すべての生物はプロテオームに障害があり、最大33%と推定され、これらの領域は水素/重水素交換質量分析によって観察可能ですが、ミリ秒の時間範囲でのみ観察できます。私たちのプロトコルは、これを正常に行う方法を紹介します。これは完全に自動化された分析技術です。
あなたはすべてを設定し、希望の時間測定をプログラムし、ゴーとウォークアウトを打つだけです。この技術は、α-シヌクレインなどの本質的に無秩序なタンパク質の特異的な確認を安定化させる化合物をスクリーニングするエキサイティングな機会を開く。ペプチドマッピングのためのサンプル調製を開始するには、まず、マイナス80°Cの冷凍庫から保存されたα-シヌクレインタンパク質ストックのバイアルを取ります。
そして解凍したら、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してろ過します。次に、溶液の吸光度を218ナノメートルで測定し、Beer-Lambertの法則を用いてタンパク質濃度を決定し、平衡緩衝液でタンパク質を最終濃度5マイクロモルに希釈する。次に、オートサンプラーロボットをセットアップするには、5マイクロモルのタンパク質溶液を50マイクロリットルの合計回収バイアルに追加し、質量分析計に沿って水素/重水素交換(HDX)ロボットの右側のチャンバーのサンプル位置にバイアルを置きます。
次に、左チャンバーの試薬位置1、4、5に平衡バッファーのバイアル1本とペプシン洗浄バッファーのバイアル2本を入れ、HDX右チャンバーの試薬位置1にクエンチバッファーのバイアル1本を入れ、ペルチェ温度コントローラーを使用して温度を摂氏20度に設定した。次いで、HDX左チャンバーおよびHDX右チャンバーの同じ反応位置にそれぞれ等しい数の総回収バイアルおよび最大回収バイアルを追加する。次に、スケジューリングソフトウェアで適切なLCおよびMSメソッドでサンプルリストを設定し、スケジュールを開始します。
最終的なペプチドカバレッジマップを取得するには、DynamX HDXデータ分析ソフトウェアで同位体割り当てを手動でキュレーションします。Fast HDXプロトタイプ計測器をクリーニングした後、互換性のあるHDXソフトウェアのグラフィカルユーザーインターフェイスを開き、システムを初期化します。サンプルチャンバーとクエンチチャンバーの温度としてそれぞれ20°Cと0.5°Cを入力し、次に「設定」をクリックして新しい温度を適用します。
装置を洗浄して準備するには、すべての入口にLC / MSグレードの水を入れた遠心分離管をセットアップし、滴定器配管供給タブで左右のシリンジの両方を確認し、チューブ内のすべての潜在気泡がなくなるまでプライムをクリックし続けます。シリンジのすべてのボックスをチェックするには、まずマクロタブに移動し、キャリブレーションシリンジホームポジションをクリックし、次に最初にシリンジロードループの洗浄をクリックし、続いてすべての混合ループボリュームを洗浄します。バッファーシリンジに気泡がある場合は、シリンジを取り外し、垂直に気泡を噴出させて脱気します。
ゼロ位置に再較正する前に、シリンジを交換してください。HDX実験用のFast HDXプロトタイプ機器をセットアップするには、まず左の滴定入口チューブをトータルリカバリバイアルに挿入します。温度によるオリゴマー化と凝集を防ぐために、チューブを卓上冷蔵庫に入れます。
次に、50ミリリットルの平衡、標識、急冷、およびペプシン洗浄バッファーを、装置の左右チャンバー内のそれぞれのバッファー入口に加え、続いて、50ミリリットルのカラム洗浄バッファーをペプシン洗浄入口に加えます。タンパク質とカラム洗浄ラインをプライミングするには、滴定器配管デリバリータブで左右のシリンジを確認し、プライムを1回クリックします。前述のようにシリンジのすべてのボックスをチェックしたら、手動急冷フロータブに移動して必要な設定を入力します。
タイムコースの実験では、記号ドットボタンを使用してミリ秒単位で時間を入力します。次に、トラップ時間を 3 に設定し、HPLC がトラップ時間プラス実行時間 + 1.5 分になるまで待機します。サンプル実行の間に空白の実験を実行する場合は、各サンプル実行後に取得ソフトウェアに空白の実行のエントリを確認してから、[実行]空白ボックスをクリックします。
サンプルリストの準備が整い、適切なエントリが強調表示されたら、ソフトウェアで[再生と高速HDX]をクリックして実行を開始します。データ処理の場合は、ペプチドマッピング実験からスペクトル的に割り当てられたペプチドのファイルのファイルメニューを開き、DynamXソフトウェアで開くをクリックしてから、生ファイルをDynamXソフトウェアにインポートします。データメニューを開いたら、[MSファイル]をクリックします。
研究中の各タンパク質状態の状態を作成するには、新しい状態をクリックします。各HDXタイムポイントを追加するには、新しい露出をクリックしてから、[新しい生]をクリックします。raw ファイルをインポートするには、各ファイルを正しい位置にドラッグし、完了したら「OK」をクリックします。
同位体を自動的に割り当てた後、高いデータ品質を確保するために、同位体割り当てを手動でキュレーションします。クラスタデータをcsvファイルにエクスポートし、原稿に記載されているように列順に記述します。質量測定ソフトウェアでデータメニューを開き、クラスタデータのエクスポートをクリックします。
データ分析の場合は、まずエクスポートしたクラスター化データをHDX分析ソフトウェアHDfleXにロードします。すべての実験と状態の実験データを適合させるには、適切な逆交換補正方法を選択して、HDX反応の観測された速度定数を取得します。次に、HDfleX の推奨方法を使用してグローバル有意性しきい値を計算し、ハイブリッド有意性検定を実行して、比較された状態間の有意差を決定します。
α-シヌクレインのマッピング実験では、タンパク質配列の100%を平均冗長性3.79でカバーするペプチドカバレッジマップが生成されました。さらに、このプロトコルは、α-シヌクレインの異なるペプチドの重水素取り込み曲線の生成を可能にし、それを適合および逆交換補正グラフとして表現した。α-シヌクレインにおけるほとんどの水素/重水素交換が1秒で行われたことは明らかであった。
α-シヌクレインの状態Aと状態Bの間の立体構造の違いは、ペプチドおよびアミノ酸レベルの両方で状態Bによるより高い重水素取り込みからも明らかであった。このような高感度の手法では、データを比較するときに堅牢な統計的有意性検定を使用することが重要です。ここでは、ソフトウェアHDfleXを使用しました。
