著者は、撮影の支援のための音声録音、図面のためのM. Borczyk、ウイルス産生のためのA.Trąbczyńska、遺伝子型決定のためのM.ZiókowskaとA. MirgosのためのM. Steczkowskiに感謝したいと思います。 KRはK. DeisserothからのCaMKプロモーターの制御下で蛍光タンパク質mCherryをを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）の寄贈を認めています。このプロジェクトは、欧州連合（EU）によって賄わCEPTインフラストラクチャを使用して、組織の構造と機能、神経生物学、実験生物学のNencki研究所のセンターの動物モデルおよび研究室の研究室の中核施設で行われた - 欧州地域開発基金の中を2007-2013のためのオペレーションプログラム「革新的な経済」。この作品は、国立科学センターからの助成金によってサポートされていました：ソナタビス2012/05 / E / NZ4 / 0299​​6、ハルモニア2013/08 / M / NZ3 / 00861、Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 KRとソナタビス2014年に/ 14 / E / NZ4 / 00172 RCへ

以下に記載されている全ての実験手順は実験生物学のNencki研究所、ポーランド科学アカデミーの地方倫理委員会によって承認されました。 注：関連したビデオ内のシーンの一部が加速されます。速度係数は、これらのシーンで示されています。 1.手術の準備<ol><li>オートクレーブ内の液体や綿棒のためのすべてのツール、ガラス容器を滅菌します。不要手袋を使用してください。手術台、定位フレーム、70％エタノールを持つすべての周辺エリアを清掃してください。すべての滅菌機器の滅菌のスペースを作成するために、無菌手術用パッドを使用してください。小片にゲルフォームをカットし、滅菌生理食塩水でそれらを浸します。 注意：実験動物の管理と使用に関する指針によれば、エタノールが滅菌剤でも高レベルの消毒剤でもありません。それだけで、以前に滅菌表面上の洗浄/脱脂剤として使用されるべきです。 </li><li>目に動物を入れて電子導入室/分2 Lを5％と酸素流にイソフルランレベルを設定します。この手順は、約3分を取る必要があります。 </li><li>誘導室から動物を取ります。動物が完全に鎮静剤を投与されていることを確認するために、尾や足指ピンチを使用してください。 </li><li>正確なトリマーを使用すると、目まで（耳の間の）頭の後ろから髪を剃ります。 </li><li>定位フレームに動物を置き、耳棒で頭を安定させます。 </li><li> 1.5から2パーセントイソフルランおよび0.3リットル/分の酸素に麻酔のレベルを設定します。 </li><li>眼軟膏を適用します。 </li><li>それぞれ、炎症、疼痛および感染を防止するためにTolfedine（4ミリグラム/ kg）を、Butomidor（2ミリグラム/ kg）およびバイトリル（5ミリグラム/ kg）を動物の皮下に注入します。 </li><li>脳が腫れ防止するために、デキサメタゾン（0.2ミリグラム/ kg）を筋肉内に動物を注入します。 注：デキサメタゾンを皮下に注入するか、腹腔内に、筋肉の損傷を防止することができます。 </li><li> Sを使用して、肌をきれいに70％エタノールに続いてベタジンとterile綿棒。 </li><li>手袋を変更し、70％エタノールでそれらをスプレー。 注意：滅菌野に触れないでください使い捨て手袋を使用している間。唯一の無菌手術器具や滅菌綿棒の先端で動物をタッチします。 </li></ol> 2.頭蓋窓手術<ol><li>鉗子で皮膚を持ち上げ、マイクロはさみを使用して、斜めの目の間のフロントポイントへのその後のヘッドのベースに沿って水平に皮膚を切開し、。皮弁を削除します。 </li><li>過度の出血や痛みを防ぐために骨膜に滅菌綿棒でリドカイン軟膏を適用します。 </li><li>骨膜を除去するために滅菌綿棒やメスを使用してください。滅菌綿棒で頭蓋骨を乾燥させます。 </li><li>滅菌針を使用すると、それらを固定化すると、歯科用セメントとの接触を防止するために、皮膚の縁に密なシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。 </li><li>トン以上の滅菌3ミリメートルのカバーガラスを置きラムダ縫合の前方彼は頭蓋骨。 RSCでカバースリップを中心座標：AP、ブレグマ-2.8; MLは、滅菌針で頭蓋骨の表面を引っ掻くことにより、0マークカバースリップのエッジをブレグマ。 70％エタノールで滅菌容器に戻しカバーガラスを置きます。 </li><li>直径3mmの円の輪郭を小径バリでの高速歯科用ドリルを使用してください。滅菌生理食塩水に浸漬綿棒で骨ほこりから掘削現場を清掃してください。時折出血を止めると骨をきれいにするためにゲルフォームと綿棒を使用してください。 </li><li>掘削の間で静かに骨の円をタッチし、その機動性をチェックすることにより、微細な鉗子で骨の厚さを確認してください。骨が縫合糸の領域に厚くなることに注意してください。骨円はモバイルで、骨のだけでも、薄層は円周上に放置した場合の掘削を停止します。生理食塩水を浸した綿棒で、残りのすべての骨ダストの運用フィールドを清掃してください。 </li><li>掘削CIRをカバーし、掘削領域に滅菌生理食塩水をドロップCLE。慎重に微細な鉗子で骨円を詮索してから慎重にしっかりと上向きにそれを持ち上げて骨を取り除きます。硬膜への損傷を防ぐためにそれを持ち上げながら骨円を歪曲しないように注意してください。 </li><li>静かに出血を止める助けるために硬膜に滅菌生理食塩水に浸したゲルフォームを適用します。すべての出血が完全に停止するまで待ちます。慎重に凝固プロセスを乱さないゲルフォームを削除します。 注：この時点で出血深遠であることを証明するかもしれないので、縫合領域は、高度に血管新生です。出血が完全に停止するのに十分な時間を待つことが不可欠です。氷の上に置くことによって冷却された生理食塩水に浸したゲルフォームを維持するために有用です。 </li></ol> 3.ウイルス注入<ol><li>定位塔に注入ポンプを取り付け、コントローラを接続します。 </li><li>注射器に35G針を挿入します。それを滅菌するためにエタノールで注射器を10回フラッシュし、滅菌生理食塩水で10倍電子の痕跡を除去しますthanol。シリンジから気泡を除去。ポンプ内に注射器を挿入します。 注：他の消毒剤を使用することを検討してください。 </li><li> （10 12 PFUが推奨されます）rAAV2を/ 1 mCherryを製剤の単回投与を解凍し、氷上で保管してください。ウイルス溶液で注射器を埋めます。 </li><li>ブレグマに針を中心にした後、静かに次の座標を用いて海馬に挿入：AP -2、ML +/- 1.0、DVを-1。これらの座標は開頭の​​縁の近くに配置されます。組織が安定するのを5分間待ちます。 </li><li> 50 NL / minの速度でrAAV2を/ 1 mCherryを溶液の0.7μLを注入します。ウイルスが完全に吸着するために10分を待ちます。そっと針を取り除きます。出血が発生した場合、ゲルフォームで吸い取ります。反対側のサイトで繰り返します。 </li></ol> 4.頭蓋窓の移植<ol><li>掘削サークルフレームにおける硬膜の上に滅菌、乾燥したカバーガラスを置きます。 FORCとカバーガラスを保持しますEPSは優しく硬膜を平らにし、カバーガラスをもたらすために「頭蓋骨の表面に近い縁。 注：カバーガラスは、血餅と出血が再開を妨害することが可能です。その場合は、カバーガラスを持ち上げアルコールに置き、乾燥と2.9のステップに戻ります。 </li><li>滅菌針を使用すると、頭蓋骨にそれらを添付するカバーガラスの縁に緻密なシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。 </li><li>頭蓋骨の前部に固定バー（M2ナットまたはカスタムメイドのデザイン）を配置します。バーの端の上にシアノアクリレート接着剤を適用します。接着剤が乾燥するのを待ちます。 <ol><li>イメージングセッション中に頭蓋窓の水平位置を可能にする位置に固定バーを配置します。窓からできるだけ遠くに配置します。それは窓に近づきすぎに配置されている場合は、カスタムメイドのホルダーとそれを連結バーとネジは、撮像プロセス中に目的のための障害物としてもたらす可能性があります。 </li></ol></li><li&gt;は、歯科用アクリルを準備し、ガラスの周りの頭蓋骨の表面にそれを適用します。ウィンドウの周りにクレーター状の形状を形成することが有用です。それは水の目的にイメージングのために、後に適用される水の空洞を作成します。 </li><li>頭蓋窓周りのクレーターを強化、操作領域、皮膚のエッジ、固定バーの残りの部分をカバーする、歯科用アクリルでキャップを作成します。歯科用セメントが硬化するのを待ちます。 </li><li>定位フレームから動物を削除し、回収室に入れて。 </li><li>生理機能を観察しながら、動物が手術から回復するのを待ちます。 </li><li> 48時間術後鎮痛（カルプロフェン、10mg / kgの）および抗生物質治療（バイトリル、5ミリグラム/キログラム）を適用します。 </li></ol> 5.イメージング<ol><li>チタンを起動：サファイアレーザー、パワーアップ顕微鏡。この実験で使用されるシステムは、二光子レーザー、OPOシステムとデュアルのGaAsP PMTを備えています。 </li><li> inducに動物を入れてションチャンバーと麻酔を誘導します。 </li><li>誘導チャンバーから動物を削除し、顕微鏡下でガス麻酔マスクに配置します。 0.3 L /分、百分の1.5から2にイソフルラン濃度に酸素流量を減少させます。 </li><li> M2ネジ（または他のカスタム・システム）を使用してカスタム顕微鏡フレームに動物を修正しました。頭蓋窓を水平に。 注記：特定のカスタムフレームは、より良い結果（改善されたヘッド安定性、慢性実験の間、複数のセッションに一定位置決め）を与えるが、顕微鏡メーカーの頭部固定システムを使用することが可能です。 </li><li>脳梁膨大後部皮質の側面の一方に広視野顕微鏡の設定と低倍対物センタービューを使用し、カバーガラス表面上に焦点を当てます。 </li><li>クレーター状のアクリルウェルに水の液滴を適用します。長距離水浸対物レンズに切り替えます。水のメニスカス詐欺まで、頭蓋窓に向かって目的を移動試料と目的をnects。 </li><li> 2光子の設定に切り替え、最低のズームを使用して、底部に試料上部のスキャンを開始。硬膜の交差は高い非特異的シグナルのグレアとして表示されます。 </li><li>ダイナミックレンジ全体をカバーするために、蛍光細胞からの信号強度に応じて両方のチャンネル（GFPとmCherryを）における顕微鏡取得設定を調整します。 </li><li> （他の細胞から分離された樹状突起付き）適切なニューロンを発見した後、最も低いズームと5ミクロンのz距離を持つ唯一のGFPフィルターセットを使用して初期スキャンを実行します。 </li><li>スキャンされたスタックの最大投影を取得し、注釈（反転色を使用）のためにそれを印刷してください。 </li><li>画像に対して所望の形態学的な詳細を可能にする値にズームを設定します。画像ガイドとして最大投影を使用して、GFPとmCherryをチャンネル全体の樹状ツリー。 </li></ol>

<ol>
	<li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Trachtenberg, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window.">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).</li><li>Chow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+compartmental+regulation+of+dendritic+growth+in+mature+cortex.">Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex.</a> Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+and+storage+of+spatial+information+in+the+retrosplenial+cortex.">Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).</li><li>Czajkowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superficially+projecting+principal+neurons+in+layer+V+of+medial+entorhinal+cortex+in+the+rat+receive+excitatory+retrosplenial+input.">Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input.</a> J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Couey, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+inhibitory+circuitry+as+a+mechanism+for+grid+formation.">Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation.</a> Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).</li><li>Miyashita, T., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+projections+from+the+hippocampus+to+the+retrosplenial+cortex+in+the+rat.">GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).</li></ol>

著者（KL、MR、KR）は、この記事で使用ホルダーフレームのための特許出願中（PL410001）の権限を持っています。

現在の論文では、頭蓋窓からRSCにおけるシナプス入力とシナプス後ターゲットのin vivoイメージングでの同時2光子のためのプロトコルを提示します。移植手順は、いくつかの重要なステップで構成されています。まず、動物が深く麻酔し、定位フレームに固定され、その後、RSC以上の頭蓋骨は、マークされた円形の線に沿ってドリルと円形の骨が除去されて薄くされます。出血?...

二光子顕微鏡は、生きている動物を振る舞うで脳活動の観察に革命をもたらしました。 1990年に導入されて以来、それはすぐに人気を博し、現在は生体内 1,2 における脳活動の多くの側面の検討に向けた最も興味深く、革新的なアプローチの一つとして実装されています。これらのアプリケーションは、（ 例えば 、カルシウムレベルのインジケータまたは即時初期遺伝子の発現を使用して）ニューロンの活性化を血流測定を含み、神経細胞の形態。研究室の増加数は、in vivo脳イメージングのための新しい標準として科学の世界全体の技術を実装し、2光子顕微鏡を使用しています。 標準的なアプローチは、マウス脳3のバレルまたは視覚皮質の上に頭蓋窓（カバーガラスで覆われた頭蓋内の丸い穴）の移植を必要とします。次に、実験プロトコルに応じて、畝SEは、時間4,5を介して脳の活動と神経細胞の形態の変化を監視することができ、可視化と行動訓練の一連のセッションを受けます。両方の場合において、開頭術は縫合糸を交差させず、頭頂骨に影響を与えます。主に技術の主な欠点は、バレルまたは視覚野など簡単にアクセス皮質への限られたアプリケーションであると考えられています。他の地域以上の頭蓋窓の移植は、過度の出血および/または空間的障害のために、多くの困難をもたらします。 本論文では、 生体顕微鏡 6 の 2光子のための目的の別の可能な領域として脳梁膨大後部皮質（RSC）上記の頭蓋窓の移植を提案します。 RSCは、空間記憶の形成に関与する脳回路の重要な要素です。解剖学的に、RSCは、皮質、海馬、および視床領域7を接続する神経ネットワークの一部です。それはそのような空間学習や絶滅だけでなく、空間ナビゲーション6として振る舞い、の範囲で深く関わっ。 我々は、THY1プロモーター下の緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックマウス系統を使用し、ニューロンの形態学的変化を視覚化するためです。これらのマウスでは、GFPは、二光子顕微鏡法8を用いて、皮質の軸索と樹状突起の明確な可視化を可能にする脳内のニューロンの約10％で発現されます。我々が提案するもう1つの技術革新は、RSCに突出した脳のより深い構造にニューロン特異的CaMKIIのプロモーター 9の下に赤色蛍光タンパク質（mCherryを）をコードする組換えアデノ随伴ウイルス血清型2/1（rAAV2を/ 1）の注射であります、海馬など。 Thy1-GFPマウスの海馬におけるrAAV2を/ 1 mCherryをの発現がhippocampo-corticaの前およびシナプス後要素の同時可視化を可能にしますlは10をシナプス。 mCherryをののrAAV駆動発現は、軸索の端末で十分なレベルに到達するために、タンパク質のための2〜3週間を必要とします。この期間は、開頭手術からの回復のために必要な通常の時間と一致しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Drug</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>5-2% pre-operative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>AErrane 8DG9623</td>
			<td>1.5-2% during surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexametasone</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td>Dexasone 2mg/ml</td>
			<td>0.2 mg/kg intramuscular</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>2.50%</td>
			<td>5 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tolfedine</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>4%</td>
			<td>4 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butomidor</td>
			<td>Richter Pharma</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>2 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen</td>
			<td>KRKA-Polska</td>
			<td>Rycarfa 50mg/ml</td>
			<td>10 mg/kg subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>Lignocainum</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>Jelfa</td>
			<td>20 mg/g</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Spongostan dental; REF MS0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Dedra</td>
			<td>Lubrithal</td>
			<td>topically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CA glue</td>
			<td>Pelikan Daniel</td>
			<td>20G Huste</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>SpofaDental</td>
			<td>Duracryl Plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>HSE-64-0720</td>
			<td>3 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Sigmed</td>
			<td>Keystone KVet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation bar</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>M2 or M3 screw nuts could be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Renex</td>
			<td>PN-7B-SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BM.183.180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>KOZO</td>
			<td>XTL6445T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder frame</td>
			<td>Custom made</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Upright Axio Examiner Z1</td>
			<td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus</td>
			<td>gift from K. Deisseroth</td>
			<td></td>
			<td>Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Thy1-GFPレポーターマウスにおけるニューロンのサブセットにおけるGFPの発現皮質樹状突起とRSCの地方軸索投射のin vivoイメージングにできます。 図1Aは、目に見える複数のGFP陽性樹状突起の画像のスタックの最大投影を示しています。細胞体は、動脈によって隠されている。 図1Bは、図1Aに示された樹状分岐の単一の平面ズーム画...

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Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

11.4K ビュー.  Nencki Institute of Experimental Biology. This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

ビデオ: Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

神経科学

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

同時2光子

要約

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この動画の章

二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

二光子

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

同時

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

同時2光子

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二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

内在性NADH蛍光の二光子イメージングによるマウス大脳皮質におけるMicroregional低酸素の検出

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

二光子

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

同時

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング