この手順は、学習タスクを実行しながら、記憶形成およびリコールのメカニズムを研究するために、生きているマウスの砂状海馬への繰り返し光学的アクセスを提供する。この技術により、光顕微鏡を使用して、数週間にわたってマイクロメートルレベルの空間分解能で生きたマウスの下側海馬を研究することができます。記憶喪失は、アルツハイマー病などのいくつかの脳疾患の一般的な特徴です。
記憶形成とリコールのメカニズムを理解することは、最終的にこれらの病気に苦しむ患者を助けることができる。この方法は、小さな哺乳類などの頭蓋骨を持つ他の動物システムに適用することができる。生存手術中にバイタルサインを監視することは、気が散り、ストレスを感じることができます。
最初に死んだ動物に対して手順を実行して、手順のより重要な側面に焦点を当てるのに役立つかもしれません。イメージングカニューレを準備するために、まず直径3ミリメートルのステンレス鋼管を1.6ミリメートルの長さの金属リングに切り取ります。切断後にリングのエッジが鈍くない場合は、凹凸を退出します。
次に、一対の鉗子を使用して、金属リングの片面をUV硬化光学接着剤に浸します。次に、金属リングをガラスカバースリップの中央に配置し、リングの側面をカバースリップに触れる接着剤で覆います。UV硬化LEDドライバーユニットをオンにし、接着剤に365ナノメートルの波長光を1分間照らして接着剤を硬化させます。
光源の方向を変更して、リングのすべての側面が均等に照らされていることを確認します。接着剤が少なくとも2時間硬化した後、止止めによって金属リングの開いた端からカニューレをしっかりと保持する。回転ファイルを取り付けた歯科ドリルを使用して、リングの側面と一緒に洗い流されるまで余分なガラスカバースリップを取り除きます。
必要な機器を準備し、付随するテキストプロトコルに記載されているようにマウスを麻酔します。その後、髪を取り除き、マウスの頭の上に皮膚を消毒します。次に、はさみと鉗子を使用して、ラムダに近い位置で頭皮に小さな切り傷を作ります。
耳の方向に横方向に移動し、眼窩の方向にロストラリーして矢状軸に約4ミリメートルのロストラルを形成します。頭蓋骨にリドカインの一滴を適用します。2分後、骨膜を取り除き、綿棒を使用して頭蓋骨を乾燥させます。
次に、マウスの頭部を固定するためにイヤーバーを置きます。0.5ミリメートル幅のバリを備えたマイクロドリルを使用して、矢状縫合糸から約1.5ミリメートル、冠状縫合糸から2ミリメートル遠位の画像化された海馬の反対側の前頭骨に小さな穴を開けます。その後、0.86ミリメートル幅のステンレススチール製の骨ねじを頭蓋骨の穴にねじ込みます。
接着セメントを使用して所定の位置に固定します。セメントを30秒から1分間乾燥させます。次に、直径3ミリメートルのトレフィンドリルを使用して、頭頂骨に小さな穴を開けます。
矢状縫合糸から約1.5ミリメートル遠位、ラムドイド縫合糸から2ミリメートル遠位の穴を配置します。骨のフラップを慎重に取り外します。その後、デュモン鉗子を使用して髄を取り除く。
皮質物質をアブレートして外部カプセルに到達する。真空ポンプに接続された19ゲージの鈍い針を使用し、生理的な状態で灌漑して、露出した組織の脱水を避け、出血が解決された後に残留血液を洗い流します。皮質がチングラムまたは脳梁の繊維を露出するカプセルから剥離するまで、一度に約50〜100ミクロンの皮質組織をゆっくりと吸う。
その後、最も深い繊維、海馬の子牛が露出するまで慎重に後部繊維を剥がします。終了したら、生理食い物で組織をすすきます。次に、薄い鉗子を使用して底カニューレを生理線に浸し、頭蓋骨の穴の上に置きます。
次に、ガラスカバースリップが繊維に接触するまでカニューレを頭蓋骨に押し込みます。頭蓋骨を乾かして、頭蓋骨の上に素早く粘着セメントを塗布し、カニューレを所定の位置に保持します。カニューレの縁にも接着剤を塗布するようにしてくださいが、カニューレに接着剤を入れないように注意してください。
乾いたら、ステレオタックスアームを使用して、頭蓋骨に接触するカニューレの上にヘッドホルダープレートを配置します。歯科アクリルの混合物を準備し、全体の頭蓋骨全体にそれを適用します。露出した頭蓋骨全体、ネジ、開いた皮膚を歯科用アクリルで覆い、準備を安定させます。
15分後、取り外し可能な粘着フィルムをヘッドホルダープレートに塗布し、カニューレに破片が入るのを防ぎます。脳を画像化する準備ができたら、麻酔の詳細については、付随するテキストプロトコルに従ってください。十分に鎮静したら、ヘッドホルダープレートから粘着フィルムを慎重に除去するために鉗子を使用してください。
準備を損なわないように、フィルムをやさしく取り除いてください。次に、顕微鏡の下にマウスをヒーティングカーペットの上に置き、ヘッドプレートをホルダーに固定します。動物の目に目の軟膏を適用します。
次に、注射器と細い針を使用してイメージングカニューレを洗浄し、脱イオン水をカニューレに滴下し、続いて真空ポンプで除去します。低倍率の長い作業距離の目標を使用して、カニューレの残留水、汚れ、完全性、蛍光の有無を視覚的に確認します。次に、ヘッドホルダーアームの角度を調整して、カニューレを視軸に合わせます。
1.0個の開口と4ミリメートルの作動距離で25倍の目標に切り替えます。その後、カニューレに十分な脱イオン水を加えて満タンにし、カニューレの上に余分な水を維持します。最後に、2つの光子励起を使用し、蛍光信号を画像化します。
ここに示されているのは、thy1-GFP トランスジェニック マウス脳からの 2P 画像スタックです。Thy1-GFPマウスは、錐体ニューロンのまばらなランダム集団においてThy1プロモーターの制御下で細胞質増強GFPを発現する。一般に、海馬CA1の大きさの錐体ニューロンの軸は、XYイメージング面に対してほぼ垂直である。
これらの領域は、撮像カニューレの下の体積におけるGFP発現のパターンを示す低倍率三次元スタックに手動でマッピングされる。縦方向追跡では、カニューレの視野内のいくつかの脳領域が定義される。各領域は約240×240マイクロメートルの面積に対応し、1〜7樹状セグメントを含みます。
ここでの画像シリーズは、CA1ピラミッド型ニューロンと基底樹状突起の1マイクロメーターzステップ画像スタックを14日間異なる時間間隔で取得した様子を示しています。ただし、長いイメージングの時間と間隔が可能です。ほとんどの画像は地層のオリエンスの樹状棘の画像ですが、層ラジウムの斜めの樹状突起で樹状脊椎を画像化することも可能です。
この技術のもう一つの拡張は、ウイルスベクターを用いて後部CA1海馬領域を注入することによってCA1ピラミッドニューロンにおける活性誘発可塑性を画像化することです。これにより、各動物の何百ものCA1ピラミッド型ニューロンの可塑性を2P画像スタックとしてここに示すことができます。上にある組織を取り除くときに海馬の損傷を防ぐことが重要です。
さらに、安定した準備を確実にするためにカニューレを正しく配置する必要があります。記載された調製物は動物の頭部に埋め込むことができるミニチュア顕微鏡のような光学のイメージ投射の異なった種類の使用を可能にする。これにより、研究者は自由に動く動物の神経活動に従うことができます。
もともと、この技術は海馬ニューロンの構造的可塑性を研究するために使用された。今日, 他の脳領域でも神経活動を研究する実装.
