נתמך על ידי NIH מענק R01HL105635 כדי Sej. המחברים מבקשים להודות דייגו V. Bohórquez עבור ייעוץ טכני. אנו מודים גם ר &#39;איאן קאמינג לקבלת סיוע טכני וביצוע cytometry הזרימה במתקן המשאב המשותף cytometry זרימת מכון מחקר אדם חיסון Duke (Durham, NC). Cytometry זרימה בוצעה במעבדת Biocontainment האזורית באוניברסיטת דיוק שקיבלה תמיכה חלקית לבנייה מן המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (UC6-AI058607).

הנהלים הקשורים בנושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת דיוק. 1. מינהל אפי של כחול מהיר עבור כחול מהיר, לנהל את צבען לפחות 2 ימים לפני והרדמת חסד העכבר. לצבוע יימשך עד שמונה שבועות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם הרדמה משאיפת אור (sevoflurane 2.5%) עד הנשימה מתחיל להאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 200 μl עם טיפים מסוננים להחדיר לאט 40 μl של פתרון צבע (0.4 מ&quot;מ כחול מהיר, sulfoxide דימתיל 1%, DMSO, פוספט בופר, PBS) לתוך הנחיר, עוצר מדי פעם כדי להבטיח את העכבר aspirating הפתרון (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את העכבר אנכי, בראש מורם, ובעדינות לעסות את החזה על מנת להבטיח את הצבע מתפשט ברחבי הריאות. </li></ol> תכשירים 2. על פירוק וניתוח יום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל0; פתרון דיסוציאציה הגרעינים (GADS) על ידי שילוב של מרכיבים כמפורט בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיצוי RNA באזור מעבדה ייעודי. לפני תחילת הניסוי, משטחים נקיים עם 70% אתנול, 10% אקונומיקה, ו מגיבים טיהור RNase. זה כולל את צנטריפוגות RNA, כל מתלי צינור, טפטפות. ודא יש תיבות הפילטר ייעודיות לשימוש RNA בלבד. אין להשתמש בציוד זה ואזור להכנת דנ&quot;א, כמו זה יהיה לזהם את הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים טריים 70%, ו -80% אתנול עם מי RNase חינם. כן 1 מיליליטר לדגימה לשמש להפקת RNA. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מַרכִּיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> מתקדם DMEM / F12 </td><td> 9.5 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> גלוטמין </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> HEPES (10 מ&quot;מ) </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> תוספת N2 </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> B27 (ללא ויטמין A) </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> NGF (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> 10 μl </td></tr></tbody></table> תערובת מגיב 1. טבלת הגרעינים דיסוציאציה פתרון (GADS). 3. הליך לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו צינורות 1.5 מ&quot;ל עם 500 μl GADS, אחד עבור כל דגימה הניסוי, אחד עבור פקד מיון חיובי, ואחד עבור פקד מיון שלילי. צינורות חנות על הקרח ברחבי לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את גנגליון nodose ולעשות שני חתכים חלקית כדי להקל דיסוציאציה, ואז לשים אותו בצינור המדגם הניסיון. עיין פרוטוקול יופיטר הבא לנתיחה של גרעיני nodose 16 DRG 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח באופן חלקי לחתוך גרעינים שאינם שכותרתו, כגון גרעיני שורש הגבה (DRG), עבור פקדי המיון. השתמש בשני גרעינים עבור השליטה החיובית ושני ganglia אם הביקורת השלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג מספיק נוירונים nodose למיון מוצלח, לשלב גרעינים מ -5 עכברים לתוך GADS המכיל צינור דגימה אחת ניסיוני. </li></ol> 4. חושי גרעיני דיסוציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה מתוך 500 GADS μl, עוזב הגרעינים בצינור. לשטוף הגרעינים פעם על ידי הוספת 1 מ&quot;ל PBS, לחכות הגרעינים להתיישב אל החלק התחתון של הצינור, אז פיפטה את PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל GADS ו -22 μl של אנזים עיכול (collagenase I / II ותמהיל פרוטאז, 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב H 2 O) על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl Fast כחולים (5.26 מ&quot;מ) אל צינור הבקרה החיובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הצינורות בתוך גוש אמבטיה או חימום מים להגדיר כבר על 37 מעלות צלזיוס. שים לב: בפעם עיכול גרעינים תלוי בגילו של אנזים העיכול. בתוך חודש 1 של המסת אנזים עיכול, לעיכול למשך 30 דקות, תוך 2 - 6 חודשים לעכל במשך 45 דקות. אם האנזים הוא מעל 6 חודשים, לעכל גרעיני fאו 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל 15 דק &#39;צינורות שייק בקצרה הקפיצי להם להבטיח גרעינים מכוסים על ידי הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד גרעינים נמצאים מתעכלים, להכין הדרגתיים צפיפות באמצעות פתרון חלקיקים (חלקיקי סיליקה colloidal מצופים polyvinylpyrrolidone). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 12 פתרון החלקיקים% ב GADS, 500 μl לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 28 פתרון החלקיקים% ב GADS, 500 μl לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט ובזהירות להוסיף פתרון צפיפות 400 μl 12% על גבי 400 μl 28 פתרון צפיפות% בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר טרי עבור כל דגימה. אל תאפשר את שתי השכבות לערבב. שתי שכבות נפרדות צריכות להיות גלויות בצינור; אחד כהה יותר מהאחר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד גרעינים נמצאים מתעכלים, תווית צינורות 1.5 מיליליטר אוסף חדשים למיון (אחד חיובי כחול מהיר ואחד צינור שלילי כחול מהיר לדגימת מיון). בהתאם לדרישות מתקן המיון, צינורות אלה חייבים להיות מכסים פריקים כדי לא interferדואר עם סדרן התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן העיכול המתאים, להסיר GADS עם אנזים עיכול ולשטוף גרעינים פעמים עם 1 המ&quot;ל PBS. הוסף 200 μl של GADS הטרי על צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה 200 μl, נקבע על 100 נפח μl, ואת הגרעינים פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבור תאים בנפרד. חזור על פעולה עד לא חלק שלם של רקמות נתפסת. הימנע מיצירת בועות הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pass תאים ניתקו דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עוד 100 μl GADS אל צינור דיסוציאציה המקורי להרים את כל תאים תועים נותרים עזבו ולהעביר את הפתרון הנוסף דרך מסננת התא. בעזרת קצה פיפטה חדש, לאסוף כל נוזל נותרים המכילים תאים שחלף הדרך המסננת ונצמד אל הרשת. ההיקף הסופי של תאי מרחפי GADS הוא 300 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות שכבת 300 μl של תאים על גבי שיפוע הצפיפות שנעשה בעבר. הימנע בועות ערבוב של גאמות עם שכבות הצפיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 2,900 XG ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים הם בצנטריפוגה, לערבב חיץ תמוגה (1 מ&quot;ל לכל מדגם ניסיוני) כדלקמן: 10 μl 2-mercaptoethanol ב 1 מ&quot;ל הצפת RLT (מ ערכת חילוץ RNA). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 חיץ תמוגה μl כדי צינור איסוף חיובי כחול מהיר 600 μl כדי צינור איסוף שלילי כחול מהיר (צינורות שכותרתו משלב 4.7). כרך זה תלוי במספר התאים צפוי להיות שנאספו. עבור &lt;2,000 תאים, להוסיף 300 μl עבור&gt; 7,000 תאים להוסיף 600 μl. פעולה זו תבטיח את נוזל נדן המיון לא לדלל למאגר תמוגה משמעותי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה תושלם, להסיר בזהירות וזורקים את שכבת μl 700 העליונים. שכבה זו מכילה את רוב פסולת התא כי יפריע אחרת עם מיון התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 700 GADS טריים μl אל תא הנותרים המכיל פתרון pipette מעלה פעמים למטה כמה לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 2,900 XG כדי גלולת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים הם בצנטריפוגה, לערבב מיון GADS (500 μl לדגימה) על ידי הוספת 5 DNase μl (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ל 1 מ&quot;ל GADS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה נעשה, להסיר בזהירות וזורקים supernatant, עוזב את התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות תא גלולה ב 200 - 300 GADS מיון μl ידי pipetting מעלה ומטה עם טפטפת 1,000 μl מוגדר 200 μl מספר פעמים. שים דגימות קרח. תאים מוכנים כעת להיות מסודר. </li></ol> 5. תא הופעל קרינה (FAC) מיון הערה: סעיף זה מחייב את הידע המבצעי של סדרן FACS או בסיוע של כוח אדם מיומן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl יודיד propidium (PI) פתרון המניות (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) מדגם לבדוק כדאיות התא. פיצול ביקורת שלילית לתוך 2 צינורות, אחד עם PI ואחד בלי. PI נקשר DNA רק תאים מתים. אםלאחר מיני הראשונים אין תאים מתים לתייג, השימוש PI אינו נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תחבורה לזרום cytometry מכשיר, למשל., BD FACS AriaII פועלת תוכנת דיווה 8, על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז גודל התא משתנה באוכלוסייה זו, השתמש זרבובית גדולה (100 מיקרומטר) למיון. כדי להקטין את כמות הלחץ החוויה תאים ולהגדיל כדאיות התא להשתמש בלחץ נמוך (20 psi). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת סדרן FACS להקים המגרשים ניתוח, פיזור קדימה, פיזור צד (SSC), Fast כחול, ו PI, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות תאים, בעדינות מערבולת בקצרה המדגם לפני הטעינה אותו לתוך הסדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל עם השליטה השלילית, לא כחול מהיר או PI, כדי לקבוע את סף השער (איור 2 א). זה יקבע את כמות autofluorescence באוכלוסיית התא. אופציונאלי: הפעל את המדגם השלילי עם PI לזהות אם יש אוכלוסייה של תאים מתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין מדגם הבקרה החיובי (incubated עם כחול מהיר), כדי להגדיר את הפרמטרים פיצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע השערים ופרמטרים מוגדרים, להתחיל במיון דגימות הניסוי. דוגמאות מסודרות לתוך הצינורות המוכנים אוסף המכילים חיץ תמוגה RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות מיון על קרח עד מיון התא הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין שלב מיצוי RNA מיד לאחר תאים מסודרים. </li></ol> 6. RNA מיצוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ממוינים וורטקס במאגר תמוגה דקות 1 עד homogenize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח של 70% אתנול ו לערבב ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר עד 700 μl של המדגם לעמודה ספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב g x 8,000. מחק את הזרימה דרך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עד הנפח הכולל של המדגם הוא עבר דרך טור ספין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 350 μl הצפת RW1 ולהמשיך את תהליך טיהור RNA, כולל שלב הטיפול DNase, על פי של protoco היצרןl עבור תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר RNA חולץ, לבדוק את איכות RNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה microfluidic על פי המפרט של היצרן. </li></ol>

<ol>
	<li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia.">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li><li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse.">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21 (2013).</li><li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects.">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li><li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia.">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li><li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways.">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li><li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat.">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li><li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion.">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li><li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing.">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li><li>Kaczy&#324;ska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration.">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li><li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents.">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li><li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents.">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li><li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin.">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li><li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+expression+of+cold+receptors+(TRPM8+and+TRPA1)+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex.">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li><li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry.">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li><li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus:+A+comparison+of+Fast+Blue,+Fluoro-ruby,+Fluoro-emerald,+Fluoro-Gold+and+DiI.">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li><li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat.">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li><li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels.">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782 (2013).</li><li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus.">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li><li>Kwong, K., Lee, L. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE(2)+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli.">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li><li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways.">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li><li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2/3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats.">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li><li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon.">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li><li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains.">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li><li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing.">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה למקד נוירונים דרכי הנשימה-innervating בגרעיני nodose של העצב התועה. לאחר שכותרתו, הגרעינים הם ניתקו בעדינות לשמר מספרים סלולריים באופן המיטבי את כדאיות. נוירונים אלה הם אז FAC מסודר ישירות למאגר תמוגה ו- RNA מופק. המשמעות של פרוטוקול זה היא היכולת למקד, לבוד...

עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של עצבים מביאים אלה ממוקמים בגרעיני חושי, כגון שורש הגבה, trigeminal, או גרעיני nodose. כל גנגליון חושי מעצבב אזורים ספציפיים בגוף ומכיל תאי מעצבבי איברים ורקמות נפרדים בתוך אזור זה. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים, בעוד הגרעינים trigeminal ממוקמים בגולגולת, המכיל נוירונים המעצבבים את הפנים, העיניים, קרומי המוח או העליון דרכי הנשימה 1, 2. גרעיני nodose של העצב התועה ממוקמים בצוואר מתחת הגולגולת מכילים גופי תא שמרחיבים סיבים עצב לאורך כל מערכת העיכול, הלב ודרכי נשימה תחתונה וריאות 3. אצל בני האדם גנגליון nodose עומד בפני עצמו, עם זאת, העכבר הוא התמזגעם גנגליון הצוואר, אשר גם מעצבב ריאות 4. גנגליון התמזג זה נקרא לעתים קרובות צוואר / nodose מורכב, גנגליון המחנק, או פשוט גנגליון 5 nodose. הנה, זה נקרא גנגליון nodose. סיבים מביאים של nodose להעביר מידע מן הקרביים לגרעין של הדרך הבודדה (NTS) בגזע המוח. קלט חושי אל גנגליון ייחודי זה שולט מערך מגוון של פונקציות, כגון מעי תנועתיות 6, קצב לב 7, נשימת 8,9, ותגובות נשימה מופעלות מגרות 10,11. עם המגוון הזה של פונקציות ואיברים מעוצבבים, חשוב למקד ולבודד subpopulations איבר ספציפי של גנגליון nodose כדי ללמוד מסלולים עצביים הפרט. עם זאת, בהתחשב בגודל הקטן של nodose ואת המספר המוגבל של נוירונים הוא מכיל זו אינה משימה טריוויאלית. כל עכבר nodose גנגליון מכיל בערך 5,000 נוירונים 12בנוסף אוכלוסייה נרחבת של תאים תומכים בלוויין. של 5,000 הנוירונים nodose, רק 3 - 5% innervate את דרכי הנשימה. לכן, כל שינוי פונקציונלי, מורפולוגיים או מולקולרי בתוך הנוירונים דרכי הנשימה-innervating, עקב גירוי בדרך נשימה או פתולוגיות, יאבד גנגליון nodose הצפוף. כדי לפתור בעיה זו, פותחה שיטה לזהות ולבודד נוירונים המעצבבים את דרכי הנשימה. דרכי האוויר נחשפו לצבוע נותב ניאון כדי לזהות את הנוירונים nodose innervating שלאחר מכן. כחול מהיר נאסף על ידי נוירונים ונוסע במהירות גופי התא שלהם איפה זה נשמר עד שמונה שבועות 13 - 15. לאחר הזיהוי, פרוטוקול עדין, אך יעיל, דיסוציאציה שימש לשמר תיוג לצבוע כדאיות התא עבור התא מופעל ניאון (FAC) מיון. תאים ממוינים משמשים כדי לחלץ חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) כדי לקבוע ביטוי גנים או fאו ניתוח מולקולרי במורד אחר. פרוטוקול זה מספק טכניקה יעילה וחזקה לבודד עצב סנסורי מעצבבי רקמה של עניין.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="942">
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Fast Blue</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences, Inc.</td>
			<td style="width:132px;">17740-2</td>
			<td style="width:248px;">stock 2 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N21482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D128-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:405px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">glutamine (Glutamax)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">B27 (no vitamin A)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6009</td>
			<td>stock 50 &#181;g/ml in PBS/10% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401054001</td>
			<td>stock 2.5 mg/ml in water</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">particle solution (Percoll)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1644-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Heating block</td>
			<td>LabNet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">70 um cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Absolute Ethanol (200 proof)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase free water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2484-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10328-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-6010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase kit, RNase-Free DNase Set</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170-10MG</td>
			<td>stock 10 &#181;g/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של הנוירונים מביאים אלה ממוקמים בתוך הגרעינים החושיים. גרעינים חושיים מעצבבי איבר או חלק מסוים של הגוף. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים. גרעיני trigeminal ממוקמים הגולגולת המעצבבים את הפנים, ואת דרכי נשימה עליונות. afferents מחנק של הגרעינים nodose להאריך ברחבי הבטן, הלב והריאות. הנוירונים nodose לשלוט מערך מגוון של פונקציות כגון: קצב הנשימה, גירוי בדרכי הנשימה, שיעול ורפלקסים. לכן, כדי להבין ולטפל תפקידם, חשוב לזהות ולבודד תת-אוכלוסיות עצביות ספציפיות דרך נשימה. בשנת העכבר, את דרכי הנשימה נחשפות לצבוע נותבו ניאון, מהיר כחולה, לאיתור מדרדר של נוירון nodose ספציפי דרך נשימהים. גרעיני nodose הם ניתקו ותא מופעל קרינה (FAC) מיון משמש לאיסוף תאי צבע חיוביים. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) מופקת תאים חיוביים לצבוע עבור סידור הדור הבא. באמצעות דרכי הנשימה בשיטה זו ביטוי גנים עצבי ספציפי נקבע.

באמצעות שיטה זו, נוירונים דרכי הנשימה-innervating מסומנים intranasally ידי הקניית כחול מהיר (איור 1 א). לאחר יומיים, תאים שכותרתו כחול מהיר להופיע בגרעיני nodose (תרשים 1C). תאים אלה לפצות 3 - 5% מכלל האוכלוסייה העצבית הכולל של גרעיני nodose. צבעי מדרדר א?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice at JoVE.com

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

שיטה לכוון ולבודד Airway-innervating עצב סנסורי של עכברים

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.1K Views.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Video: A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Dynamic Quantitative Sensory Testing to Characterize Central Pain Processing

Central facilitation and modulation of incoming nociceptive signals play an important role in the perception of pain. Disruption in central pain processing is present in many chronic pain conditions and can influence responses to specific therapies. Thus, the ability to precisely describe the state of central pain processing has profound clinical significance in both prognosis and prediction. Because it is not practical to record neuronal firings directly in the human spinal cord, surrogate behavior tests become an important tool to assess the state of central pain processing. Dynamic QST is one such test, and can probe both the ascending facilitation and descending modulation of incoming nociceptive signals via TS and CPM, respectively. Due to the large between-individual variability in the sensitivity to noxious signals, standardized TS and CPM tests may not yield any meaningful data in up to 50% of the population due to floor or ceiling effects. We present methodologies to individualize TS and CPM so we can capture these measures in a broader range of individuals than previously possible. We have used these methods successfully in several studies at the lab, and data from one ongoing study will be presented to demonstrate feasibility and potential applications of the methods.

By assessing pain in response to repetitive or different types of standardized stimuli, dynamic quantitative sensory testing (QST) can reveal changes in the central processing of pain. We present methods to optimize and individualize two dynamic QST measures: temporal summation (TS) and conditioned pain modulation (CPM).

שיטה לכוון ולבודד Airway-innervating עצב סנסורי של עכברים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

בידוד של נוירונים חושיים של

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים

הפקה ובידוד של אקסונים מסנסורי ביוכימית ניתוח באמצעות מסננים נקבוביים

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

שיטה פשוטה וזולה לקביעה קרה רגישות והסתגלות בעכברים

הדינמי כמוני בדיקה חושית לאפיון עיבוד כאב המרכזי