Name: simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
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著者は、撮影の支援のための音声録音、図面のためのM. Borczyk、ウイルス産生のためのA.Trąbczyńska、遺伝子型決定のためのM.ZiókowskaとA. MirgosのためのM. Steczkowskiに感謝したいと思います。 KRはK. DeisserothからのCaMKプロモーターの制御下で蛍光タンパク質mCherryをを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の寄贈を認めています。このプロジェクトは、欧州連合（EU）によって賄わCEPTインフラストラクチャを使用して、組織の構造と機能、神経生物学、実験生物学のNencki研究所のセンターの動物モデルおよび研究室の研究室の中核施設で行われた - 欧州地域開発基金の中を2007-2013のためのオペレーションプログラム「革新的な経済」。この作品は、国立科学センターからの助成金によってサポートされていました：ソナタビス2012/05 / E / NZ4 / 0299​​6、ハルモニア2013/08 / M / NZ3 / 00861、Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 KRとソナタビス2014年に/ 14 / E / NZ4 / 00172 RCへ

以下に記載されている全ての実験手順は実験生物学のNencki研究所、ポーランド科学アカデミーの地方倫理委員会によって承認されました。 注：関連したビデオ内のシーンの一部が加速されます。速度係数は、これらのシーンで示されています。 1.手術の準備<ol><li>オートクレーブ内の液体や綿棒のためのすべてのツール、ガラス容器を滅菌します。不要手袋を使用してください。手術台、定位フレーム、70％エタノールを持つすべての周辺エリアを清掃してください。すべての滅菌機器の滅菌のスペースを作成するために、無菌手術用パッドを使用してください。小片にゲルフォームをカットし、滅菌生理食塩水でそれらを浸します。 注意：実験動物の管理と使用に関する指針によれば、エタノールが滅菌剤でも高レベルの消毒剤でもありません。それだけで、以前に滅菌表面上の洗浄/脱脂剤として使用されるべきです。 </li><li>目に動物を入れて電子導入室/分2 Lを5％と酸素流にイソフルランレベルを設定します。この手順は、約3分を取る必要があります。 </li><li>誘導室から動物を取ります。動物が完全に鎮静剤を投与されていることを確認するために、尾や足指ピンチを使用してください。 </li><li>正確なトリマーを使用すると、目まで（耳の間の）頭の後ろから髪を剃ります。 </li><li>定位フレームに動物を置き、耳棒で頭を安定させます。 </li><li> 1.5から2パーセントイソフルランおよび0.3リットル/分の酸素に麻酔のレベルを設定します。 </li><li>眼軟膏を適用します。 </li><li>それぞれ、炎症、疼痛および感染を防止するためにTolfedine（4ミリグラム/ kg）を、Butomidor（2ミリグラム/ kg）およびバイトリル（5ミリグラム/ kg）を動物の皮下に注入します。 </li><li>脳が腫れ防止するために、デキサメタゾン（0.2ミリグラム/ kg）を筋肉内に動物を注入します。 注：デキサメタゾンを皮下に注入するか、腹腔内に、筋肉の損傷を防止することができます。 </li><li> Sを使用して、肌をきれいに70％エタノールに続いてベタジンとterile綿棒。 </li><li>手袋を変更し、70％エタノールでそれらをスプレー。 注意：滅菌野に触れないでください使い捨て手袋を使用している間。唯一の無菌手術器具や滅菌綿棒の先端で動物をタッチします。 </li></ol> 2.頭蓋窓手術<ol><li>鉗子で皮膚を持ち上げ、マイクロはさみを使用して、斜めの目の間のフロントポイントへのその後のヘッドのベースに沿って水平に皮膚を切開し、。皮弁を削除します。 </li><li>過度の出血や痛みを防ぐために骨膜に滅菌綿棒でリドカイン軟膏を適用します。 </li><li>骨膜を除去するために滅菌綿棒やメスを使用してください。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥させます。 </li><li>滅菌針を使用すると、それらを固定化すると、歯科用セメントとの接触を防止するために、皮膚の縁に密なシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。 </li><li>トン以上の滅菌3ミリメートルのカバーガラスを置きラムダ縫合の前方彼は頭蓋骨。 RSCでカバースリップを中心座標：AP、ブレグマ-2.8; MLは、滅菌針で頭蓋骨の表面を引っ掻くことにより、0マークカバースリップのエッジをブレグマ。 70％エタノールで滅菌容器に戻しカバーガラスを置きます。 </li><li>直径3mmの円の輪郭を小径バリでの高速歯科用ドリルを使用してください。滅菌生理食塩水に浸漬綿棒で骨ほこりから掘削現場を清掃してください。時折出血を止めると骨をきれいにするためにゲルフォームと綿棒を使用してください。 </li><li>掘削の間で静かに骨の円をタッチし、その機動性をチェックすることにより、微細な鉗子で骨の厚さを確認してください。骨が縫合糸の領域に厚くなることに注意してください。骨円はモバイルで、骨のだけでも、薄層は円周上に放置した場合の掘削を停止します。生理食塩水を浸した綿棒で、残りのすべての骨ダストの運用フィールドを清掃してください。 </li><li>掘削CIRをカバーし、掘削領域に滅菌生理食塩水をドロップCLE。慎重に微細な鉗子で骨円を詮索してから慎重にしっかりと上向きにそれを持ち上げて骨を取り除きます。硬膜への損傷を防ぐためにそれを持ち上げながら骨円を歪曲しないように注意してください。 </li><li>静かに出血を止める助けるために硬膜に滅菌生理食塩水に浸したゲルフォームを適用します。すべての出血が完全に停止するまで待ちます。慎重に凝固プロセスを乱さないゲルフォームを削除します。 注：この時点で出血深遠であることを証明するかもしれないので、縫合領域は、高度に血管新生です。出血が完全に停止するのに十分な時間を待つことが不可欠です。氷の上に置くことによって冷却された生理食塩水に浸したゲルフォームを維持するために有用です。 </li></ol> 3.ウイルス注入<ol><li>定位塔に注入ポンプを取り付け、コントローラを接続します。 </li><li>注射器に35G針を挿入します。それを滅菌するためにエタノールで注射器を10回フラッシュし、滅菌生理食塩水で10倍電子の痕跡を除去しますthanol。シリンジから気泡を除去。ポンプ内に注射器を挿入します。 注：他の消毒剤を使用することを検討してください。 </li><li> （10 12 PFUが推奨されます）rAAV2を/ 1 mCherryを製剤の単回投与を解凍し、氷上で保管してください。ウイルス溶液で注射器を埋めます。 </li><li>ブレグマに針を中心にした後、静かに次の座標を用いて海馬に挿入：AP -2、ML +/- 1.0、DVを-1。これらの座標は開頭の​​縁の近くに配置されます。組織が安定するのを5分間待ちます。 </li><li> 50 NL / minの速度でrAAV2を/ 1 mCherryを溶液の0.7μLを注入します。ウイルスが完全に吸着するために10分を待ちます。そっと針を取り除きます。出血が発生した場合、ゲルフォームで吸い取ります。反対側のサイトで繰り返します。 </li></ol> 4.頭蓋窓の移植<ol><li>掘削サークルフレームにおける硬膜の上に滅菌、乾燥したカバーガラスを置きます。 FORCとカバーガラスを保持しますEPSは優しく硬膜を平らにし、カバーガラスをもたらすために「頭蓋骨の表面に近い縁。 注：カバーガラスは、血餅と出血が再開を妨害することが可能です。その場合は、カバーガラスを持ち上げアルコールに置き、乾燥と2.9のステップに戻ります。 </li><li>滅菌針を使用すると、頭蓋骨にそれらを添付するカバーガラスの縁に緻密なシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。 </li><li>頭蓋骨の前部に固定バー（M2ナットまたはカスタムメイドのデザイン）を配置します。バーの端の上にシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。 <ol><li>イメージングセッション中に頭蓋窓の水平位置を可能にする位置に固定バーを配置します。窓からできるだけ遠くに配置します。それは窓に近づきすぎに配置されている場合は、カスタムメイドのホルダーとそれを連結バーとネジは、撮像プロセス中に目的のための障害物としてもたらす可能性があります。 </li></ol></li><li&gt;は、歯科用アクリルを準備し、ガラスの周りの頭蓋骨の表面にそれを適用します。ウィンドウの周りにクレーター状の形状を形成することが有用です。それは水の目的にイメージングのために、後に適用される水の空洞を作成します。 </li><li>頭蓋窓周りのクレーターを強化、操作領域、皮膚のエッジ、固定バーの残りの部分をカバーする、歯科用アクリルでキャップを作成します。歯科用セメントが硬化するのを待ちます。 </li><li>定位フレームから動物を削除し、回収室に入れて。 </li><li>生理機能を観察しながら、動物が手術から回復するのを待ちます。 </li><li> 48時間術後鎮痛（カルプロフェン、10mg / kgの）および抗生物質治療（バイトリル、5ミリグラム/キログラム）を適用します。 </li></ol> 5.イメージング<ol><li>チタンを起動：サファイアレーザー、パワーアップ顕微鏡。この実験で使用されるシステムは、二光子レーザー、OPOシステムとデュアルのGaAsP PMTを備えています。 </li><li> inducに動物を入れてションチャンバーと麻酔を誘導します。 </li><li>誘導チャンバーから動物を削除し、顕微鏡下でガス麻酔マスクに配置します。 0.3 L /分、百分の1.5から2にイソフルラン濃度に酸素流量を減少させます。 </li><li> M2ネジ（または他のカスタム・システム）を使用してカスタム顕微鏡フレームに動物を修正しました。頭蓋窓を水平に。 注記：特定のカスタムフレームは、より良い結果（改善されたヘッド安定性、慢性実験の間、複数のセッションに一定位置決め）を与えるが、顕微鏡メーカーの頭部固定システムを使用することが可能です。 </li><li>脳梁膨大後部皮質の側面の一方に広視野顕微鏡の設定と低倍対物センタービューを使用し、カバーガラス表面上に焦点を当てます。 </li><li>クレーター状のアクリルウェルに水の液滴を適用します。長距離水浸対物レンズに切り替えます。水のメニスカス詐欺まで、頭蓋窓に向かって目的を移動試料と目的をnects。 </li><li> 2光子の設定に切り替え、最低のズームを使用して、底部に試料上部のスキャンを開始。硬膜の交差は高い非特異的シグナルのグレアとして表示されます。 </li><li>ダイナミックレンジ全体をカバーするために、蛍光細胞からの信号強度に応じて両方のチャンネル（GFPとmCherryを）における顕微鏡取得設定を調整します。 </li><li> （他の細胞から分離された樹状突起付き）適切なニューロンを発見した後、最も低いズームと5ミクロンのz距離を持つ唯一のGFPフィルターセットを使用して初期スキャンを実行します。 </li><li>スキャンされたスタックの最大投影を取得し、注釈（反転色を使用）のためにそれを印刷してください。 </li><li>画像に対して所望の形態学的な詳細を可能にする値にズームを設定します。画像ガイドとして最大投影を使用して、GFPとmCherryをチャンネル全体の樹状ツリー。 </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

著者（KL、MR、KR）は、この記事で使用ホルダーフレームのための特許出願中（PL410001）の権限を持っています。

現在の論文では、頭蓋窓からRSCにおけるシナプス入力とシナプス後ターゲットのin vivoイメージングでの同時2光子のためのプロトコルを提示します。移植手順は、いくつかの重要なステップで構成されています。まず、動物が深く麻酔し、定位フレームに固定され、その後、RSC以上の頭蓋骨は、マークされた円形の線に沿ってドリルと円形の骨が除去されて薄くされます。出血?...

二光子顕微鏡は、生きている動物を振る舞うで脳活動の観察に革命をもたらしました。 1990年に導入されて以来、それはすぐに人気を博し、現在は生体内 1,2 における脳活動の多くの側面の検討に向けた最も興味深く、革新的なアプローチの一つとして実装されています。これらのアプリケーションは、（ 例えば 、カルシウムレベルのインジケータまたは即時初期遺伝子の発現を使用して）ニューロンの活性化を血流測定を含み、神経細胞の形態。研究室の増加数は、in vivo脳イメージングのための新しい標準として科学の世界全体の技術を実装し、2光子顕微鏡を使用しています。 標準的なアプローチは、マウス脳3のバレルまたは視覚皮質の上に頭蓋窓（カバーガラスで覆われた頭蓋内の丸い穴）の移植を必要とします。次に、実験プロトコルに応じて、畝SEは、時間4,5を介して脳の活動と神経細胞の形態の変化を監視することができ、可視化と行動訓練の一連のセッションを受けます。両方の場合において、開頭術は縫合糸を交差させず、頭頂骨に影響を与えます。主に技術の主な欠点は、バレルまたは視覚野など簡単にアクセス皮質への限られたアプリケーションであると考えられています。他の地域以上の頭蓋窓の移植は、過度の出血および/または空間的障害のために、多くの困難をもたらします。 本論文では、 生体顕微鏡 6 の 2光子のための目的の別の可能な領域として脳梁膨大後部皮質（RSC）上記の頭蓋窓の移植を提案します。 RSCは、空間記憶の形成に関与する脳回路の重要な要素です。解剖学的に、RSCは、皮質、海馬、および視床領域7を接続する神経ネットワークの一部です。それはそのような空間学習や絶滅だけでなく、空間ナビゲーション6として振る舞い、の範囲で深く関わっ。 我々は、THY1プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックマウス系統を使用し、ニューロンの形態学的変化を視覚化するためです。これらのマウスでは、GFPは、二光子顕微鏡法8を用いて、皮質の軸索と樹状突起の明確な可視化を可能にする脳内のニューロンの約10％で発現されます。我々が提案するもう1つの技術革新は、RSCに突出した脳のより深い構造にニューロン特異的CaMKIIのプロモーター 9の下に赤色蛍光タンパク質（mCherryを）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス血清型2/1（rAAV2を/ 1）の注射であります、海馬など。 Thy1-GFPマウスの海馬におけるrAAV2を/ 1 mCherryをの発現がhippocampo-corticaの前およびシナプス後要素の同時可視化を可能にしますlは10をシナプス。 mCherryをののrAAV駆動発現は、軸索の端末で十分なレベルに到達するために、タンパク質のための2〜3週間を必要とします。この期間は、開頭手術からの回復のために必要な通常の時間と一致しています。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Drug&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>5-2% pre-operative</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AErrane 8DG9623</td><td>1.5-2% during surgery</td></tr><tr><td>Dexametasone</td><td>Scan Vet</td><td>Dexasone 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg intramuscular</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Tolfedine</td><td>Vetoquinol</td><td>4%</td><td>4 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/ml</td><td>2 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg subcutaneously</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>Lignocainum</td><td>topically</td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td>topically</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan dental; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Eye ointment</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>topically</td></tr><tr><td>CA glue</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>Dental acrylic</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tool&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HSE-64-0720</td><td>3 mm diameter</td></tr><tr><td>Dental drill</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>Fixation bar</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>M2 or M3 screw nuts could be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Imaging&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td></tr></tbody></table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Thy1-GFPレポーターマウスにおけるニューロンのサブセットにおけるGFPの発現皮質樹状突起とRSCの地方軸索投射のin vivoイメージングにできます。 図1Aは、目に見える複数のGFP陽性樹状突起の画像のスタックの最大投影を示しています。細胞体は、動脈によって隠されている。 図1Bは、図1Aに示された樹状分岐の単一の平面ズーム画...

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K ビュー.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

神経科学

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from subcellular to network levels and at temporal scales from milliseconds to weeks. In addition, two-photon imaging can be combined with a variety of behavioral tasks to explore the causal relationships between brain function and behavior. However, in mammals, limited penetration and scattering of light have limited two-photon intravital imaging mostly to superficial brain regions, thus precluding longitudinal investigation of deep-brain areas such as the hippocampus. The hippocampus is involved in spatial navigation and episodic memory and is a long-standing model used to study cellular as well as cognitive processes important for learning and recall, both in health and disease. Here, a preparation that enables chronic optical access to the dorsal hippocampus in living mice is detailed. This preparation can be combined with two-photon optical imaging at cellular and subcellular resolution in head fixed, anesthetized live mice over several weeks. These techniques enable repeated imaging of neuronal structure or activity-evoked plasticity in tens to hundreds of neurons in the dorsal hippocampal CA1. Furthermore, this chronic preparation can be used in combination with other techniques such as micro-endoscopy, head-mounted wide field microscopy or three-photon microscopy, thus greatly expanding the toolbox to study cellular and network processes involved in learning and memory.

This method describes a chronic preparation that allows optical access to the hippocampus of living mice. This preparation can be used to perform longitudinal optical imaging of neuronal structural plasticity and activity-evoked cellular plasticity over a period of several weeks.

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

行動学

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

<a href='https://app.jove.com/v/61970/transpupillary-two-photon-in-vivo-imaging-of-the-mouse-retina'>Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).</a>This video demonstrates a technique for in vivo retinal imaging using two-photon microscopy. Anesthetized mice are prepared for imaging by securing their heads, Applying eye lubricant, and placing a coverslip over the eye. Retinal ganglion cells (RGCs) expressing fluorescent proteins are first visualized using epifluorescence for alignment. Finally, two-photon imaging is employed, allowing for high-resolution visualization of RGCs.

Source: Wang, Z., et al.&#160;Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina. J. Vis. Exp.&#160;(2021).This video demonstrates a technique ...

同時2光子

要約

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特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

二光子

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニックマウス

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

同時2光子

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特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

生きたマウスにおける後部海馬CA1の縦方向2光子イメージング

二光子

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニックマウス