初期計測セットアップとテスト支援、トニー Kulesa、ロビン カークパ トリックとエバンゲロス Gatzogiannis に感謝します。我々 はさらに重要な助けを書くとトラッキング ソフトウェア カスタマイズされた単一粒子を評価いただきトニー Kulesa をありがちましょう。この作品は、スタートアップ資金とバローズ Wellcome 財団から (PCB) に科学的なインターフェイスでキャリア賞を受賞によって支持されました。

1 ビオチン λ DNA の準備 注: ビオチン λ DNA の分子はビオチン標識オリゴヌクレオチド、5 を縛ることにより作製した &#39;-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - ビオチン - 3 &#39; に。Λ DNA 分子 20。
<ol><li>準備 0.1 mM ビオチン標識オリゴ TE バッファーで</li>。
	<li>60 65 ° C で熱 0.5 mg/mL λ DNA 株式 s およびすぐに濡れた氷に突入 。
	注: 高速急冷 λ DNA concatemerization を低減します</li>。
	<li>微量遠心チューブに λ DNA の解決のピペット 100 μ L.</li>
	<li>TE バッファーの 9 μ L に 0.1 mM oligo の追加 1 μ L.</li>
	<li>Λ DNA を含む遠心チューブにオリゴ ソリューションの追加 2 μ L。ミックス徹底的 。
	注: オリゴが相補的な λ DNA の端に約 12-fold モル過剰に存在します</li>。
	<li>60 65 ° C で λ DNA/オリゴの混合物を熱 s.</li>
	<li>はゆっくりと部屋の温度に混合物を冷却します 。
	注: この手順により、相補的な λ DNA の端にアニールするオリゴ</li>。
	<li>は、氷の上の混合物を配置します。T4 DNA リガーゼ反応バッファーの 11 μ L を追加 (最後のバッファー濃度 1 x)。優しく混ぜます。T4 DNA リガーゼの酵素の 2 μ L (800 台) を追加します。優しく混ぜる</li>。
	<li>2 h、16 ° C または一晩 4 の混合物をインキュベート ° C</li>
	<li>は、遠心フィルター チューブを用いた 100 kDa の分子の公称重量制限製品を浄化します。具体的には、遠心フィルター チューブおよび 14,000 x g で 5 分間遠心にステップ 1.9 混合物を転送、400 μ L TE バッファーで 2 回洗浄、精製された製品を収集します 。
	注: として精製ビオチン-λ-Dna TE バッファーで、1 年間、-20 ° C で安定した</li>。
</ol> 2。Coverslip 機能化 注: ガラス coverslips はシラン-ペグ-ビオチンとの反応による官能基化します。このワンステップ反応プロトコルは、単純な標準の 2 段階反応プロトコル 20 我々 の経験でより信頼性の高いです。Coverslip 機能化シラン-ペグ-ビオチンとストレプトアビジン結合部位を作成し、非特異的な DNA と coverslip 表面へのタンパク質の吸着を最小限に抑えます。
<ol><li>Sonicate 5 号 1 coverslips 汚損の内 95% エタノールに 10 分間 jar し、3 回純水で洗い流しします 。
	注: 5 番目の coverslip 破損の場合スペアを提供します</li>。
	<li>1 M コで染色の瓶を埋める、10 分間超音波し、3 回純水で洗い流しします</li>。
	<li>2.1 2.2 サイクルを 2 回繰り返します</li>。
	<li>乾燥きれいな乾いた N 2 ガス流 coverslips</li>。
	<li>さらにきれいにし 5 分間 900 mTorr 圧空気プラズマ処理を適用することによって coverslips を乾燥</li>
	<li>25 mg/mL シラン-ペグ-ビオチン具体的には 2 のため室温で 95% エタノールに溶解と coverslips を孵化、2 つのきれいな乾いた coverslips 間 50 μ L シラン-ペグ-ビオチン ソリューションをサンドイッチ、インキュベート、coverslip &#34; サンドイッチ &#34;(coverslips) 接触していない下部に水の約 10 mL の閉じたピペット チップ ボックスの内側溶媒蒸発を最小限にします</li>。
	<li>洗い流す純水とペグ コーティング下 coverslips きれいなドライ余分な PEG 分子乾燥 N 2 ガス流れ 。
	注: 官能 coverslips に格納できる周囲条件下で 3 日間にします</li>。
</ol> 3。細胞構築の流れ 注: フローセル、カット済みのチャンネル間でダブル粘着テープを挟むによって構築され、PEG 修飾 coverslip と入口と出口の穴を含む PDMS スラブ。フローセルあたり複数のチャネルを統合します。
<ol><li>CAD ソフトウェアで流路を設計し、ダブル粘着テープのテープ カッターを使用して (幅、深さおよび各チャネルの長さが 12 mm、0.13 1 それぞれ) チャンネルをカット (通常 8 つのチャンネルをフローセルあたり統合します)。テープ残差流路を形成するを削除します</li>。
	PDMS スラブにする <li>は徹底的に PDMS (12 5 mm 厚 PMDS スラブ周囲条件下で無期限に格納できるを作る十分な) 架橋結合の試薬の 5 g と 45 g を混ぜるミキサーを使用して、2 つの 10 cm のシャーレに混合物を注ぐし、を残して、本質的にすべての気泡まで真空チャンバ内の料理がなくなっている (手動で空気の泡を削除する真空チャンバーから削除されると、料理が残っている場合)。PDMS 凝固 (約 2 h) まで 80 ° C のオーブンに料理を転送します</li>。
	<li>は、カット済みのチャンネルを持つダブル粘着テープのサイズに一致する PDMS スラブをカットしました。皮 1 つ保護フィルム両面テープをオフし、PDMS スラブの平らな面にフィルムを付着します。23 g 針生検の穴パンチャーを使用して PDMS スラブの出口と入口の穴をパンチします</li>。
	<li>ダブル粘着テープを 2 番目の保護フィルムをはがし、付着、coverslip の機能面に PDMS テープ アセンブリ (、coverslip がフラットであることを確認してください。 図 1 a に完全に組み立てられた流体セルの図を参照).</li>
</ol> 4。全反射イメージング 注: ビオチン λ Dna を流れチャネル表面に繋留し、流を適用して流ストレッチ DNA 分子 ( 図 1 b)。&#62; 80% が蛍光に分類された分子の結合と輸送活性を観察するための空間拡張テンプレートとして DNA 分子サーブを伸縮します。単一分子の軌道を追跡タイムラプス全反射蛍光イメージング法を用いた ( 図 1 c &#38; e).
<ol><li>顕微鏡ステージと負荷前脱空バッファー (10 mM リン酸ナトリウム、2 mM の NaCl、50 μ M EDTA、20 mM のエタノール、グリセリン 5% (v/v)、0.01% Tween 20、1% (v/v) β-メルカプトエタノール、pH 7.4) のフロー ・ セルの修正 0.2 mg/mL のストレプトアビジン溶液、1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションおよび各ソレノイド値接続タイゴン チューブ、PEEK チューブ上小さい PEEK チューブ (タイゴン チューブをスリーブで接続別のタイゴン チューブ 4 つの貯水池に 100 pM ビオチン λ DNA ソリューション試薬の逆流を防止します)。真空に一晩露出または (泡が表示されなく) まで攪拌真空への短い露出によってバッファーの小さいボリュームをドガします</li>。
	<li>は、フロー ・ セルの 1 つの入口の穴に空白バッファー貯水池の PEEK チューブを挿入します。空のバッファーに流れることによってチャネルを首相し、各試薬の流れを駆動空気圧を電磁弁で制御し、を介してコンピューターのスクリプトを完全に自動化の入口の穴に他の 3 つの PEEK チューブを挿入します。チャネルの空気泡の形成を誘導するように注意してください</li>。
	<li>は、廃棄物コンテナーにコンセントの穴から短い PEEK チューブ タイゴン チューブを接続します。コンセントで短い PEEK チューブによりチャネル内の肯定的な圧力を維持することによって液注入時に気泡の空気を抑制します</li>。
	<li>フロー チャネル表面にビオチン λ DNA 分子をテザリングします。
	<ol><li>フロー 0.2 mg/mL ストレプトアビジン溶液で 5 分間インキュベートし、非連結ストレプトアビジンを洗浄する空のバッファーで、フローします</li>。
		<li>フロー 1 Mg/ml BSA 解決で 1 分間インキュベートし、非連結の BSA を洗浄する空のバッファーで、フローします 。
		注: さらに BSA を抑制する DNA サンプル表面への吸着と</li>。
		<li>フロー 100 pM ビオチン λ DNA ソリューションで 10 分間インキュベートし、非連結の Dna を洗浄するための空のバッファーで、フローします 。
		注: 表面に DNA をバインドすると、テザーの DNA の分子への損傷を防ぐために速い流れを避ける</li>。
	</ol>
	</li>官能 coverslip の品質をチェックする <li>DNA アッセイ条件下でオレンジ Sytox などの色素を染色するため (読み取り 4.6)、流れし、蛍光下で 532 nm レーザー照射を開始します 。
	注: 官能 coverslip の品質が良好であり、伸ばして流れ DNA 分子の密度が高くなります。DNA 結合およびスライド/1 D 拡散イベントを検出できるので、伸ばして流れ DNA 分子の十分に高い密度を持つことが不可欠です</li>。
	<li>最高の信号対雑音比の伸ばされた DNA の分子 ( 図 1 d) の画像を達成するために全反射角度の微調整をします</li>。
	単一分子、DNA の方向移動の軌跡を記録する <li>(DNA 染色色素)、なし 4.2 4.4 新しいチャネル内の手順を繰り返し、シリンジ ポンプを使用して十分に高い流量で分子を標識済み脱サブ ナノモル fluorophore を吹き込むと100 Hz のフレーム レートとタイムラプス蛍光画像を収集します 。
	注: 流量ワイゼンベルグ数に相当 (Wi: 約 0.2 最長高分子緩和時間 - の無次元の製品 - λ DNA のせん断速度 - coverslip の表面からの距離と流速の変化 s) 500 の中のフレーム レート 100 Hz 21 の 1 分子イメージングにはチャンネルをお勧めします。
	<ol><li>収集 10,000 フレーム、映画を制作し、サンプルあたり複数 (通常は 10) FOVs から似たような映画を収集に、1 つの視野 (FOV) で 。
		注: 1 つの視野の単一粒子の密度する必要がありますどちらも高すぎる - DNA の単一分子イベントの発生率は低いにつながる可能性がありますあいまいでも低すぎる - フレーム間でオブジェクトを代入することによってデータの分析が複雑になりますが</li>。
		<li>が照度を最適化 coverslip 表面にバインドされている分子はすぐに抑制する長時間の軌跡を検出する分子 DNA の拡散が余りにすぐに無漂白、背景に写真漂白します 。
		注: 我々 は通常、FOV で 200-800 W/cm 2 の出力密度を使用しています</li>。
	</ol></li> <li>4.6 のステップの最後に、DNA は DNA 分子が流ストレッチをすることができますまだ確認する色素を染色を吹き込む</li>。
	<li>は、両方の正と負のコントロールのサンプルを実行します 。
	注: 良い肯定的な制御は、tetrapeptide、TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR は N ターミナル アミンと結合) 10.5 ± 0.7 (標準エラー出力) M 平均 1 次元拡散定数を持っている (bp 2/s) 中性 pH 11 時。良いネガティブ コントロール アッセイバッファー テザー、DNA に普及活動を検出するない DNA を持たないチャネルの興味のラベル付きのサンプルを測定することです</li>。
</ol> 5。データ分析: 注: カスタム単一粒子追跡ソフトウェアは DNA に沿って拡散する分子の軌道を識別し、拡散定数を推定するために使用します。このソフトウェアは、高い精度で単一粒子の重心位置 coverslip 表面に立ち往生している粒子を識別し、コマ撮りの軌道を形成するための別のフレームでパーティクルとリンクにまず決定します。1 次元拡散定数の推定これらの軌跡から。
<ol><li>スクリプト ソフトウェアを開き、データの分析を開始 (材料の表を参照)、単一粒子追跡ソフトウェアのディレクトリに移動します。という名前のスクリプトを開いて &#34; largedataprocess3.m &#34;。定義する 1 つの重要なパラメーターは単一の粒子の検出のしきい値値</li>。
	最適なしきい値を決定するための <li>を実行、&#34; Determine_threshold_value.m &#34; スクリプト。このスクリプトは、単一粒子の検出に影響を与える値がしきい値を示します。最適なしきい値を決定した後を実行、&#34; largedataprocess3.m &#34; スクリプト</li>
	<li>単一粒子の完了後追跡の分析、実行して、生の軌跡をフィルター、&#34; Trajectory_filtering.m &#34; スクリプト。グラフィック ユーザー インターフェイス (GUI) がフィルタ リングの手順を視覚化に組み込まれています</li>。
	<li>上の GUI パネル、DNA、MinXDisp、に沿って最小限の変位を 2 ピクセルに設定最大変位を 2 ピクセルに dna、MaxYDisp、横設定フレーム、minFrames の最小数を 10 に設定; minTriplets、三重項状態の最小数を設定10;DNA、D_par、に沿って最小限の拡散定数を 0 に設定します。10 M (bp 2) S -1 に、dna、D_trans、横最大推定拡散定数を設定します。最小限の統計パラメーター集 2 _stat-5; に設定します。2 dna、ミンクス/Y、その横に DNA に沿って変位の最小限の比率を設定します 。
	注: これらのパラメーターをフィルター処理を渡すすべての生の軌跡が表 1 に記載されて、かどうかは、表 3 に記載されています</li>。
	軌道上の <li>をクリックして番号を表 1 に、グラフィック 1 の軌道が避難されます &#38; 2。クリックして、&#34; プレイ &#34; 生蛍光画像を再生します。クリックして、&#34; Add_to_Table2 &#34; 単一分子軌道をスライドとして軌道を識別します。最終的には、GUI を閉じるとき表 2 に追加されますすべての軌道は保存されます</li>。
	平均拡散定数を計算する <li>スクリプトを実行 &#34; Calculate_mean_diffusion_constant.m &#34;。軌道がすべてフィルタ リング手順を渡され、表 2 に追加されたセットから平均拡散係数を推定します</li>。
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57, 179-186 (2012).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

ブロード研究所は、ここで提示された作業の側面を含む特許出願のファイルに選ぶかもしれません。

伝統的な 2 段階 coverslip 官能基化反応プロトコルからワンステップ反作用のプロトコルへの切り替え、我々 は coverslip の機能化の信頼性が大幅に向上することに気づいた。Coverslip の準備のための合計の体験時間は 30 分以内、計画は新鮮な coverslips に各日 1 分子イメージングを準備をお勧めします。シラン-ペグ-ビオチンの劣化を最小限に抑えるため、試薬を避けようと受領-20 ° C で乾燥 N2ガスで必要があります。ここで生成 -COO- PEG 分子または過去20で使用されている CH3端末グループを使いません。-COO-グループおよび疎水性の CH3基の負電荷はそれぞれ表面に DNA 分子の特定の蛋白質のサンプルの無指定の吸着を防ぐために利用されました。シラン-ペグ-COOH やシラン-ペグ-CH3特定蛋白質のサンプルのアッセイに有用である可能性がありますまたはアッセイ条件のとき完全にビオチン終了 PEG 表面上小ペプチドのサンプルで非常に低い表面吸着遵守 (pH など &#60; 7.5)DNA ・表面相互作用を促進します。
ガラス スライド フロー セルから PDMS 流への移行細胞流れ細胞構築を高速化、複数チャンネルの簡単な統合を可能に。私たちはしばしば官能 coverslip あたり 8 つの独立した実験を有効にフローセルあたり 8 つのチャンネルをエンジニア リングします。Coverslip あたりのスループットを増やす、微細加工したチャンネルのさらに大きな数を使用できます。
任意の時点でチャンネル内初期充填後空気泡の形成を防止することをお勧めします。通常、空気の泡を引き起こさないテザー Dna の損失 (が可能です)、しかし、むしろ流れが中断され、coverslip に固執する Dna を引き起こす可能性。バッファーが脱ガスと小さな界面活性剤量の添加は、通常チューブとフロー チャネル内の泡の形成を防止するに効果的。チューブに気泡を導入する場所の場合、低速流の下で泡を洗い流すし、Dna を繋留領域を通じて彼らフローしないことを確認しなさい。
合理的および効率的なデータ解析ソフトウェアは、生成されたデータの巨大な量のため重要です。我々 は通常カスタム シングル パーティクルをクアッドコアのプロセッサと 32 Gb のメモリを持つデスクトップ コンピューターで 1 日以内のトラッキング ソフトウェアを使用して処理することができます 1 つのフローセルの測定から 700,000 の高解像度画像を収集します。ソフトウェア (ステップ 5.5) による 1 次元拡散軌道の検出の偽陽性率はサンプル依存、つまり非常に低くすることができます: 1) フレーム (間で粒子のリンク少し曖昧さがあるよう、FOV で単一の粒子の密度が十分に低い一般に蛋白質のサンプル、ペプチドのサンプルより、coverslip への非特異的な吸着が発生しやすく、したがって、バッファーおよび蛋白質ごとの電力密度のサンプルを最適化する必要があります)。2) 信号対ノイズ比単一粒子は、粒子の false を識別可能性が低いために、十分に高いです。それでも、時折誤りをおかし、ソフトウェアとソフトウェアのパフォーマンスを評価する提供される GUI を使用して、データの手動の検査をお勧めします。軌道の誤検出に特に敏感なアプリケーションでプロセスしきい値、minFrames、minTriplets、カイ2_stat など設定できますより厳密 true バインドの低感度を犠牲にしてイベントは、軌道の同定における統計的なバイアス増える可能性があります。ここでは共有し、希望のデータ分析手法を標準化し、ベスト ・ プラクティスについての議論を刺激するための支援ソフトウェアを追跡私達の単一粒子を記述します。
ホッピングにより拡散する場合、またはテンプレートの DNA 分子の伸ばされた状態を維持するために、イメージング中に連続的な流れを必要とする我々 のプロトコルで流体の流れが DNA テンプレートに沿っていくつかの蛋白質の輸送を偏らせうる流体ラベル付きの fluorophore の半径は大きい22,23です。このようなバイアスを測定およびほとんどのデータセットで修正できる、蛋白質の輸送の付いた小さな fluorophore とスライド機構による拡散はバイアスされていません通常検出可能な程度に流れ2,4、 24。特に、dna 結合蛋白質の輸送の流速の影響は蛋白質 DNA23に沿って拡散のメカニズムの研究に使用されています。密接に関連の流れのない状態で測定を可能にする別の方法を利用して一過性流れで伸ばしている両方のテルミニでビオチンと DNA テンプレートとの DNA 分子である coverslip のように両端でつながれた、25,26,27,28オフに流れのある拡張構成。ダブル テザー アプローチ フロー無料輸送実験をできるという利点を持って、テザリングとつなぎ縄でつながれた 2 つのサイト間の距離を評価中に慎重なフロー制御テンプレート dna の両端を変更することが必要です。さらに、異種の張力および DNA 一分子アッセイ上の DNA 分子間での構造変化ダイナミクスの影響が評価されなければなりません。
完全に、DNA 分子の 1 次元拡散を検討するほか、報告として単一分子アッセイの寄与できる多くの in vitro生化学的そして DNA を含む単一分子レベルでの生物物理学的研究対象によって検索プロセス蛋白質、dna、酵素など。
トラブルシューティング
問題 1: 流路をリークします。
解決方法: まず、流路の設計では、シールの周りとチャンネル間の少なくとも 1.5 mm の余白を確認します。その後、フロー ・ セルの組み立ての際に、coverslip、ダブル粘着テープと PDMS スラブとの間の接触面が平らな、乾燥した破片のシールを形成するための加圧が均一、無料と封止の操作があることを確認してくださいと部屋の温度で行います。
問題 2: 連結 DNAs の密度が低すぎます。
解決方法: この問題が発生 PEG 化効率が低いまたは DNA 分子がビオチンと機能しないとき。私たちの経験からテザー DNA の密度が高にする必要があります &#62;、coverslips の 90% 新鮮な準備やシラン-ペグ-ビオチン試薬を正しく保存します。場合つなぎ縄でつながれた DNA の密度がビオチン λ DNA の実績のあるバッチが低いときは、PEG 化とストレプトアビジンとビオチン λ DNA の濃度の間に DNA のテザリング中にシラン-ペグ-ビオチンの濃度を高めるみてください。これが失敗した場合は、PEG ストレプトアビジン試薬を交換してください。
問題 3: Dna、coverslip に固執します。d は、流れによってはストレッチできません。
解決方法: PEG 化効率が低い、低アッセイ pH によって深刻化と、この問題が発生もことができます。試してみて流れるより BSA または (ステップ 4.3.2) 表面への DNA の吸着を抑制するため (例えば、8.0) pH を上げます。DNA の吸着が特定のアッセイ条件の下で永続的な問題なら、PEG 化中 90% シラン-ペグ-COOH を含みます。
データ分析に関する注意事項:
我々 はから DNA に沿って拡散する分子の軌道を識別するためにカスタムの単一粒子追跡ソフトウェアを使用して 1 次元拡散定数、D1 が見積もられています。データ分析を高めるためには、粒子および劇的に損なうことがなくデータ分析を高速化 1 次元拡散定数の推定共分散に基づく推定19ローカライズの放射状対称アルゴリズム18を実施精度。以前、模擬データ11を分析することによって、カスタム ソフトウェアを検証しました。主な手順は次のとおりです。
粒子識別:
この手順は、検出と粒子の回折限界のスポット - 背景からの分割です。まず、空間的帯域通過フィルター 3 5 (私たちのシステム点広がり関数のサイズにあたる) のピクセル範囲とし、しきい値の強度に基づいて粒子の信号を向上させるイメージ (スクリプトを参照してください: spt2_SD_sandbox.m)。
重心の割り当て
ピクセル レベルの空間解像度に分子をローカライズのみイメージを分割します。はるかに高い精度に分子をローカライズするのには上記の画像を超解像アルゴリズム18フィルター放射状対称を採用してください。(このメソッドは解析的計算に基づいており、したがって 2次元ガウシアンフィッティングなど他の人気のある高精度の方法と比較して計算の負担を大幅に軽減 (スクリプトを参照してください: spt2_SD_sandbox.m) です)。
粒子追跡:
時間によって粒子の軌道を追跡するためやフレーム間を移動再同じ粒子を識別する必要があります我々。軌道のコンポーネントの開始、点滅、および終了の段階と考えています。我々 は、フレームごとに許可される最大変位によって以前のフレームで表示される現在のフレームでパーティクルのリンケージを制限します。複数の連携が可能な場合、ヨンカー Volgenant アルゴリズムを使用グローバル最適リンケージ セットを生成して (スクリプトを参照してください: traceTraj4_kx.3.m)。
D1 の推定:
軌道から D1 の値を推定、推定量の共分散に基づく (CVE)19を使用します。分析の計算に基づいて、このメソッドはより計算上効率的で、他のより厳密な統計的によく使われる平均二乗変位の回帰などの方法 (スクリプトを参照してください: runspt5_SD.m)。
軌道がフィルタ リング:
いくつかの軌道表面結合分子へのリンクなどのアイテムを含む、削除する必要があります。我々 は DNA、DNA、軌道、最小限のトリプレット連続検出位置、最小の確率のスコア (熊ら11 を参照してくださいの最小限の長さに横最大変位最小変位などいくつかの機能を実装定義の) 最小バイアス セット分子 DNA の拡散を表す可能性が高い軌道を分離するフィルター処理できます (スクリプトを参照してください: sptViewFig2_update3x.m)。

生物学における長年の問題は特定の行為どの内因性のタンパク質のゲノムのサイトは存続し、その環境に効果的に対応する有機体のために十分にすぐに彼らの DNA ターゲットを見つけることができます。過去 40 年間の研究により、DNA 論ターゲット蛋白質によって検索をする仮説によって加速できるサポート主促進された拡散するタンパク質と交互に、一括で 3 D 拡散 (を含む 1 次元拡散スライディング ウィンドウとプロセスをホッピング) DNA1に沿って。遺伝子調節、核酸代謝、および他のプロセスに関与する多くのタンパク質が DNA2,3,4,5,6,7 スライドを今知られています。 ,8,9。さらに、最近の研究報告も、小さなペプチドにバインドし、貨物を運ぶ能力を持つ dna、スライド、たとえば、蛋白質分子または PCR のプライマー、DNA10、11,12,13,14に沿って。
最後の 15 年間、単一分子流ストレッチ アッセイをバインディングと DNA2,,1516に沿って分子の拡散に広く使用されています。このタイプのアッセイでは、ビオチン化二本鎖 DNA 分子が表面に固定化し、層流を適用して流ストレッチ DNA。&#62; 80% はタイムラプス蛍光イメージングによる単一 DNA 分子の軌道を追跡する、分子 fluorophores が付いている分類のバインディングと輸送活性を研究するための空間拡張テンプレートとして DNAs サーブを伸縮します。再現性と使いやすさのために最適化された、我々 の実装でこの試金から成っている 5 つの手順: データ解析、蛍光イメージング フロー セル建設 coverslip 機能化ビオチン λ DNA の準備。最初反応 (3-アミノプロピル) とプタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン (APTES) し、試薬を用いるアミン反応性ポリエチレング リコール (PEG) (例えば、NHS-ペグ-ビオチン) 抵抗ペグ層を形成する以前のプロトコル17、ガラス coverslips された官能基化coverslip 表面分析コンポーネントの無指定の吸着。官能 coverslips の品質は主ペグ試薬および各ステップで反応条件の品質に依存していた。我々 のプロトコルでは、簡略化された機能化プロトコルない液体接着剤や養生時間が日流セルを組み立てを必要とする多重フロー セル構造をについて説明します。重心ローカリゼーション18と共分散に基づく拡散放射対称法を適用することで計算量の多い回帰手順を排除する合理的で堅牢なデータ解析の手順11についても述べる定数推定19。
ここでは、シンプルで堅牢な報告し、ハイスループット分子流ストレッチ アッセイ実装で coverslip の機能化、フロー電池を構築、データ分析の重要な改善。特に、我々 はきれいな乾いた coverslips がシラン-ペグ-ビオチンと直接反応するワンステップ coverslip の機能化プロトコルを開発しました。このプロトコルは、coverslip の準備を簡素化し、標準の 2 段階反応プロトコルと比較して機能性表面の品質の信頼性を向上させます。接着剤なしに堅牢なチューブ接続を有効にするマルチ チャネル PDMS 流セルを持つので、官能基化 coverslips の使用について述べる。さらにこれらのフローの細胞、複数コンピューター制御の入り江各流れ区域セットアップおよび増加の測定スループット ハンズオン時間を削減する自動試薬の流れを可能にするがあります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="906">
	<tbody>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:249px;">Biotin labeled oligo, 5&#8217;-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3&#8217;</td>
			<td style="width:249px;">IDT</td>
			<td style="width:159px;">Custom oligo synthesis</td>
			<td style="width:249px;">Standard desalting purification is sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">&#955;-DNA</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">N3011S</td>
			<td style="width:249px;">Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">T4 DNA ligase and ligation reaction buffer</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">M0202S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton</td>
			<td style="width:249px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:159px;">UFC510008</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 1 glass coverslips</td>
			<td style="width:249px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">48393-106</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Pure ethanol</td>
			<td style="width:249px;">VWR</td>
			<td style="width:159px;">89125-186</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Potassium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:249px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">P250-500</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Plasma cleaner, model No. PDC-32G</td>
			<td style="width:249px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:249px;">Silane-peg-biotin</td>
			<td style="width:249px;">Nanocs</td>
			<td style="width:159px;">PG2-BNSL-5k</td>
			<td style="width:249px;">Store at -20oC in dry nitrogen gas</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">A CAD software</td>
			<td style="width:249px;">Autodesk</td>
			<td style="width:159px;">AutoCAD</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Double-adhesive tape</td>
			<td style="width:249px;">Adhesive Applications</td>
			<td style="width:159px;">8512-2-DP/DL</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP</td>
			<td style="width:249px;">Graphtec America</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PDMS and crosslink reagent kit</td>
			<td style="width:249px;">R.S. Hughes</td>
			<td style="width:159px;">RTV615 CLEAR 010</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">Degassing chamber, model No. F42010-0000</td>
			<td style="width:249px;">BEL-ART Products</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Mixer, model No. ARV-310</td>
			<td style="width:249px;">Thinky</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:249px;">Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm</td>
			<td style="width:249px;">Harris Uni-Cores</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;">This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tygon tubing</td>
			<td style="width:249px;">Cole Parmer</td>
			<td style="width:159px;">EW-06420-02</td>
			<td style="width:249px;">0.020&#34; ID, 0.060&#34;OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Peek tubing</td>
			<td style="width:249px;">Western Analytical</td>
			<td style="width:159px;">PK007-031-Y</td>
			<td style="width:249px;">0.007&#34; ID, 0.031&#34;OD</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">N7021S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:249px;">New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:159px;">B9000S</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Sytox orange nucleic acid stain</td>
			<td style="width:249px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:159px;">S11368</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Ti-E Microscope</td>
			<td style="width:249px;">Nikon</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td rowspan="5" style="width:249px;">Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td>
			<td style="width:249px;">Nikon</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">CMOS camera</td>
			<td style="width:249px;">Hammamatsu</td>
			<td style="width:159px;">Orca Flash 4.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Dichroic mirror</td>
			<td style="width:249px;">Semrock</td>
			<td style="width:159px;">FF560/659-Di01-25x36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:249px;">Semrock</td>
			<td style="width:159px;">FF560/659-Di01-25x36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">532 nm laser</td>
			<td style="width:249px;">Rayscience Innovation Limited, Shanghai</td>
			<td style="width:159px;">OEMLL-FN-532nm-C</td>
			<td style="width:249px;">Select wavelength to correspond to stain of choice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:249px;">Chemxy</td>
			<td style="width:159px;">Fusion 200</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">TMR-KRRR, &#62;=85% purity</td>
			<td style="width:249px;">MIT Biopolymer lab</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:249px;">pVIc-Cy3B, HPLC purified</td>
			<td style="width:249px;">A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Script programming software</td>
			<td style="width:249px;">MathWorks</td>
			<td style="width:159px;">Matlab</td>
			<td style="width:249px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:249px;">* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna

DNA 分子の 1 次元拡散を勉強するためシンプルで堅牢かつ高スループット分子流ストレッチ試金を記述します。このアッセイでガラス coverslips はシラン-ペグ-ビオチンとワンステップ反応の機能化します。フローセルを構築するには、官能 coverslip と入口と出口の穴を含む PDMS スラブ間カット済みチャネルに粘着テープを挟みます。フローは 1 つのセルに複数のチャネルを統合し、各チャネル毎に試薬の流れ完全に自動化できる、大幅測定スループットが向上し、アッセイあたりの実践時間を短縮します。各チャンネル内部表面に固定されているビオチン λ Dna と層流、流ストレッチ Dna に適用されます。DNA 分子に引き伸ばされます &#62; 80% 輪郭線長のサーブとして空間的拡張蛍光に分類された分子の結合と輸送活性を研究するためのテンプレート。単一分子の軌道を追跡時間経過の全内部反射蛍光 (TIRF) イメージングによる。Raw 画像は、合理化されたカスタム単一粒子追跡ソフトウェアを使用して自動的に DNA に沿って拡散する分子の軌道を識別し、1 次元拡散定数を推定する分析されます。

図 2 aは、pVIc Cy3B の検出された軌跡を示しています (pVIc: GVQSLKRRRCF;Cy3B はシステイン残基に共役) 2 mM の NaCl の DNA を拡散分子バッファー ph 6.5。PVIc の拡散は双方向、周囲の熱エネルギーで駆動です。これらの軌跡から 1 次元拡散定数 (D1 の値) が各軌道の推定される (図 2 bにヒストグラムを参照してください)。この pVIc 共役の D1 の値の平均は軌道各軌道に含まれるトリプレット連続位置呼び出しの数によって加重する 22.2 ± 0.9 (標準誤差) M (bp2/s) 各 D1 の値を平均することによって計算されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg"> 
図 1: DNA の方向の単一の分子の動きを追跡するための装置。 ) 8 ch PDMS マイクロ流体チップ付着する DNA は、(スケールのアメリカ クォーター コイン) とつながれることができます; 官能 coverslipb) 流れ流れ伸ばして λ DNA の分子の細胞ズーム図c) DNA を伸ばすため全反射顕微鏡とフロー システムの概略図d) 全反射像流れ伸ばして λ-DNA;e) 全反射像 pVIc Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF;Cy3B はシステイン残基に共役) 分子は流れ伸ばして λ DNA にバインドします。この図は、アクセス許可2,12と変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg"> 
図 2: PVIc (GVQSLKRRRCF) DNA の方向の一次元拡散します。 ). 流れに沿って pVIc の拡散が 2 mM NaCl バッファー ph 6.5 の λ Dna (137 軌道) を伸ばして。x(t) と y(t) に沿ってと λ DNA に横方向の変位は、それぞれ。水平の点線は、染料の点滅から生じる不足しているポイントを示します。b). 拡散係数のヒストグラム、pVIc λ Dna に沿って拡散の D1。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

このプロトコルは、DNA 分子の一次元 (1 D) 拡散を勉強するためシンプルで堅牢かつ高スループット分子流ストレッチ試金を示しています。

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

a-simple-robust-high-throughput-single-molecule-flow-stretching-assay

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.0K ビュー.  Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School. このプロトコルは、DNA 分子の一次元 (1 D) 拡散を勉強するためシンプルで堅牢かつ高スループット分子流ストレッチ試金を示しています。

ビデオ: A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

生化学

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 のタンパク質分解を評価する高スループット ルシフェラーゼ アッセイ

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

低分子とdNTPase SAMHD1の相互作用を調べるためのハイスループット酵素共役活性アッセイ

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

要約

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HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

カエノラブディティス・エレガンスにおけるハイスループット化合物スクリーニングのための簡単な方法

シングル売り上げ高プロテアーゼ PCSK9 のタンパク質分解を評価する高スループットルシフェラーゼアッセイ

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

低分子とdNTPase SAMHD1の相互作用を調べるためのハイスループット酵素共役活性アッセイ

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

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生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

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ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

低分子阻害剤スクリーニングのためのNADH結合ATPaseアッセイの半高スループット適応

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

低分子とdNTPase SAMHD1の相互作用を調べるためのハイスループット酵素共役活性アッセイ

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