The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. DNA-タンパク質架橋<ol><li> ES細胞と胚の心臓組織から発生した15ミリリットルチューブに修正収穫-ES細胞（レギュラーチップ用の2×10 6細胞、マイクロチップのための2×10 5細胞）、胚様体（EB）はE9.5のマウス胚から切開（房室細胞または胚組織のために透過処理PB2バッファにPBS中の1％ホルムアルデヒドを用いて運河、流出路及び心室）。正確に10分間、室温で60回転の速度でオービタルシェーカー上でチューブを入れます。 </li><li> 125 mMの最終濃度のグリシンを添加することによって架橋反応を停止させ、60回転の速度でオービタルシェーカー上で室温で5分間インキュベートします。 </li></ol> 2.細胞溶解とクロマチン断片化<ol><li> 10mlのPBS 1Xまたは1ミリリットルPB2に再懸濁胚組織に再懸濁回架橋された細胞を洗浄します。 4℃で5分間1,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。&lt;/李&gt; <li> PB1またはPB2（2 / mlのロイペプチン、1 / mlのアプロチニン、および0.1mM PMSF）（ 表1）をバッファリングするためにプロテアーゼ阻害剤を追加します。それぞれバッファPB1またはPB2の1ミリリットルのステップ2.1から細胞ペレットまたは胚組織を再懸濁します。ピペットで上下および細胞または組織を再懸濁します。細胞または組織を均質化するために21ゲージ針で1ミリリットル注射器を使用してください。 10分間4℃（ホイール上）でインキュベートします。 </li><li> 4℃で5分間、3000×gでスピンダウンし、上清を捨てます。 </li><li>きれいなチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充したそれぞれのSBバッファ（ 表1）300μlの中にペレットを再懸濁（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）は、任意のDNA分解を防ぐために。氷上で15〜30分間インキュベートします。 </li><li>各材料について、表2に記載されたプログラムに従って超音波処理器を用いてクロマチンを剪断するために4℃で試料を超音波処理します。 &lt;（次の用途に応じて超音波処理時間を調整しますem&gt;のすなわち、PCRまたは配列決定）。剪断されたDNAの大きさは、PCRおよび配列決定のための300bpのための約500塩基対でなければなりません。 </li><li>遠心分離機は、新しい1.5 mlチューブに上清（クロマチン）を転送し、ペレットを廃棄し、4℃、6,000×gで10分間、細胞溶解物を超音波処理しました。 </li><li>水で10倍のため、溶液中のクロマチン（上清緩衝液B）を希釈し、ナノ分光光度計で1.5μLを使用して光学密度を評価します。 0.76のx OD 260から1.55のx OD 280：次の式を使用して、μgの/μlの中のタンパク質の濃度を得ます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> 利用 </td><td colspan="4"> 組成 </td><td> 材料 </td></tr><tr><td rowspan="2"> A </td><td rowspan="2">透過化</td><td colspan="4"> PB1：5 mMのパイプpHが8; 85メートルMのKCl; 0.5％NP40 </td><td>すべて</td></tr><tr><td colspan="4"> PB2：15mMのHEPES pH7.6の、15mMの塩化ナトリウム、4のMgCl 2 60mMの塩化カリウム、0.5％TRITON X-100 </td><td>胚組織</td></tr><tr><td rowspan="3"> B </td><td rowspan="3">溶解/超音波処理</td><td colspan="4"> SB1：1％SDS。 10mMのEDTA; 50mMトリス - 塩酸pHが8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2：50mMのHEPES-KOH pH7.9; 140 mMの。 1mMのEDTA; 0.1％デオキシコール酸塩、 0.1％SDS </td><td> EB </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3：15mMのHEPES pH7.6、15mMのNaClを。 60のKCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA; 1％TRITON-X100、0.1％SDS、0.5％ラウリルサルコシン</td><td>胚組織</td></tr><tr><td> C言語</td><td>チップバッファ</td><td colspan="4"> 150mMのNaCl; 50mMのトリス塩酸pH7.5で、 5 mMのEDTA; 0.5％NP40。 1％TRITON-X100。 </td><td>すべて</td></tr><tr><td> D </td><td> DNA /タンパク質の溶出</td><td colspan="4"> D1：1％SDS。 100mMの炭酸水素ナトリウム D2：50 mMトリスpHが7.6 / 5 mMのEDTA、15mMのDTT、2％SDS </td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> DNA結合ビーズの準備</td><td colspan="4"> E：20％PEG 8000; 2.5 MのNaCl; 10mMトリス - 塩酸pHが8と1mMのEDTA </td><td></td></tr></tbody></table> 表1のChIPバッファー 。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 材料 </td><td> 超音波処理プログラム </td></tr><tr><td>胚性幹細胞</td><td> ON 30秒と30秒OFFの15サイクル</td></tr><tr><td>胚様体</td><td> ON 30秒と30秒OFFの30サイクル</td></tr><tr><td>胚組織</td><td> ON 30秒と30秒OFFの21サイクル</td></tr></tbody></table> 表2.超音波処理プログラム。 3.免疫沈降および洗い上げ<ol><li>バッファーCで3回のプロテインA結合ビーズを洗ってください。新しい1.5 mlチューブにビーズを100μlを取り、緩衝液C（ 表1）の1ミリリットルを追加します。次に、チューブを磁石上に転写されます。 1分間待ち、上清を吸引除去します。二回洗浄工程を繰り返します。 </li><li>バッファCの20洗浄蛋白μlの結合ビーズを1 mlの修飾ヒストンまたは転写因子に対する抗体（ 表3に示す濃度）インキュベート新しい1.5 mlのチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充しました。 4℃で少なくとも2時間、40 rpmで回転体のサンプルを設定します。 </li><li>洗浄抗体ビーズを、緩衝液Cを1ml（3.1に記載の操作）で3回錯体。 </li><li> 2チューブ、クロマチンと抗体 - ビーズ複合体およびクロマチン150μgのを含む他のチューブと洗浄したビーズを20μlの150μgのを含む1を準備し;各チューブにプロテアーゼ阻害剤を補充した緩衝液Cを1ml加えますそして4℃で一晩40 rpmで回転ホイール上でサンプルをインキュベートします。 注：クロマチンの濃度は、転写因子またはシーケンシャルチップ用を免疫沈降するために、少なくとも300μgのでなければなりません。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 標準 </td><td> 濃度（ngの/μL） </td><td> 容量（μL） </td><td> 全DNA濃度（NG） </td></tr><tr><td> A </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> C言語</td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> D </td><td> 1.25 </td><td> 1 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0.625 </td><td> 1 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0.3125 </td><td> 1 </td><td> 00.3125 </td></tr><tr><td> G </td><td> 0.156 </td><td> 1 </td><td> 0.156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> 表3基準濃度。 4. DNA溶出、クロスリンクの逆転とプロテイナーゼK消化<ol><li>磁気ラック内のサンプルを設定します。非結合抗体のクロマチンを含む上清を回収。 注：サンプルは、すぐにその段階で、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存することができます。クロマチンは、他の抗体と他の免疫沈降アッセイに使用することができます。バッファCの1ミリリットル（前述の操作）で各サンプルを3回洗浄。 </li><li>シーケンシャルチップが洗浄のChIP材料を（ 表1）を行わなければならない場合、バッファD1またはD2の150μLを添加することによって、抗体結合タンパク質を溶出し、加熱ブロック中で50℃で20分間、サンプルをインキュベートします。 </li><li>からチューブを外します加熱ブロックとは、磁気ラックにサンプルを入れて、（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）新しい1.5 mlチューブに上清を回収し、ビーズを捨てます。 </li><li>バッファCの2倍量の第二の抗体の3μgのに1を加え、順次チップ用の上清を使用するか、または200 mMのの最終濃度を得るために、5 MのNaClを添加することにより架橋逆転。 </li><li>新しい1.5 mlチューブにクロマチンの入力サンプルを準備する（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）水を150μlの最終容量でIPサンプル（150μgの）のようなクロマチンの同じ量を取ります（RNアーゼDNアーゼを含まない水）。 200 mMの最終濃度が5MのNaClを追加します。 65℃で一晩サンプルをインキュベートします。 </li><li>翌日、加熱ブロックからサンプルを除去するのChIP材料中に250μg/ mlの最終濃度を得て、2時間55℃で消化し12.5ミリモルおよびプロテイナーゼKの最終濃度を得るために、250 mMのEDTAを加えます加熱ブロック。 </li></ol><ol><li>ビーズの作製<ol><li>少なくとも30分間室温でビーズを持って開始し、非常に徹底的にビーズをボルテックス。ビーズは落ち着くので、ピペッティング時に高速に動作します。転送（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）きれいな1.5ミリリットルチューブ中のビーズの1ミリリットル。 </li><li> 、明確上清を廃棄するソリューションの3分 - 磁石に設定し、2を待ちます。 、磁石から削除0.5 M EDTAの1ミリリットルを追加し、短時間のボルテックスで混和します。 </li><li>二回ステップ5.1.2を繰り返し、最後に上清を捨てます。 </li><li> 、磁石から削除バッファEの1ミリリットルを追加し、ゆっくりとビーズを再懸濁します。シェーカー上にバッファE.プレイス50mlに全体のミックス（緩衝液E中のビーズ）を転送し、それを1時間室温でゆっくりと混ぜてみましょう。 </li><li> 3実験条件を用いて説明精製プロトコールを以下の試験DNA結合ビーズ：ビーズを50μl/ DNAを50μl（1ボリューム/ 1容量）、ビーズを100μl/ DNA50μlの（2ボリューム/ 1容量）とビーズの125μlのDNA /50μlの（2.5容量/ 1容量）。フラグメント（ 図1A）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で精製されたDNAを移行しましょう。 </li></ol></li><li> DNA精製<ol><li>各DNAサンプル（約170μl）をした磁気ビーズを結合するDNAの425μL（2.5容量）を追加します。ダウン（約10倍）、ピペッティングによりゆっくりと再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。 </li><li>その後、上清を吸引し、（磁石に）捨て、5分間磁石上に置きます。 </li><li> 、1分間待機し、磁石上にチューブに新たに作製した80％エタノール600μlを添加し上清を吸引して廃棄した後、もう一度、前の手順を繰り返します。 </li><li> 5秒（マイクロフュージ）のために、迅速なスピンを与える、磁石上にチューブを置き、エタノールの最後の滴を除去します。室温で1分間乾燥させ</li><li> DNアーゼRNaseを含まない水20μlを加えることによって、DNAを溶出します。磁石から取り外し、サンプルをボルテックス。 </li><li>室温で3分間インキュベートし、その後、磁石上にサンプルを置きます。新しいチューブに吸引し溶出したDNAは（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定します）。 </li><li> DNAフラグメント（ 図1B）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で入力画分からDNAを実行します。 </li></ol></li></ol> 6. DNA定量は、蛍光検出機器の使用します<ol><li>シリアル7希釈液を加えた無DNA点（ 表3に集まった希釈液）の合計を与えるために水に1μgのDNA（1キロバイトラダー）で希釈します。 </li><li> PCRグリーンI色素の溶液を準備し、すべてのサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）のための十分な：1×TE緩衝液中グリーン色素を10,000倍希釈します。 </li><li>毛細血管のキュベット中で10μlの1×緑の色素ミックスに各DNAサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）の1μLを加えるには、488 nmの波長での蛍光光度計で読み取ることができます。無DNAアッセイのために、1×TE緩衝液1μLを使用しています。 </li><li>ビルドグラフィックソフトを使用して検量線とNG /μlの中のDNAサンプルの範囲に相対濃度を決定します。次いで、DNAをPCRのために準備ができているか、シーケンシングライブラリを作成します。 </li></ol> 7. PCR <ol><li>プライマーの選択<ol><li>関心の設計プライマーは、関心のあるゲノム領域を調べることができます。設計プライマーは、UCSCゲノムブラウザを使用して遺伝子のエンハンサー領域を増幅します。エンハンサーはさらにGEOデータセット内の9データ利用可能H3K4me1またはP300のChIP-seqのを用いて予測しています。 </li></ol></li><li> PCR <ol><li> 45サイクル（8秒95℃、8秒、60℃、8秒72°C）25μlの緑の色素ミックス、2 ngのDNAを、および0.5μlのプライマーミックスでリアルタイムPCRサーマルサイクラーを使用するためのファイル名を指定して実行のPCR反応（20 μMストック溶液）10。 </li></ol></li><li>濃縮の分析<ol><li>ヌクレオソームのせいぜい1％が11を免疫沈降したと仮定して絶対濃縮を計算します。 </li><li> ConsideRゲノム投入DNAの0.1 ngのと比較すると10 ngののIPサンプルが大きい濃縮を示す場合に富むように。 </li><li>非特異的対照試料と入力し、調整の正規化後の非濃縮領域にわたって濃縮度の増加倍数として結果を表現します。 </li><li>入力DNAは100（希釈係数またはDF）によって希釈されるように考えてみましょう。 </li><li> Ct [DF X入力] - X 100％以下の式2-ΔCt、-ΔCt= Ctを[IP]を使用して入力を正規化します。 </li><li> NSは、非特定のサンプル（抗体なしIP、またはIgG IP）であるとして、次の式（ΔCtを[IP]-ΔCt[NS]）を使用してコントロールを調整します。 </li><li> 2-ΔΔCTとしてサンプルの倍の濃縮を計算します。唯一各PCRサンプルは、結果の分析を容易に入力することができる式で計算のすべてのステップを含むファイル。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li><li>Chen, T., Dent, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifiers+and+remodellers:+regulators+of+cellular+differentiation.">Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation.</a> Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).</li><li>Collas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+state+of+chromatin+immunoprecipitation.">The current state of chromatin immunoprecipitation.</a> Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development.">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44, 148-156 (2012).</li><li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters.">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162, 948-959 (2015).</li><li>Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. 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J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 315-326 (2006).</li><li>Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+coordinated+epigenetic+regulation+of+developmental+transitions+in+the+cardiac+lineage.">Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage.</a> Cell. 151, 206-220 (2012).</li><li>Stergachis, A. 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The authors have nothing to disclose.

エピジェネティクスは、発生生物学の研究の重要な分野となっています。遺伝的プログラムは、胚系統内の特定のIDを取得するに細胞を可能にするために胚細胞で活性化されているどのくらいの時間のために、発生生物学者にとって重要な問題となっています。 チップは広く最後の年以内に使用し、シークエンシングの解像性の向上、次のDNA配列決定に組み合わされてい...

<html>心臓は最初の器官が形成されると、胚における機能的になることです。心臓は、第1および第2の胚性心臓フィールド1から発生する多くの細胞系譜から構築されています。受精後の胚盤胞は、成形心まで段階から、胚細胞は、多くの細胞の運命決定を行うためにこのようにしてあります。遺伝子の転写は、時間と空間依存的に調節され、胚発生の間の細胞運命の決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。このような方法は、心臓構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノム内の調節領域に結合する特異的転写因子によって媒介されます。 DNAは、例えば、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、および/またはリン酸化などの修飾に供されたヒストンの周りに巻かれています。ヒストン修飾は、ヒストンのリジン残基が2に変更されているに応じて活性化し、抑圧や構え遺伝子転写につながります。 jove_content &quot;&gt;クロマチン免疫沈降アッセイ（チップ）年前に3を設定し、4。ヒストンや転写因子の免疫沈降後に変更されたヒストンや転写因子のいずれかの標的を同定するために、現在最も広く使用されている技術であるされてきた、結合したDNAをすることができますいずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅または配列決定した。チップは、技術的挑戦ゲル遅延アッセイ5を克服している。しかし、チップはDNA、ゲル遅延アッセイの利点の転写因子の結合を直接意味するものではない。一方、チップ上DNAシークエンシングに合わせた遺伝子調節に関する新たなゲノムワイドな視点をオープンしました。 ES細胞（ES細胞）を6胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養において心臓の開発の初期段階を再現し、チップのための原則に十分な材料に提供します。また、ヒトES細胞は、CAのヒト細胞モデルを表しますその心原性の潜在的なもののrdiogenesisはそのエピジェネティックな署名7に依存します。開発の後期段階では、マウス胚組織は、セル識別の決意に必要な特定のエピジェネティックな景観を調査することを可能にします。しかし、ゲノムは時間と細胞型に特異的な様式8に転写されます。遺伝子転写のエピジェネティック制御は、局所領域内で検討されなければなりません。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚領域を使用して、PCRまたは配列決定に続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Formaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F8775</td>
			<td style="width:167px;">Cell Fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td>Cross-link stop</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aprotinin</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>10820</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leupeptin hemisulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2882</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Proteases inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Protein A magnetic beads&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10001D</td>
			<td>Immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">SPRI magnetic beads</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15002-01</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proteinase K</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>Protein digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNA BR standard&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>Calibration range&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Syber green</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S-11484</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">TE buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7589</td>
			<td>DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PBX 1X</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Washing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">DNase RNase free water</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10977-035</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Axygen tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-175-C</td>
			<td>ChIP purifiction</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Antibody&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Reference</td>
			<td style="width:167px;">ChIP concentration</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27ac</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4729</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me1</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410194 (pAb-194-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K36me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410058 (pAb-058-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K9me2</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410060 (pAb-060-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K4me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410030 (pAb-030-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">H3K27me3</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410069 (pAb-069-050)</td>
			<td style="width:167px;">3 &#181;g for ESC and EBs, 1 &#181;g for tissues</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues

特定の遺伝子の転写は、胚発生の間の細胞運命決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。生物学的プロセスは、心臓、構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノムの調節領域に結合する転写因子によって媒介されます。 DNAは、化学修飾に供されるヒストンの周りに巻かれています。ヒストンの修飾は、さらにこのように、遺伝子転写の微調整調節の別のレベルをもたらし、抑圧、アクティブまたは構え遺伝子転写につながります。胚性幹細胞（ES細胞）は、心臓発生の初期段階の胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養で再現します。それらは、クロマチン免疫沈降（チップ）のための原則に十分な材料、広く遺伝子調節領域を同定するために使用される技術の提供します。また、ヒトES細胞は、心臓のヒト細胞モデルを表します。開発の後期段階では、マウス胚組織はを可能にセルIDを決意するために必要な具体的なエピジェネティックな風景を調べます。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚性領域を用いたPCRまたはチップ・シーケンシングに続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。

図1Aは、まず、異なるサイズ（1kbのラダー）のDNAを用いたDNA結合ビーズおよび品質管理の調製を示します。 0ne、ビーズの2および2.5体積（1〜3）は、高および低分子サイズのDNA断片を精製する試料の量に添加しました。 図1 B、C、Dは、マウスES細胞、胚様体または心臓胚領域から抽出された全超音?...

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Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K ビュー.  Université Aix-Marseille. 遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。 

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

発生生物学

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Conventional methods to initiate suspension aggregate based cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) are plagued with culture heterogeneity with respect to aggregate size and shape. Here, we describe a robust method for cardiac differentiation employing microwells to generate size-controlled hPSC aggregates cultured under cardiac-promoting conditions.

ヒト多能性幹細胞の懸濁液ベースの心臓分化のためのマイクロウェル中の凝集体サイズの最適化

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

導出とイヌの卵巣間葉系幹細胞の分化

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...