/静脈のペアの代表的な画像だ。両方のイメージでは、細動脈は（）より小さい相対直径と細長い内皮細胞の形態に基づいて細静脈（V）と区別することができます。スケールバーは20μmである。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" /> 図5微小血管の成長後の腸間膜の具象化の時間経過とともに血管新生メトリクスの代表的な定量化。組織面積当たりのA）血管領域。血管面積当たりの毛細血管もやしのB）の数。血管面積当たりのC）の合計血管の長さ。 *刺激群に比べ有意差を表しています。統計的比較は、ダンのテストに続いてワンウェイANOVAを用いて行った。た（p &lt;0.05）。国連は、刺激を表します。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" /> 図6。3と10で刺激の組織や組織由来の腸間膜微小血管のネットワークの代表的な蛍光画像日は腸間膜の具象化を投稿してください。免疫PECAMラベル（赤）は内皮細胞を識別し、クラスIIIβ-チューブリン標識（緑）が神経（矢頭）および血管周囲細胞（矢印）を識別します。血管周囲の細胞が一時的に発芽キャピラリー中にクラスIIIβ-チューブリンをアップレギュレートする。刺激微小血管ネットワークでは、クラスIIIβ-チューブリンは、神経特異的であり、血管周囲の細胞を識別しません。 3日後に刺激、クラスIIIβ-チューブリンは、積極的に血管に沿って血管周囲細胞にラベルを付けます。 10日目では、クラスIIIβ-チューブリンの発現パターンは、非刺激シナリオに戻り始めます。スケールバーは50μmである。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" /> 図7腸間膜の具象化によって刺激された微小血管ネットワークの成長の間にトラッキング事前に標識された局所的に適用された細胞の可能性をサポートしている画像。細胞はmesenterにわたって灌流された20分具象化期間中にICの窓。 1日後の手術、DII標識細胞（赤）がPECAM正の微小血管（緑）を持つ貴婦人焦点面で観察された。 A、B）DiIの例としては、丸められ、細長い形態を示す骨髄細胞を標識した。いくつかのケースで（矢印）細胞が血管に沿って伸長しました。 C）DiIのクラスタの例（矢印）もやしキャピラリの先端近くに間葉系幹細胞を標識した。スケールバーは50μm（）、および20μmの（B、C）です。

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我々は、開示することは何もありません。

具象化モデルは、2006年に報告され、血管新生4-7の前の機械的損傷ラット腸間膜モデルから適応し、ラット腸間膜9を活用して十分に確立され腹腔内注射モデルに類似した結果を生成しています。 20分の具象化時間は、実験的に堅牢な血管新生応答を生成するために決定した。この期間を変化させることができますが、それはメカニズムの研究や細胞系譜研究のための外因性の細胞の直接アプリケーションのための血管新生阻害剤4のローカルアプリケーションに許可しています。腸間膜組織が ​​事前に標識された骨髄細胞と間葉系幹細胞（ 図7）を使用して、我々の研究室での予備的研究によってサポートされている改造への細胞取り込みの可能性、およびヒト脂肪由来間質細胞注入のIP 14の運命を調査の成功により、 。私たちの研究室では、周皮細胞フェンを識別するためにこのモデルを使用している血管新生反応10時間の経過とともに、このような高血圧12などの病的状態、中に血管新生の可能性を評価するためにotypic変更されます。血管新生反応と、このモデルに関連付けられた細胞表現型の変化は、慢性低酸素暴露10、11などの他のラット腸間膜血管新生モデルで観察することができます。 具象化モデルの制限は、血管新生の正確なトリガメカニズムは不明であるということです。腸間膜の具象化は、マスト細胞の脱顆粒およびヒスタミンの増加レベル6にリンクされており、さらなる調査がより多くの洞察を得るために必要です。血管新生刺激は、微小血管ネットワークの階層構造全体の堅牢な改造応答を生成し、間違いなく多因子です。未知のメカニズムがこのモデルの主要な批評まま、その再現性とシンプルさは、細胞ダイナミクスinvolを識別するために、それが魅力的本質的に複雑な毛細血管発芽過程でVED。モデルの再現性は、我々の研究室10、12から以前に発行された研究では複数のラット系統間の微小血管網の成長（Wistar系雄と雌Sprague-Dawley）の時間経過とともに匹敵する血管新生の評価指標によってサポートされています。以来、成体ラット腸間膜組織の大部分は血管であり、モデルはまた、動物ごとに検討するために、複数の組織を可能にします。マウスの腸間膜窓が少ないネイティブ血管新生を持っていると、我々の経験では、一般的にネットワークを分岐観測欠いている残念ながら、このモデルは明らかに遺伝的マウスモデルには適用されません。将来のアプリケーションは、特定の時点で内の重要な顕微鏡を用いて血管新生時に血管の機能の調査とリンパ管と神経新生に関与して関連する細胞の動態の調査が含まれています。腸間膜のウィンドウごとにネイティブ血管新生の程度は、ROUと思われるものの年齢とともにghly比例し、我々は4-5週齢の幼いWistar系雄性ラットで微小血管ネットワークの分岐を観察した。これらの観​​察は、具象化モデルはまた、年齢間の血管新生の違いを比較するために適用されることが示唆された。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 追加コメント </td></tr><tr><td>ドレープ</td><td>カーディナルヘルス</td><td> 4012 </td><td> 12 &quot;X12&quot;バイオシールド通常滅菌はラップ</td></tr><tr><td> Noyes氏マイクロシザー</td><td> Roboz手術器具</td><td> RS-5677 </td><td>ノイスMicroは、春のはさみの解剖; ストレート、シャープブラントポイント、13ミリメートルカッティング·エッジ、0.25ミリメートル先端幅4 1/2 &quot;全長</td></tr><tr><td>グレーフェForcep </td><td> Roboz手術器具</td><td> RS-5135 </td><td>鋸歯状;わずかなカーブ、0.8ミリメートル先端幅、4 &quot;長さMicroは、鉗子を解剖</td></tr><tr><td>グレーフェForcep </td><td> Roboz手術器具</td><td> RS-5130 </td><td>ミクロ解剖鉗子、鋸歯状、ストレート0.8ミリメートル先端幅、4 &quot;長さ</td></TR&gt; <tr><td> 4から0縫合糸</td><td>エチコン</td><td> 699G </td><td> （1.5メートル）ETHILONナイロン縫合糸ブラックモノフィラメント</td></tr><tr><td> 5から0縫合糸</td><td>エチコン</td><td> 8556 </td><td> （1.0メートル）プロレンPolyprolene縫合ブルーモノフィラメント</td></tr><tr><td> 7から0縫合糸</td><td>エチコン</td><td> 1647G </td><td> （0.5メートル）ETHILONナイロン縫合糸ブラックモノフィラメント</td></tr><tr><td> Castroviejoマイクロニードルホルダー</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 12060から02 </td><td>先端幅：0.6ミリメートル クランプ長さ：5ミリメートル 長さ：9センチメートル ストレートチップ</td></tr><tr><td> Castroviejoニードルホルダー</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 12565から14 </td><td>先端形状：ストレート 先端幅：1.5ミリメートル クランプ長さ：10ミリメートル はさみ：いいえ ロック：はい 長さ：14センチメートル 鋸歯状：はい</td></tr><tr><td>スカルペルハンドル</td><td>ロボzの手術器具</td><td> RS-9843 </td><td>スカルペルハンドル、＃3、ソリッド、4 &quot;長さ</td></tr><tr><td>無菌手術ブレード</td><td>シンシナティ外科</td><td> 0110 </td><td>ステンレススチール、サイズ10 </td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-757-13 </td><td> Slippableベベルリッジ、 </td></tr></tbody></table> 具体的な手術材料とツールのテーブル。 <table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 追加コメント </td></tr><tr><td> Beuthanasia </td><td>シェリング·プラウアニマルヘルス（株）ユニオン（MWI獣医電源から注文） </td><td> MWI＃：011168 </td><td>有効成分：100mlあたり、390 mgのペントバルビタールナトリウム、50mgのフェニトインナトリウム</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>フォートドッジアニマルヘルス（MWI獣医電源から注文） </td><td> MWI＃：000680 </td><td> Katesetは100 mg / mlの</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td> LLOYD。 （株） （MWI獣医電源から注文） </td><td> MWI＃：009307 </td><td>は100 mg / mlをAnased </td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>ホスピーラ社</td><td> 94から217-JT </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> SIGMA </td><td> 011M8207 </td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ</td><td> BCBB4080 </td><td></td></tr><tr><td> PECAM（CD31） </td><td> BD Pharmingen社</td><td> 553371 </td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-CY3 </td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>ジャクソンイムノ</td><td> 096555 </td><td></td></tr><tr><td>ベクタステインエリートABC </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> PK-6100 </td><td></td></tr><tr><td>ベクトルノヴァレッド</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> SK-4800 </td><td></td></tr><tr><td> VectaMount </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H-500 </td><td></td></tr></tbody></table> 特定の試薬 ​​のテーブル

rat mesentery exteriorization: a model for investigating the cellular dynamics involved in angiogenesis

Microvacularネットワークの成長とリモデリングは、創傷治癒、炎症、糖尿病性網膜症、腫瘍の成長や他の疾患状態1、2の重要な側面です。ネットワークの成長は、一般的に、既存の血管か​​ら新しい血管の成長として定義され、血管新生に起因しています。血管新生のプロセスはまた、直接血管周囲の細胞コーティングと血管の拡大のキャピラリー買収として定義され、動脈形成にリンクされています。言うまでもなく、血管新生は複雑であり、細胞および分子レベル3で複数のプレイヤーが含まれます。微小血管ネットワークが成長する方法を理解する血管新生の経時変化を介してネットワークの階層に沿って空間的および時間的なダイナミクスを識別する必要があります。この情報は、血管の成長を操作することを目的とした治療法の開発のための非常に重要です。 この資料に記載されている具象化モデルは、刺激のために、シンプルで再現可能なモデルを表していますラット腸間膜の血管新生をlating。それはラット腸間膜4-7の創傷治癒モデルから適応し、血管新生促進剤8、9の腹腔内注射を介して腸間膜の血管新生を刺激するための代替であるされました。それは最小限の外科的介入を必要とし、単一のダウン全体の微小血管網の二次元可視化を可能にする組織では比較的短い時間の経過とともに毛細管もやし、血管領域と血管密度の劇的な、再現性の増加を生成するため具象化モデルは魅力的です。セルレベル。刺激された成長は、外国血管新生の分子の干渉を受けずに生理的な環境で自然に血管新生応答を反映しています。免疫組織化学的標識法を用いて、このモデルは血管新生に関与する新規細胞事象を識別するのに非常に有用であることが実証されています。調べでは、容易に時間SPと改造の時間経過時の血管新生メトリックを関連付けることができますそのような細胞の表現型の変化や細胞間相互作用4、5、7、10、11などecificダイナミクス、。

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Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

この資料では、ラット腸間膜血管新生を刺激するための単純なモデルを説明しています。モデルは、単一細胞レベル全体を微小血管網のEN面の可視化を可能に組織内の比較的短い時間の経過とともに毛細管発芽、血管領域と血管密度の劇的な増加を生成します。

ラット腸間膜具象化：血管新生に関与する細胞のダイナミクスを調べるためのモデル

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K ビュー.  Tulane University. この資料では、ラット腸間膜血管新生を刺激するための単純なモデルを説明しています。モデルは、単一細胞レベル全体を微小血管網のEN面の可視化を可能に組織内の比較的短い時間の経過とともに毛細管発芽、血管領域と血管密度の劇的な増加を生成します。

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis Interview

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro. He explains the importance of fibroblasts that secrete a critical, yet unidentified, soluble factor that allow endothelial cells to form vessels in culture that branch, form proper lumens, and undergo anastamosis.

クリストファーヒューズ：血管新生の研究のためのin vitroモデル（インタビュー）

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

生物学

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

ラット間膜の血管新生アッセイ

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

頭蓋間葉の細胞挙動を評価するための外植片アッセイ

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

一チャネルセル付パッチクランプ法

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

ラット腸間膜に微小血管透過性の調節を調査するために、微小灌流法

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive expression of families of related receptors, a broad range of related ligands and the difficulty of dealing with primary cultures of specialized endothelial cells. Here we describe a bioassay for the detection of ligands to the vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), a key transducer of signals that promote angiogenesis and lymphangiogenesis. A cDNA encoding a fusion of the extracellular (ligand-binding) region of VEGFR-2 with the transmembrane and cytoplasmic regions of the erythropoietin receptor (EpoR) is expressed in the factor-dependent cell line Ba/F3. This cell line grows in the presence of interleukin-3 (IL-3) and withdrawal of this factor results in death of the cells within 24 hr. Expression of the VEGFR-2/EpoR receptor fusion provides an alternative mechanism to promote survival and potentially proliferation of stably transfected Ba/F3 cells in the presence of a ligand capable of binding and cross-linking the extracellular portion of the fusion protein (i.e., one that can cross-link the VEGFR-2 extracellular region). The assay can be performed in two ways: a semi-quantitative approach in which small volumes of ligand and cells permit a rapid result in 24 hr, and a quantitative approach involving surrogate markers of a viable cell number. The assay is relatively easy to perform, is highly responsive to known VEGFR-2 ligands and can accommodate extracellular inhibitors of VEGFR-2 signaling such as monoclonal antibodies to the receptor or ligands, and soluble ligand traps.

We describe a simple cell-based bioassay for detecting, quantifying and monitoring the activity of members of the vascular endothelial growth factor family of ligands. The assay uses chimeric receptors expressed in a factor-dependent cell line to provide a semi-quantitative or quantitative assessment of receptor binding and cross-linking by the ligand.

血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as well as pathological changes in endothelial phenotype and gene expression. In particular, maladaptive effects of periodic, unidirectional flow induced shear stress can trigger a variety of effects on several vascular cell types, particularly endothelial cells. While by now endothelial cells from diverse anatomic origins have been cultured, in-depth analyses of their responses to fluid shear have been hampered by the relative complexity of shear models (e.g., parallel plate flow chamber, cone and plate flow model). While these all represent excellent approaches, such models are technically complicated and suffer from drawbacks including relatively lengthy and complex setup time, low surface areas, requirements for pumps and pressurization often requiring sealants and gaskets, creating challenges to both maintenance of sterility and an inability to run multiple experiments. However, if higher throughput models of flow and shear were available, greater progress on vascular endothelial shear responses, particularly periodic shear research at the molecular level, might be more rapidly advanced. Here, we describe the construction and use of shear rings: a novel, simple-to-assemble, and inexpensive tissue culture model with a relatively large surface area that easily allows for a high number of experimental replicates in unidirectional, periodic shear stress studies on endothelial cells.

The Assembly and Application of &#039;Shear Rings&#039;: A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Different levels and patterns of fluid shear are known to modulate endothelial gene expression, phenotype and susceptibility to disease. We discuss the assembly and use of 'shear rings': a model that produces unidirectional, periodic shear stress patterns. Shear rings are simple to assemble, economical and can produce high cell yields.

「せん断リング」の組み立てと応用：小説内皮軌道、単方向および定期的な流動のためのモデルとせん断応力

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...