この作品は、医療システム工学研究所（iMSE）＆GISTからGIST-カリフォルニア工科大学共同基金（K04592）からの助成金によっておよび未来創造科学部が資金を提供し、韓国のNRFを通して基礎科学研究開発プログラムによってサポートされていました（NRF-2013R1A2A2A01067890）。

すべての手順は、光州科学技術院（GIST）の機関のガイドラインに従って行われた、すべての手順は、GISTで施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.事前lesioning手順<ol><li> AAV-GFPを使用した内部カプセル内前肢地域の同定 <ol><li>ハウスとSDラット（〜400グラム、11から13週間）を処理制度や国のガイドラインに準拠したこと。 </li><li>適切な滅菌（蒸気またはプラズマ滅菌器）を使用して、すべての手術器具および電極を滅菌します。殺菌、乾燥のために30分間、30分の設定として121℃の蒸気滅菌器を使用してください。 </li><li>筋肉内注射を介してケタミン塩酸塩の混合物（100mg / kg）およびキシラジン（7ミリグラム/キログラム）で動物を麻酔。足のピンチによって麻酔の深さを確認してください。下の加熱パッドを経由して37.5±0.5℃の体温を維持動物の体。 </li><li>耳のバーと口ホルダーを使用して、定位フレームに動物を置きます。 </li><li>クリーンと70％アルコールとポビドンヨード溶液で手術部位を消毒します。手術中の痛みを軽減することを意図し頭蓋切開領域には、頭皮の下に2％塩酸リドカインを浸潤します。 </li><li>目の乾燥を防ぐために獣医眼軟膏を適用します。手術部位への動物の上に滅菌ドレープを配置します。無菌状態ですべての手続きを維持しています。 </li><li>メスを用いて2センチメートルの正中線頭蓋骨切開を行い、ワイヤリトラクターとの二国間の皮膚を撤回。綿棒及び30％過酸化水素で頭蓋骨を乾燥させます。 </li><li> （2.5±正中線から：ML、ブレグマから2.5 AP）およびウイルス注入のためのマイクロcurretteで道をクリアする運動皮質の前肢領域の上にハンドピースのドリルを用いて穴を開けます。 </li><li>の氷と負荷1μlの上AAV-GFP（2×10 12ウイルス分子/ ml）を解凍10μlのシリンジ内のウイルス。定位フレームに注射器を置きます。 </li><li>既製の穴に針を移動し、硬膜深く針1ミリメートルを下げます。 </li><li>高精度マイクロポンプを使用して（0.1マイクロリットル/分）、ゆっくりとウイルスを注入し、ウイルスが外に拡散することを可能にするために、追加の10分間の場所に針を残します。 </li><li>生理食塩水による洗浄で手術部位を洗浄した後、3-0ナイロン縫合糸で傷口を確保。定位フレームからラットを解放し、回復室に転送します。術後疼痛管理のための筋肉内注射を介してケトプロフェン（2ミリグラム/キログラム）を管理します。 </li><li>加熱パッド付き体温（37℃）を維持し、必要に応じて皮下注射を介して筋肉内注射し、2％塩酸リドカインを経由して（0.1％、1ミリリットル）第二世代セフェムクラスの抗生物質を投与します。それは維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください胸骨横臥位。完全復旧までのシングル家動物。 </li><li> 3週間の回復、深くフード内の筋肉内注射を介してケタミン塩酸塩（300 mgの/ kg）を過剰投与によりラットを麻酔 - 2を以下に示します。つま先ピンチ応答、パルス、および呼吸の欠如によって動物の死を確認してください。フードにラット仰向けに置きます。 </li><li>胸腔を開くには &#39;Y&#39;字型の切開により腹腔を開きます。しっかりと止血剤と下行大動脈をクランプし、血液の排水のためのラットの心臓の右心房を破裂。 30分（10ml /分）のために4％パラホルムアルデヒドに続く5分（10ml /分）、冷1％パラホルムアルデヒドで心臓の左心室に灌流を開始します。 </li><li>ハサミを使用して、カーカスから、ラットの頭を削除します。鼻に首から正中切開を行い、頭蓋骨が露出するようにはさみや骨鉗子を使用して、首の筋肉を取り除きます。静かに脳から頭蓋骨とデュラスを解剖します。 </li><li>脳を抽出し、一晩、4％パラホルムアルデヒドを充填した50ミリリットルコニカルチューブにラットの脳を置きます。次の日は、1×PBSで3回脳を洗浄し、30％ショ糖溶液に入れてください。 </li><li>脳が完全に30％スクロース溶液の底に沈む後、cryotomeで-20℃で10月化合物とcryomoldで脳を置きます。 40ミクロ​​ンの厚さと200μmの間隔で前頭面で脳をスライス。 </li><li>スライド法14を用いて、GFPの免疫組織化学染色を行います。 4℃で一晩脳切片に：一次抗体（抗緑色蛍光タンパク質、ウサギIgG画分の200 1）を適用します。 2 番目に日のTween-20（PBST）溶液を、1％リン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄し、二次抗体を適用する：1時間（1ヤギ抗ウサギIgG（H + L）の500）。 1％のPBSTで3回スライドを洗浄します。脳切片上のカバーガラスを置きます。 </li><li>蛍光顕微鏡（励起波長を使用して470nmで、発光波長525nmで、倍率5倍）、内部のカプセル内のAAV-GFP形質導入された軸索を観察します。形質導入された軸索の定位座標を決定するために、ラット脳アトラス15で形質導入された軸索の位置を比較</li></ol></li><li> 莢膜梗塞モデル化するための適切な光強度の調整を事前にlesioning <ol><li> 光ニューラルインタフェースの構築 <ol><li>切削ドリルを使用して、内部スタイレットと27ゲージの脊椎針の適切な長さ（4センチ）カット。 注：カッティング脊椎針の先端を圧縮して潰してもよいです。スタイレットを除去し、脊髄針の破砕部分を除去し、脊髄針の内側の口径を維持するために、脊髄針の先端を磨きます。 </li><li>片側パッチコードの光ファイバ（62.5μmのコアと125ミクロン）のジャケットの適切な長さ（10センチメートル）を取り除きます。 </li><li> unjacked光学Fiのを挿入しますberの金属管（外径17ミリメートル：3.8ミリメートル、内径：3.3ミリメートル、長さ）に、次に繊維の周りにクランプされ、。金属管は、光ファイバや脊髄針のハブとの間の空間を充填すると便利です。二回押さえて金属管の1/2下を固定します。 </li><li>光ファイバ上に熱硬化性エポキシ樹脂を適用し、脊髄針に光ファイバを挿入します。ハブ内の空きスペースに追加のエポキシ樹脂を適用します。安定した固定のために100℃で20分間、エポキシ樹脂を硬化させます。 </li><li>脊髄針の外に突出する光ファイバを切断し、ダイヤモンドラッピング（研磨）のシートを使用して、脊髄針の先端に光ファイバを磨きます。 </li><li>緑色レーザシステムのカプラにパッチコードのFC / PCコネクタ部品を接続して、デジタル光パワーとエネルギーメーターを用いた光ファイバの先端から光強度を測定します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Photothrom内部のカプセル内botic梗塞Lesioning <ol><li>適切な滅菌（蒸気またはプラズマ滅菌器）を使用して、すべての手術器具および電極を滅菌します。殺菌、乾燥のために30分間、30分の設定として121℃の蒸気滅菌器を使用してください。 </li><li>動物を麻酔（〜400グラム、11から13週間）の筋肉内注射を介して塩酸ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（7ミリグラム/キログラム）の混合物。足のピンチによって麻酔の深さを確認してください。動物の体の下に加熱パッドを経由して37.5±0.5℃の体温を維持。 </li><li>耳のバーと口ホルダーを使用して、定位フレームに動物を置きます。 </li><li>クリーンと70％アルコールとポビドンヨード溶液で手術部位を消毒します。手術中の痛みを軽減することを意図し頭蓋切開領域には、頭皮の下に2％塩酸リドカインを浸潤します。目の乾燥を防ぐために獣医眼軟膏を適用します。 </li><li> ANの上に滅菌ドレープを適用します。imalとは、手術部位を露出させます。無菌状態ですべての手続きを維持しています。 </li><li> 2センチメートルの正中線頭蓋骨切開を行い、ワイヤリトラクターとの二国間の皮膚を撤回。綿のスワップおよび過酸化水素で頭蓋骨を乾燥させます。 </li><li>ブレグマとラムダが同じレベルで整列されるまで、ノーズクランプの高さを調整します。重要なステップ：この位置合わせが正しく、主実験で内部カプセルに梗塞病変を行うのように、より深い構造にアプローチすることが重要です。 </li><li>光血栓を誘発するためにドリルを使って穴（3.0±正中線から：;：; MLブレグマから-2.04 AP直径2mm）を作成します。 </li><li>ポーランドと光インターフェイスの光ファイバ先端を清掃してください。曲げず定位フレームにONIを修正しました。 ONIの先端をチェックして、光インタフェースの挿入前と後に明らかにそれを一掃。 </li><li> opticaの挿入に先立って、光ファイバの先端からのレーザ強度​​を測定ラット脳の標的部位へのLインタフェース。光ファイバの先端に、手術前の手順によって確認されるように、3.5 mWのにレーザー強度を調整します。 </li><li>内部カプセルの標的領域にドリルスルーホール（手術前の段階から確認-7.8 mm）をONIを挿入します。 </li><li>光血栓中に37.5±0.5℃の体温を維持します。下半身の温度が梗塞の予想範囲を生成しないかもしれません。尾静脈からローズベンガル（2ミリリットル/キログラム）を注入します。 </li><li>ローズベンガル注射後90秒1分間の532nmのグリーンレーザをオンにします。照射後、静かに脳からONIを削除します。手術部位を洗浄した後、傷は3-0ナイロン縫合糸で傷口を確保確保。定位フレームからラットを解放し、回復室に転送します。 </li><li>偽手術群（SOG）の場合は、代わりにローズベンガルの生理食塩水の注入（0.2ミリリットル/ 100グラム）を除いて、同一の病変作りの手順を実行します。 </li><li>手術後の加熱パッドで、体温（37℃）を維持し、筋肉内注射を介して抗生物質（第2世代セファロスポリン、0.1％、1ミリリットル）を管理。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物によって占有ケージに手術後の動物を返さないでください。 注：予備実験5ミリワット、1ミリワットから最適な光強度を見つけるために、同じ手順で行い、手順は異なる状態で病変の十分な範囲を取得するために必要とされ得ます。 </li></ol>莢膜梗塞Lesioning 3.評価<ol><li> 行動試験と動物のグループ化 <ol><li>ウィショーらによって記載されているように、単一のペレット到達タスクを実行します。14ストロークモデル化した後、1週間毎日前肢の運動障害を評価します。単一のペレットに達するのタスクを実行します1cm幅のスリットと前壁の真ん中の前に食品の棚に明確なプレキシグラス（30×15×35センチメートルの高さ）を使用した食品制限動物では（SPRT）（対照体重の90％）。 </li><li>好適な前肢の斜め反対側の食品棚にペレットを配置します。 3週間のセッションあたり20ペレットを管理します。 注：SPRTsの成功数は、動物が食物ペレットを把握し、それを落とすことなく、口の中にそれを置くているリーチとして定義されています。 </li><li>以下の式で定義される成功達するの百分率としてスコアを計算します。 <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53281/53281equation1.jpg" /> 注：偽手術群（SOG）、緩やかに回復グループ（MRG）、および不十分な回収・グループ（PRG）：私たちは3つのグループに動物を分けます。もし脳卒中後SPRTスコア&gt; 50％、我々は、実質的な病変の存在を示すMRG、としてラットを分類するが、TAのない完全な破壊目標確認。脳卒中後SPRTスコアが&lt;50％プレストロークSPRTスコアと比較している場合、我々は目標に完全lesioningを示しPRG、としてグループを分類します。 </li></ol></li><li> 梗塞LesioningのNeurohistological確認 <ol><li>前述のように4％パラホルムアルデヒドで心臓灌流を行います。脳が完全に30％ショ糖溶液に沈む後、10μmの厚さとミクロトームまたはcryotome 4を用いて、200μmの間隔で冠状切片を行います。 </li><li> H＆E、ニッスル、ルクソールファーストブルーPAS、ニューロフィラメントタンパク質、Lまたはグリア線維酸性タンパク質染色および組織学的所見を観察で染色は、染色を観察する対象領域内部のカプセルの全体幅をカバーすることができ、最適な光強度を決定します4,17。 </li><li> ImageJソフトウェアを使用して、脳のスライド上の内部カプセルの光血栓梗塞領域の体積を測定。<ol><li>梗塞領域の体積を測定するには、「ImageJの「ソフトウェアを起動します。 （ &#39;イメージ」→「スタック」→「イメージスタックに&#39;）を積層するファイルを開く」スタックへのイメージ」を選択します。編集ファイル名を選択し、スケールを編集する（→「スケールを設定します &#39;&#39;分析 &#39;）&#39;スケールを設定します」。 </li><li> 「プラグイン」で、選択した画像の容量や面積を計算するために「スタックを測定します」。 「スライス間隔」に2つの画像の距離間隔を挿入します。すべての画像のROI（関心領域）の描画を行い、「測定」をクリックします。 注：ソフトウェア「ImageJの」は、自動的に各画像およびそれらの全体積の面積や体積を計算します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここで提示莢梗塞モデルは、前肢の機能の著しいと持続的な運動障害を持つ対象となる病変を示しています。皮質下の莢ストロークの前のモデルは、運動障害と迅速なリカバリ処理の6,8,9の不十分な度合いを示しました。この意味で、このモデルは、長期的な機能障害を呈する臨床莢梗塞例に似ています。 外接莢梗塞モデルの開発において最も重要なステップは?...

最近まで、「灰白質ストローク（GMS）のモデルは、「排他的脳卒中の病態生理を理解するために、新しい治療法の開発を導くために使用されています。すべてのストローク1,2の25％ -しかし、15を構成している高齢者における皮質下白質に影響を与えるストロークの増加罹患率がありました。多くの研究は、白質ストローク（WMS）モデルを使用したいくつかの研究がある一方で、GMSモデルを使用に関するストロークを行われています。げっ歯類における白質は、ヒトまたは霊長類における白質よりも実質的に小さいです。これにより、選択白質3に標的領域にアクセスして破壊することはより困難です。さらに、全く効率的なツールを選択的に標的白質の計画範囲を破壊するためにこれまでに開発されていません。したがって、白質ストロークの研究のための適切なモデルの欠如がありました。 動物目rokeモデルは、多くの場合、新たなリハビリテーションや治療法の開発のための運動回復の進行を監視するために使用されます。人間のストローク4,5で実証解剖学的な変化と調和の長期神経学的欠損を示す動物モデルを利用することが理想的です。この点において、梗塞lesioning以下の運動障害や脳の広い関与の急速な回復は、脳卒中の研究を追求して現実的ではないかもしれません。前嚢梗塞モデルは内部のカプセル6-9にエンドセリン-1（ET-1）の内頸動脈または前部脈絡膜動脈と拡散の閉塞によってなされてきました。それにもかかわらず、動脈閉塞は、動脈の注意深い解剖が必要ですが、それは永続的な行動欠陥なしに、内部カプセルを含む梗塞病変の広い面積を、生成されます。また、ET-1は完全に内包後脚を破壊するために拡散していなかった、したがってより少ないとマークまたはBEHを持続しますavioral赤字。 光血栓梗塞モデルは広く皮質梗塞病変および皮質下構造10の様々なタイプを生成するために使用されています。技術は、小血管および梗塞病変の発生10で血小板凝集につながる焦点照明に続く静脈内投与が含まれます。ほとんどWMS病変5,11を生成するために使用されていないのに対し、光血栓技術が広く、GMS病変を作成するために使用されてきました。この技術については、ローズベンガル染料および光照射の組み合わせは、対応する機能障害を引き起こし、ターゲット構造の破壊に有用であることが実証されています。それは梗塞病変の大きさを決定するので、光血栓技術の重要な要素は、光照射です。灰白質および白質に異なる影響で光照射の結果、光の散乱が白ミリアンペアで4倍以上高くなっているので、灰白質12と比較してtter。光強度が十分に低い放射照度（&lt;1140ミリワット/ mm 2）とがある場合したがって、1は光血栓病変が白質（ すなわち 、内部カプセル）に範囲に影響を与えるように拡張機能を制限することができます。例えば、より高いエネルギーの光は、グレーと白の両方の問題に梗塞を誘導することができる、まだ低いエネルギーの光のみが白質に光血栓を誘発する可能性があります。また、光エネルギーの普及率は非常に限られていました。光エネルギーの約99％は、光13のソースから1ミリメートルを超えて失われました。したがって、より低いエネルギーの光が隣接灰白質の最小限の侵略と白質にのみ光血栓を誘発し、正確に標的にすることを期待されています。 ここでは、げっ歯類における内部カプセルの前肢の領域に梗塞病変を作成するための新規な方法を説明します。私たちは、内部CAに前肢領域の識別方法を説明しますpsule、調整、光の配信、および梗塞病変の生成を含む光照射の技術、。我々はまた、莢膜モデルの完全性を評価するために使用される行動試験を記載します。

<table><tbody><tr><td>DC Temperature controller</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.</td><td>ATC1000</td><td></td></tr><tr><td>Digital Stereotaxic Instruments</td><td>STOELTING CO.</td><td>51900</td><td></td></tr><tr><td>Electrical Stimulator</td><td>CyberMedic Corp.</td><td>EMGFES 2000</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy&amp;nbsp;</td><td>Precision Fiber Products, INC.</td><td>PFP-353ND1</td><td>Mix Ratio:&lt;br/&gt; 10(A):1(B-hardener) by weight&amp;nbsp;&lt;br/&gt; Curing Schedule:&lt;br/&gt; 1 min @150 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 2 ~ 5 min @120 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 5 ~ 10 min @100 &amp;deg;C&lt;br/&gt; 15 ~ 30 min @80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fiber Optic Scribe&amp;nbsp;</td><td>THORLABS, INC</td><td>S90R</td><td></td></tr><tr><td>Fiber patch cable</td><td>KOREA OPTRON Corp.</td><td></td><td>Outer diameter: 3 mm&lt;br/&gt; &amp;Oslash;200 &amp;micro;m&lt;br/&gt; 0.39 NA&lt;br/&gt; FC/PC-FC/PC&lt;br/&gt; 1 m</td></tr><tr><td>Laser Power Supply</td><td>CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.</td><td>MGL-FN-532nm-200mW-14010196</td><td></td></tr><tr><td>Crimp ring&amp;nbsp;</td><td>DAWOOTECH CO.,LTD.</td><td></td><td>Length: 19 mm&lt;br/&gt; Inner diameter: 3 mm&lt;br/&gt; Outer diameter: 3.8 mm&lt;br/&gt; Material: SUS</td></tr><tr><td>Micro4-micro syringe pump controller</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>95100</td><td></td></tr><tr><td>Optical Power Meter</td><td>THOLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Diamond lapping (polishing) sheet</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF3D</td><td>Grit : 3 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Diamond lapping (polishing) sheet</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF6D</td><td>Grit : 6 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>SIGMA-ALDRICH CO. LLC.</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Needle for spinal anesthesia with pencil point tip (Spinal needle)&amp;nbsp;</td><td>B.BRAUN MELSUNGEN AG&amp;nbsp;</td><td>4502027</td><td>Size: 27 G&lt;br/&gt; Length: 88 mm&lt;br/&gt; Needle: 0.40 mm</td></tr><tr><td>Waterproof sandpaper&amp;nbsp;</td><td>DEERFOS CO.,LTD</td><td>CC261</td><td>Grit : 1,000 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Nanofil 10&amp;nbsp;&amp;micro;l syringe</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33&amp;nbsp;G BVLD needle</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV-GFP virus</td><td>UNC Vector Core</td><td>AAV2-CamKIIa-eYFP</td><td>2 x 10&lt;sup&gt;12&lt;/sup&gt; virus molecules/ml</td></tr><tr><td>Anti-Green Fluorescent Protein, Rabbit IgG fraction</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11122</td><td>primary antibody (1:200)</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11034</td><td>secondary antibody (1:500)</td></tr><tr><td>Ceftezole</td><td>GUJU Pharma CO.,LTD.</td><td>A27802741</td><td>0.1%, 1 ml</td></tr><tr><td>Lidocain hydrochloride injection</td><td>JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD.</td><td>A04900271</td><td>2%, 1 ml</td></tr><tr><td>Hand Piece Drill</td><td>Seshin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digital optical power and energy meter</td><td>THORLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>UNIBIOTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

circumscribed capsular infarct modeling using a photothrombotic technique

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for white matter stroke has hampered research investigations. Here, we describe a novel method for creating a circumscribed capsular infarct that minimizes damage to neighboring gray matter structures. We used pre-surgery neural tracing with adeno-associated virus-green fluorescent protein (AAV-GFP) to identify somatotopic organization of the forelimb area within the internal capsule. The adjustment of light intensity based on different optical properties of gray and white matter contributes to selective destruction of white matter with relative preservation of gray matter. Accurate positioning of optical-neural interface enables destruction of entire forelimb area in the internal capsule, which leads to a marked and persistent motor deficit. Thus, this technique produces highly replicable capsular infarct lesions with a persistent motor deficit. The model will be helpful not only to study white matter stroke (WMS) at the behavioral, circuit, and cellular levels, but also to assess its usefulness for development of new therapeutic and rehabilitative interventions.

ここに提示された方法は、永続的な運動障害で外接莢梗塞を作成することを意図しています。従って、正確に手術前の段階において内蔵カプセル内の標的を決定することが重要です。内部のカプセル内の錐体繊維の体部位マッピングは、現在までに決済されていません。正しく内部のカプセル内の標的を同定するために、前肢領域が描写されなければなりません。運?...

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Circumscribed Capsular Infarct Modeling Using a Photothrombotic Technique

この原稿は、莢梗塞のモデリング技術が記載されています。ここでは、手術前のターゲット・マッピング後の光の低強度で変性された光血栓技術を利用しました。この技術を使用して、我々は永続的な運動障害を持つ外接莢梗塞モデルを作成しました。

光血栓法を用いた外接莢梗塞モデル

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

7.8K ビュー.  Gwangju Institute of Science and Technology. この原稿は、莢梗塞のモデリング技術が記載されています。ここでは、手術前のターゲット・マッピング後の光の低強度で変性された光血栓技術を利用しました。この技術を使用して、我々は永続的な運動障害を持つ外接莢梗塞モデルを作成しました。 

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Photothrombotic Ischemia: A Minimally Invasive and Reproducible Photochemical Cortical Lesion Model for Mouse Stroke Studies

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected light-sensitive dye. Following illumination, the dye is activated and produces singlet oxygen that damages components of endothelial cell membranes, with subsequent platelet aggregation and thrombi formation, which eventually determines the interruption of local blood flow. This approach, initially proposed by Rosenblum and El-Sabban in 1977, was later improved by Watson in 1985 in rat brain and set the basis of the current model. Also, the increased availability of transgenic mouse lines further contributed to raise the interest on the photothrombosis model. Briefly, a photosensitive dye (Rose Bengal) is injected intraperitoneally and enters the blood stream. When illuminated by a cold light source, the dye becomes activated and induces endothelial damage with platelet activation and thrombosis, resulting in local blood flow interruption. The light source can be applied on the intact skull with no need of craniotomy, which allows targeting of any cortical area of interest in a reproducible and non-invasive way. The mouse is then sutured and allowed to wake up. The evaluation of ischemic damage can be quickly accomplished by triphenyl-tetrazolium chloride or cresyl violet staining. This technique produces infarction of small size and well-delimited boundaries, which is highly advantageous for precise cell characterization or functional studies. Furthermore, it is particularly suitable for studying cellular and molecular responses underlying brain plasticity in transgenic mice.

Photothrombosis is a quick, minimally-invasive technique for inducing small and well-delimited infarction in areas of interest in highly reproducible manner. It is particularly suitable for studying cellular and molecular responses underlying brain plasticity in transgenic mice.

Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

The photothrombotic stroke model aims to induce an ischemic damage within a given cortical area by means of photo-activation of a previously injected ...

医学

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

永久的な脳血管閉塞<em&gt;経由</em&gt;ダブルリガチャーと離断

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Brain Infarct Segmentation and Registration on MRI or CT for Lesion-symptom Mapping

In lesion-symptom mapping (LSM), brain function is inferred by relating the location of acquired brain lesions to behavioral or cognitive symptoms in a group of patients. With recent advances in brain imaging and image processing, LSM has become a popular tool in cognitive neuroscience. LSM can provide fundamental insights into the functional architecture of the human brain for a variety of cognitive and non-cognitive functions. A crucial step in performing LSM studies is the segmentation of lesions on brains scans of a large group of patients and registration of each scan to a common stereotaxic space (also called standard space or a standardized brain template). Described here is an open-access, standardized method for infarct segmentation and registration for the purpose of LSM, as well as a detailed and hands-on walkthrough based on exemplary cases. A comprehensive tutorial for the manual segmentation of brain infarcts on CT scans and DWI or FLAIR MRI sequences is provided, including criteria for infarct identification and pitfalls for different scan types. The registration software provides multiple registration schemes that can be used for processing of CT and MRI data with heterogeneous acquisition parameters. A tutorial on using this registration software and performing visual quality checks and manual corrections (which are needed in some cases) is provided. This approach provides researchers with a framework for the entire process of brain image processing required to perform an LSM study, from gathering of the data to final quality checks of the results.

Provided here is a practical tutorial for an open-access, standardized image processing pipeline for the purpose of lesion-symptom mapping. A step-by-step walkthrough is provided for each processing step, from manual infarct segmentation on CT/MRI to subsequent registration to standard space, along with practical recommendations and illustrations with exemplary cases.

病変症状マッピングに対するMRIまたはCTに関する脳梗塞セグメンテーションと登録

In lesion-symptom mapping (LSM), brain function is inferred by relating the location of acquired brain lesions to behavioral or cognitive symptoms in a ...

行動学

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical options are available for a small proportion of stroke patients in the acute phase. Current research is intensively searching for novel therapeutic strategies and is increasingly focusing on the sub-acute and chronic phase after stroke because more patients might be eligible for therapeutic interventions in a prolonged time window. These delayed mechanisms include important pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity and regeneration. In order to analyze these mechanisms and to subsequently evaluate novel drug targets, experimental stroke models with clinical relevance, low mortality and high reproducibility are sought after. Moreover, mice are the smallest mammals in which a focal stroke lesion can be induced and for which a broad spectrum of transgenic models are available. Therefore, we describe here the mouse model of transcranial, permanent coagulation of the middle cerebral artery via electrocoagulation distal of the lenticulostriatal arteries, the so-called &#8220;coagulation model&#8221;. The resulting infarct in this model is located mainly in the cortex; the relative infarct volume in relation to brain size corresponds to the majority of human strokes. Moreover, the model fulfills the above-mentioned criteria of reproducibility and low mortality. In this video we demonstrate the surgical methods of stroke induction in the &#8220;coagulation model&#8221; and report histological and functional analysis tools.

Various murine models of middle cerebral artery occlusion (MCAO) are widely used in experimental brain research. Here, we demonstrate the model of transcranial permanent distal MCAO which produces consistent cortical infarction of a size corresponding to damage imposed by the majority of human ischemic strokes.

マウスにおけるモデリングのストローク：遠位中大脳動脈の永久的な凝固

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

共焦点光学イメージングによるローズベンガル光血栓<em&gt;インビボ</em&gt;：単一の容器ストロークのモデル

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

マウスの脊髄損傷のモデルとしての光血栓誘発性局所虚血

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

直接脳血栓塞栓を可視化するための複合近赤外蛍光イメージングおよびマイクロコンピュータ断層撮影

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

フィブリン富化およびtPA感受性光血栓性脳卒中モデル

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

神経科学

Modeling Stroke in Mice: Focal Cortical Lesions by Photothrombosis

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, there remain limited therapeutic options for stroke patients. Therefore, more research is needed for pathophysiological pathways such as post-stroke inflammation, angiogenesis, neuronal plasticity, and regeneration. Given the inability of in vitro models to reproduce the complexity of the brain, experimental stroke models are essential for the analysis and subsequent evaluation of novel drug targets for these mechanisms. In addition, detailed standardized models for all procedures are urgently needed to overcome the so-called replication crisis. As an effort within the ImmunoStroke research consortium, a standardized photothrombotic mouse model using an intraperitoneal injection of Rose Bengal and the illumination of the intact skull with a 561 nm laser is described. This model allows the performance of stroke in mice with allocation to any cortical region of the brain without invasive surgery; thus, enabling the study of stroke in various areas of the brain. In this video, the surgical methods of stroke induction in the photothrombotic model along with&#160;histological analysis are demonstrated.

Described here is the photothrombotic stroke model, where a stroke is produced through the intact skull by inducing permanent microvascular occlusion using laser illumination after administration of a photosensitive dye.

マウスにおける脳卒中のモデリング:光血栓症による焦点性皮質病変

Stroke is a leading cause of death and acquired adult disability in developed countries. Despite extensive investigation for novel therapeutic strategies, ...

Injection of Hydrogel Biomaterial Scaffolds to The Brain After Stroke

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes and are defined as the sudden blockage of a vessel supplying blood to the brain. Within minutes of the blockage, cells begin to die and result in irreparable tissue damage. Current therapeutic treatments focus on clot removal or lysis to allow for the reperfusion and prevent more severe brain damage. Although transient brain plasticity may salvage some of the damaged tissue over time, significant fractions of patients are left with neurological deficits that will never resolve. There is a lack of therapeutic options to treat neurological deficits caused by stroke, emphasizing the need to develop new strategies to treat this growing patient population. Injectable biomaterials are currently being designed to enhance brain plasticity and improve endogenous repair through the delivery of active agents or stem cells. One method to test these approaches is to utilize a rodent stroke model, inject the biomaterial into the stroke core, and assess repair. Knowing the precise location of the stroke core is imperative for the accurate treatment after stroke, therefore, a stroke model that results in a predictable stroke location is preferable to avoid the need for imaging prior to injection. The following protocol will cover how to induce a photothrombotic stroke, how to inject a hydrogel in a controlled and precise manner, and how to extract and cryosection the brain while keeping the biomaterial intact. In addition, we will highlight how these same hydrogel materials can be used for the co-delivery of stem cells. This protocol can be generalized to the use of other injectable biomaterials into the stroke core.

Stroke is a global issue with minimal treatment options and no current clinical therapy for regenerating the lost brain tissue. Here we describe methods for creating precise photothrombotic stroke in the motor cortex of rodents and subsequent injection of hydrogel biomaterials to study their effects on tissue regeneration after stroke.

脳卒中後の脳へのヒドロゲルバイオマテリアル足場の注入

Stroke is the leading cause of disability and the fifth-leading cause of death in the United States. Approximately 87% of all strokes are ischemic strokes ...

光血栓法を用いた外接莢梗塞モデル

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