SEJにNIH助成R01HL105635でサポートされています。著者は、技術的な助言のためにディエゴ・V.Bohórquezに感謝したいと思います。我々はまた、技術支援、デュークヒトワクチン研究所研究フローサイトメトリー共有リソース機能（ダーラム、ノースカロライナ州）でのフローサイトメトリーを実行するためのR.イアンカミングに感謝します。フローサイトメトリー国立衛生研究所、アレルギーの国立研究所感染症（UC6-AI058607）から建設のための部分的なサポートを受けデューク大学の地域の生物学的封じ込め実験室で行いました。

動物を対象とする手順は、デューク大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 ファーストブルーの1鼻腔内投与ファーストブルーの場合、少なくとも2日間、マウスを安楽死前に染料を管理します。染料は、最大8週間持続します。 <ol><li>呼吸が遅くし始めるまで光吸入麻酔（2.5％セボフルラン）でマウスを麻酔。 </li><li>マウスを確保するために時折一時停止、ゆっくり鼻孔に染料溶液40μl（0.4mMのファーストブルー、1％ジメチルスルホキシド、DMSO、リン酸緩衝生理食塩水、PBS）を植え付ける濾過ヒントを200μlのピペットを使用して溶液を吸引され（ 図1A）。 </li><li> 、垂直方向にマウスを押したままヘッドアップ、そして優しく色素が肺全体に広がる確保するために胸をマッサージします。 </li></ol>解剖と分析日に2.準備<ol><li> 10ミリリットルを準備0; 表1に指定されている成分を組み合わせることによって神経節解離ソリューション（GADS）。 </li><li>専用ラボエリア内のRNAの抽出を行います。実験を開始する前に、70％エタノール、10％の漂白剤、およびRNaseの汚染除去試薬と清浄な表面。これは、RNA遠心分離機、任意のチューブラック、およびピペットを含んでいます。専用のフィルターチップボックスはRNAのみでの使用のためにそこにあることを確認してください。これはサンプルを汚染するとして、DNA調製のために、この機器やエリアを使用しないでください。 </li><li> RNaseフリー水を用いて新鮮な70％、および80％エタノールを混合します。 RNAの抽出に使用されるサンプルごとに1 mlで調製します。 </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 量 </td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 </td><td> 9.5ミリリットル</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td> 100μlの</td></tr><tr><td> HEPES（10mMの） </td><td> 100μlの</td></tr><tr><td> N2サプリメント</td><td> 100μlの</td></tr><tr><td> B27（なしビタミンA） </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> NGF（50μg/ mlの） </td><td> 10μlの</td></tr></tbody></table> 神経節解離ソリューション（GADS） 表 1. 試薬混合物。 3.解剖手順<ol><li> 500μlのGADS、各実験試料について1、ポジティブソート制御のための1、および負の仕分け制御のための1つの1.5 mlチューブを埋めます。解剖を通してチューブを氷上に保管してください。 </li><li>節状神経節を解剖し、解離を促進するために、二つの部分のカットを行い、その後、実験試料管に入れて。節状神経節16とDRG 17の解剖については、次のJoveのプロトコルを参照してください。 </li><li>ソートのコントロールのために、このような後根神経節（DRG）などの神経節を、解剖し、部分的に非標識カット。ポジティブコントロールと2 gangliための2つの神経節を使用しますネガティブコントロールのために。 </li><li>成功した並べ替えのための十分な結節ニューロンを得るためには、GADSを含む1つの実験サンプル管に5匹のマウスからの神経節を兼ね備えています。 </li></ol> 4.知覚神経節解離<ol><li>チューブ内の神経節を残して、500μlのGADSをピペット。一度1mlのPBSを添加することにより洗浄神経節は、その後、PBSをピペット、チューブの底に沈殿する神経節を待ちます。 </li><li> 1ミリリットルGADSと消化酵素の22μlの（コラゲナーゼI / IIおよびプロテアーゼ混合物は、2.5 mg / mlで中のH 2 O）を各チューブを追加します。 </li><li>陽性対照チューブに20μlのファーストブルー（5.26ミリモル）を追加します。 </li><li>既に37℃に設定した水浴または加熱ブロックにチューブを入れてください。 注：神経節消化の時間は、消化酵素の年齢に依存します。消化酵素を溶解する1ヶ月以内に、30分間のダイジェスト、2の内部 - 6ヶ月、45分間のダイジェスト。酵素は6ヶ月以上古いものであれば、神経節Fをダイジェストまたは60分。 </li><li> 15分毎に振盪管簡単と神経節を確実にするために、それらをフリック溶液で覆われています。 </li><li>神経節が消化されている間、粒子溶液（ポリビニルピロリドンで被覆されたコロイドシリカ粒子）を用いた密度勾配を調製します。 <ol><li> GADS、サンプルあたり500μlの12％の粒子溶液を混ぜます。 </li><li> GADS、サンプルあたり500μlの28％粒子溶液を混ぜます。 </li><li>ゆっくりと慎重に、各サンプルの新しい1.5 mlチューブに400μlの28％濃度溶液の上に400μlの12％濃度の溶液を添加します。 2つの層が混在しないようにしてください。二つの異なる層は、チューブ内に表示されるはずです。他のより暗い1。 </li></ol></li><li>神経節を消化されている間、（1ファーストブルー陽性およびサンプルを分類ごとに1ファーストブルー負のチューブ）をソートするための新しい1.5 mlのコレクションチューブにラベルを付けます。干渉しないようにソート機能要件に応じて、これらのチューブは、取り外し可能な蓋を持っている必要がありますセルソーターた電子。 </li><li>適当な消化時間後、消化酵素でGADSを除去し、1mlのPBSで2回神経節を洗います。各チューブに新鮮なGADSの200μLを加えます。 </li><li>離れて細胞を破壊するには、上下に数回200μlの100μlの容量に設定さピペット、ピペット神経節を使用してください。組織のない無傷の作品が見られなくなるまで繰り返します。溶液中の気泡を作成しないでください。 </li><li> 70μmのセルストレーナーを通して解離した細胞を渡します。 </li><li>残された残りの浮遊細胞をピックアップし、セルストレーナーを介して追加のソリューションを渡すために、元の解離管に別の100μlのGADSを追加します。新しいピペットチップを使用して、ストレーナを通過し、メッシュにしがみついた残りの細胞含有液を収集します。 GADSに懸濁された細胞の最終容量は300μLです。 </li><li>慎重に以前に作られた密度勾配の上に細胞を300μlをレイヤー。 Cの泡と混合を避けます密度層を有するells。 </li><li>室温で2900×gで10分間遠心します。 </li><li>細胞は遠心分離器であるが、以下のように、溶解バッファー（実験サンプルあたり1ミリリットル）を混ぜる：10μlの2-メルカプトエタノール（RNA抽出キットから）1ミリリットルのBuffer RLTインチ<ol><li>ファーストブルー正のコレクションチューブに300μlの溶解バッファーとファーストブルー負のコレクションチューブ（ステップ4.7からラベルされたチューブ）に600μlのを追加します。この体積は、収集されると予想される細胞の数に依存します。 7000細胞600μlを添加するために、&lt;2,000細胞、300μlを添加する&gt;が。これはかなりの溶解緩衝液を希釈しないソートシース流体を保証します。 </li></ol></li><li>遠心分離が完了したら、慎重に取り外し、トップ700μlの層を捨てます。この層は、他の方法で細胞選別を妨害する細胞の破片の大部分が含まれています。 </li><li>溶液およびピペットを含む残りの細胞に700μlの新鮮なGADSを追加TE数回上下に混合します。 </li><li>細胞をペレットに2900×gで15分間遠心します。 </li><li>細胞は遠心分離器であるが、1ミリリットルのGADSに5μlのDNアーゼ（10mg / ml）を添加することにより、GADS（サンプルあたり500μl）をソート混ぜます。 </li><li>遠心分離が完了したら、慎重に細胞ペレットを残し、上澄み液を除去し、廃棄します。 </li><li>再懸濁200で細胞ペレット - と200μlの数倍に設定千μlをピペットで上下にピペッティングすることにより、GADSをソート300μLを。氷の上にサンプルを置きます。細胞は、今ソートする準備ができています。 </li></ol> 5.蛍光活性化細胞（FAC）並べ替え注：このセクションでは、運用FACSソーターの知識や熟練者の支援を必要とします。 <ol><li>細胞生存度を試験するために、各サンプルに1μlのヨウ化プロピジウム（PI）ストック溶液（50μg/ ml）を加えます。 2チューブ、PIと1と1なしに負の制御を分割します。 PIは死んだ細胞のDNAと結合します。もし最初のいくつかの種類の後に標識する全く死んだ細胞が存在しない、PIの使用は必要ありません。 </li><li>交通細胞を氷上で例えば 、BD FACS AriaIIは、歌姫8ソフトウェアを実行して、楽器フローサイトメトリーします。 </li><li>セルサイズがこの集団内の変数であるため、ソートに大ノズル（100μm）を使用します。ストレス細胞経験の量を減少させ、細胞生存率は、低圧（20 PSI）を使用して増加させます。 </li><li>必要に応じて、解析プロット、前方散乱、側方散乱（SSC）、ファーストブルー、およびPIを設定するために、FACSソーターのソフトウェアを使用してください。 </li><li>細胞を再懸濁するために、そっとソーターにロードする前にサンプルを簡単にボルテックス。 </li><li>ゲート閾値（ 図2A）を設定するために、ネガティブコントロール、無ファーストブルーまたはPIで始まります。これは、細胞集団内の自己蛍光の量を決定します。オプション：死んだ細胞の集団があるかどうかを識別するために、PIで負のサンプルを実行します。 </li><li>陽性対照サンプル（株式会社を並べ替えます補正パラメータを設定するには、）ファーストブルーでubated。 </li><li>ゲートおよびパラメータを設定した後、実験サンプルを選別始めます。試料は、RNA溶解緩衝液を含む準備コレクションチューブにソートされます。 </li><li>細胞選別が完了するまで氷上でソートされたサンプルを保管してください。 </li><li>細胞がソートされた直後のRNA抽出工程を開始します。 </li></ol> 6. RNA抽出<ol><li> 1分間、溶解緩衝液で渦選別された細胞をホモジナイズします。 </li><li>数回ピペッティングにより70％エタノールとミックスの1ボリュームを追加します。 </li><li>スピンカラムに700μlのサンプルまで移します。 8000 x gで15秒間遠心します。フロースルーを捨てます。 <ol><li>試料の全量をスピンカラムを通過するまで繰り返します。 </li></ol></li><li>メーカーのprotocoに従って、DNase処理工程を含む、350μlのBuffer RW1を追加し、RNA精製プロセスを続行細胞についてリットル。 </li><li> RNAを抽出した後、製造業者の仕様書に従って、マイクロ流体電気泳動システムを用いてRNAの品質をテストします。 </li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2/3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats.">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li><li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon.">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li><li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains.">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、迷走神経の節状神経節で気道神経支配ニューロンをターゲットにする方法を説明しています。一旦標識神経節を穏やかに最適細胞数および生存率を維持するために分離されています。これらのニューロンは、その後、FACは、溶解緩衝液に直接ソートされ、RNAが抽出されます。このプロトコルの重要性は、標的に切り分け、および特定の感覚細胞集団の品質を維持する能力?...

体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性神経の細胞体は、後根、三叉神経、または結節神経節のように、知覚神経節に位置しています。それぞれの感覚神経節は、身体の特定の領域を神経支配し、その領域内の別々の臓器や組織を神経支配する細胞が含まれています。三叉神経節は、顔、目、髄膜または上気道1を神経支配するニューロンを含む、頭蓋骨内に配置されている間、例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します2。迷走神経の節状神経節は、頭蓋骨下の首に位置し、消化管、心臓、および下気道や肺3を通して神経繊維を拡張する細胞体が含まれます。ヒトでは節状神経節は、しかし、マウスでそれが融合されて、一人で立っていますまた、肺4を神経支配頚神経節、と。この融合した神経節は、しばしば頸静/結節複雑、迷走神経節、あるいは単に節状神経節5と呼ばれています。ここでは、結節性神経節と呼ばれています。 結節の求心性線維は、脳幹内の孤束核（NTS）の核に内臓からの情報を渡します。このユニークな神経節への感覚入力は、このような腸運動性6、心拍数7、呼吸8,9、および刺激性活性化呼吸応答10,11として機能し、多様な配列を制御します。機能や神経支配器官のこのような多様性と、個々のニューロン経路を研究するために、節状神経節の臓器特異的亜集団を標的とし、単離することが重要です。しかし、結節のサイズが小さく、それが、これは簡単な作業ではありません含まれているニューロンの数が限られて与えられました。神経節結節各マウスは、およそ5,000のニューロン12が含まれています衛星細胞を支持する大規模な集団に加えました。 5000結節ニューロンの、唯一の三から五までパーセントの神経支配気道。そのため、呼吸器刺激や病理に対する気道-神経支配ニューロン内の任意の機能、形態学的または分子変化は、高密度に充填された節状神経節に失われます。 この問題を解決するために、この方法は、気道を神経支配するニューロンを同定および単離するために開発されました。気道は、その後の神経支配の結節ニューロンを同定するために蛍光トレーサー色素に曝露しました。ファーストブルーは、ニューロンによってピックアップし、それが最大8週間13のために保持され、それらの細胞体に素早く移動した- 15。一度同定、まだ効率的な、穏やかな分離プロトコルは、蛍光活性化細胞（FAC）ソートする色素標識および細胞生存率を維持するために使用しました。選別された細胞は、遺伝子発現またはfを決定するために、高品質のリボ核酸（RNA）を抽出するために使用されまたは他の下流の分子解析。このプロトコルは、関心のある組織を神経支配する感覚ニューロンを単離するのに有用で堅牢な技術を提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="942">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Fast Blue</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:132px;">17740-2</td>
			<td style="width:248px;">stock 2 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N21482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">B27 (no vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6009</td>
			<td>stock 50 &#181;g/ml in PBS/10% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>stock 2.5 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">particle solution (Percoll)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Heating block</td>
			<td>LabNet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">70 um cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Absolute Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2484-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10328-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase kit, RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>stock 10 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

体性感覚神経は、熱的、機械的、化学的、および内因性と環境因子によって引き起こされる有害な刺激を伝達します。これらの求心性ニューロンの細胞体は、感覚神経節内に配置されています。感覚神経節は、身体の特定の器官または一部を支配します。例えば、後根神経節（DRG）は、脊柱に配置され、身体や手足全体のプロセスを拡張します。三叉神経節は、頭蓋骨に位置し、顔を支配し、上気道されています。節状神経節の迷走神経求心性神経は、腸、心臓、肺全体に延びています。呼吸数、気道の炎症、および咳反射：結節ニューロンは、以下のような機能の多様な配列を制御します。したがって、それらの機能を理解し、操作するために、気道特定のニューロンのサブ集団を同定し、単離することが重要です。マウスでは、気道は、気道固有の結節ニューロンの逆行性トレーシングのために、蛍光トレーサー染料、ファーストブルーにさらされています秒。結節神経節を解離し、蛍光活性化細胞（FAC）選別染料陽性細胞を収集するために使用されます。次に、高品質のリボ核酸（RNA）は、次世代配列決定のための色素陽性の細胞から抽出されます。この方法は、気道の特定の神経細胞の遺伝子発現を使用して決定されます。

この方法を使用して、気道神経支配するニューロンは、鼻腔内にファーストブルー（ 図1A）を浸透することによって標識されます。 2日後、ファーストブルー標識された細胞は、節状神経節（ 図1C）に表示されます。節状神経節の全ニューロン集団の5％ - これらの細胞は、3を構成しています。この目的のために使用されてきた他の逆行性染?...

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A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

方法は、標的とマウスにおけるアイソ気道-神経支配感覚ニューロンへ

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K ビュー.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

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Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Sf9細胞でとアメフラシ感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージング

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

神経科学

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).

方法は、標的とマウスにおけるアイソ気道-神経支配感覚ニューロンへ

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Sf9細胞でとアメフラシ感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージング

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

の感覚ニューロンの分離

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識

多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

マウスにおける低温感受性と適応を決定するためのシンプルで安価な方法

ダイナミック定量的感覚検査は、中枢性疼痛処理を特徴づけるために、