この作品は、国立科学財団FIBR（NSF EF-0623664）とIDBR（NSF DBI-0754570）でサポートされています。この作品は、部分的に協力協定PHY 0120999の下でバイオフォトニクス、カリフォルニア大学デ​​ービス校で管理されるNSF科学技術センター、センターによって管理国立科学財団FIBRグラント0623664からの資金によってサポートされていました。リサLapidusは、博士の研究バローズウェルカム基金からの科学的界面におけるキャリア賞によって部分的にサポートされています。

<ol>
	<li>Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+and+mechanisms+in+protein+folding.">Fast kinetics and mechanisms in protein folding.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).</li><li>Hertzog, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtomole+mixer+for+microsecond+kinetic+studies+of+protein+folding.">Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding.</a> Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).</li><li>Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L.">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li><li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale.">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li><li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness.">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li><li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain.">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

それは長い生体分子の分子プロセスはピコ秒から秒に至る時間スケールで起こることが認識されているため、迅速な混合が長年のタンパク質の折り畳みのフィールドの開発を目標としてきました。従来のストップトフローミキサーは、主に乱流によって制限される1から5ミリ秒のデッドタイムを持っています。 30から300マイクロ秒の混合時間を持つ乱流連続フローミキサーは少数のグループで、過去15年間にわたって開発が、一般的にこれらの混合時間を達成するために、高流量を必要とするため、サンプル6-8の多くを使用しています。 このプロトコルは、層流領域で急激な希釈を達成するためのマイクロ流体混合チップの使用方法について説明します。そこにこの政権内での作業に複数の利点がありますが、プライマリは1つが混合応答を変更することができます高精度で全体の混合過程をシミュレートする機能があります。シンプルなGEOMで他のグループによって開発されたT-ミキサーetriesは、主にチャネル9から10のサイズによって制限された100から200μsの混合時間を実証した。 10μmの騎士にチャンネルのサイズをスケーリングすることにより約10μsの11に混合時間を減少させた。ヤオとBakajinは、ジオメトリの小さな変化は、混合時間4の大幅な改善につながる可能性があることを示した。しかし、その作業は、混合のその加速度も同様に遅い段階につながる可能性が示された。この作品は12月13日に使用されるデザインは変性剤濃度の遅い指数関数的減衰を最小限に抑えるために、また、DRIEエッチング機能は、より再現性のために参照4の2つの最高のデザインとの兼ね合いで決まります。 混合時間の定義を介して混合超高速の分野でいくつかの論争がありました。 &quot;混合時間&quot;と &quot;デッドタイム&quot;の違いを認識することが重要です。デッドタイム中にmeasuremen時間として乱流ミキサーで定義されていますtは作ることができないと、実際には、実際の混合時間よりも大幅に長くなる場合があります。これは通常、種々の濃度の擬似一次二分子反応（例えば、N bromosuccinateによるトリプトファン蛍光の消光など）のいくつかの測定を行うことによって決定されます。観測された指数減衰はt = 0秒と仮定し、単一の値に収束するために取り付けられており、そのポイントと最初の測定点間の時間がデッドタイムであるされています。デッドタイムの​​み、混合時間がありませんので、層流ミキサーでは、測定値は、混合プロセス中に行うことができます。混合時間は、単に十分な均一性に到達するまで、2つのソリューションを結合する時間です。我々はこれまでに10分の90時間、非混合値の10％から90％まで減少させる変性剤の濃度の時間になるように混合時間を定義しています。しかし、ミキシングカーブの形状は、小さな指数成分を有する減衰の尾を持つ完全に対称ではありません。さらに、タンパク質のフォールディングは持って変性剤濃度の非常に非線形依存性その折りには、多くの場合、変性剤のみ2倍削減されている場合でも開始できるようにします。そこで我々は、より最近では80％変性剤濃度を低減するための時間として、混合時間を定義しています。確かに他の定義は、実験の要件に応じて使用することができます。 タンパク質の折りたたみを研究するために、このミキサーの使用が一貫して驚くべき結果を明らかにした。シトクロムcやアポミオグロビンの折り畳みが長く連続した流れミキサーを持つ複数の折り畳みステップと初期の結果を持って研究されている〜100μsのタイムスケール10,14-15で発生する崩壊を示した。このミキサーで我々の測定は（遅い相に続いて、ミキサーの混合時間内に、非常に高速で、おそらく非特異的、崩壊（などのTrpの蛍光スペクトルシフトにより測定）は、このスケールの少なくとも2つのステップがあるように見せ総Trpの発光の消光によって測定される）可能性がfであることネイティブ構造5のIRST形成。また、このタンパク質は2ステートフォルダ13であるという従来の解釈を覆す、プロテインLのB1ドメインに50μsのプロセスを観察した。 この急速なミキサーの利点は、通常はナノ秒T-ジャンプの楽器で測定可能なされている最速の折りたたみ、タンパク質の折りたたみを調べることができるということです。 T-ジャンプは、通常、タンパク質の融点に近い温度緩和を折る/展開の観察を必要とするため、全人口の折りたたみに続くことはありません。このミキサーで我々はTrp総排出量とスペクトルシフトの両方でγ-リプレッサーの折りたたみ（λ6から86）を見ていると蛋白質は、以前のTにアクセスできなかった強い折り畳み条件の下で折りへの障壁を持っていないことを示す証拠を発見した·ジャンプの測定12。最後に、ビリンのかぶとHP-35、Tのいずれかの折りたたみを測定した彼最速のフォルダは、まだ測定し、混合後に測定した折りたたみ式の速度が同じ条件で16歳未満のT-ジャンプによって測定より〜5倍遅いことがわかった。これは、折り畳み速度が分野における主要な前提を覆す、開始条件に依存していることを示唆している。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> AZ P4110レジスト</td><td> AZエレクトロニックマテリアル</td><td></td><td></td></tr><tr><td> AZ 400 K開発</td><td> AZエレクトロニックマテリアル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベイカーPRS 2000フォトレジストストリッパー</td><td> Avantorのパフォーマンス·マテリアル</td><td></td><td></td></tr><tr><td> AquaBond </td><td> AquaBondテクノロジーズ</td><td> AquaBond 55 </td><td></td></tr><tr><td> 500μmのカバーウエハ</td><td> SENSOR準備サービス</td><td></td><td> Ø：100ミリメートル±0.5ミリメートル 板厚：0.5 mm±0.025ミリメートル 標準公差（記述のない限り） 表面仕上げ：SI：4-8A、SII：8-12A 干潟：OneプライマリSEMI-STD; Oneスクライブ 清潔で磨かれた、両側</td></tr><tr><td> 170μmのカバーウエハ</td><td> SENSOR準備サービス</td><td> 7980 2Gウェーハ</td><td> Ø：100ミリメートル±0.5ミリメートル 厚さ：0.17ミリメートル±0.025ミリメートル 標準公差（記述のない限り） 表面仕上げ：SI：4-8A、SII：8-12A 干潟：OneプライマリSEMI-STD; Oneスクライブ 清潔で磨かれた、両側</td></tr><tr><td>酸化物の深い反応性イオンエッチング装置</td><td>アルバック</td><td>アルバックNL-6000 </td><td></td></tr><tr><td>アルゴンイオンレーザー</td><td>ケンブリッジレーザー研究所</td><td>レクセル95-SHG </td><td> λ= 258 nmの</td></tr><tr><td>アルゴンイオンレーザー</td><td>メレスグリオ</td><td></td><td> λ= 488 nmの</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX-51</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡対物</td><td>トールラボ</td><td> OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA </td><td> λ= 258 nmの</td></tr><tr><td>顕微鏡対物</td><td>オリンポス</td><td> UPLSAPO 60XW 1.2 NA </td><td> λ= 488 nmの</td></tr><tr><td> Nanopositioner </td><td>マッド·シティラボ</td><td>ナノLP100 </td><td></td></tr><tr><td>電動翻訳ステージ</td><td> Semprex株式会社</td><td> KL-シリーズの12から6436 </td><td></td></tr><tr><td> GaAsPのフォトンカウンター</td><td>浜松市</td><td> H7421-40 </td><td></td></tr><tr><td>モノクロ</td><td>ホリバ·インスツルメンツ株式会社</td><td> MicroHR </td><td></td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td>アンドールテクノロジー</td><td> IDUsの420A-BU </td><td></td></tr><tr><td>塩酸グアニジン（GuHCl） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><tD&gt; G4505 </td><td></td></tr></tbody></table>

microfluidic mixers for studying protein folding

そのネイティブなコンフォメーションにによるタンパク質の折り畳み過程は、まだ、まだよくわかっていない生物学と人間の健康との関連性が高いです。この理由の1つは、折りたたみがタンパク質1に応じて、ナノ秒から秒以上に、スケールの広い範囲で行われます。従来のストップトフローミキサーは約1ミリ秒から始まるフォールディング動力学の測定を可能にしました。我々は最近〜8μsの2の変性剤は、〜100倍に希釈しマイクロミキサーを開発しました。ストップトフローミキサーとは異なり、このミキサーは発生しない乱流の層流領域で動作します。乱流の不在3-4実験するための優れた合意をミキサー内のすべてのフローの正確な数値シミュレーションを可能にします。 層流は、レイノルズ数のために再 ≤100を達成しています。水溶液の場合、これはミクロンスケールのジオメトリを必要とします。我々は、シリコンまたは縮合SILIとして、ハードディスク基板を使用（ 図1を参照）5-10μm幅10μmの深いチャネルを作るため、CA、。最小寸法は、混合領域の入り口に、サイズが1μmのオーダーである。チップは、光アクセスのための薄いガラスや石英ガラスカバーガラスで封入されている。典型的な総線形流量は 、Re〜10を得た〜1 m / sであるが、蛋白質の消費量は〜0.5 NL / sまたは1.8μL/ hrです。タンパク質濃度は、検出方法によって異なります。トリプトファン蛍光は典型的な濃度は100μM（1トリプトファン/蛋白質）であり、FRETのための典型的な濃度は、〜100nmである。 折りたたみ過程は、6 Mから0.06 M塩酸グアニジンに変性剤の急速な希釈によって開始されます。高変性剤の蛋白質は、中央のチャネルの下を流れ、変性剤（ 図2を参照してください）〜100倍も速く移動せずにバッファによって混合領域でどちら側でも満たされます。このジオメトリは、狭い中にタンパク質の流れの急速な収縮を引き起こすジェット〜100nmの広い。重いタンパク質分子の拡散が非常に遅いですが、光変性剤分子の拡散は1ミリ秒に1μm以下の拡散は、非常に急速である。蛋白質の周囲に変性剤の有効濃度を減少させる変性剤とタンパク質のストリームから変性剤の急速な希釈におけるタンパク質の結果の拡散定数の差。タンパク質のジェットは、走査型共焦点顕微鏡5を使用して観察することができる折り畳み中のタンパク質の観察チャネルおよび蛍光下に一定の速度で流れている。

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Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

この研究では、〜8マイクロ秒で2つの溶液を混合することのできるマイクロミキサーの作製と使用について説明します。また、UV蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて分光検出とこれらのミキサの使用方法を示しています。

タンパク質の折り畳みを研究するためのマイクロ流体ミキサー

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K ビュー.  Michigan State University. この研究では、〜8マイクロ秒で2つの溶液を混合することのできるマイクロミキサーの作製と使用について説明します。また、UV蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて分光検出とこれらのミキサの使用方法を示しています。