Name: a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice
Uploaded: 2016-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice at JoVE.com

Financiado pelo NIH conceder R01HL105635 a SEJ. Os autores gostariam de agradecer a Diego V. Bohórquez para aconselhamento técnico. Agradecemos também R. Ian Cumming para a assistência técnica e realização da citometria de fluxo no Centro de Duke vacina humana Instituto de Pesquisa Citometria de Fluxo de recursos partilhados (Durham, NC). A citometria de fluxo foi realizada no Laboratório de biocontenção Regional na Duke que recebeu o apoio parcial para a construção dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (UC6-AI058607).

Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Duke. 1. Administração Intranasal de Fast Blue Para Fast Blue, administrar o corante, pelo menos, 2 dias antes da eutanásia o mouse. O corante vai persistir por até oito semanas. <ol><li> Anestesiar o rato com anestesia inalatória leve (2,5% sevoflurano) até que começa a respiração lenta. </li><li> Usar uma pipeta de 200 uL com pontas filtrados para instilar-se lentamente 40 ml de solução de corante (0,4 mM Fast Blue, 1% de sulfóxido de dimetilo, solução salina de DMSO, em tampão fosfato, PBS) na narina, parando periodicamente para assegurar o rato é aspiração da solução (Figura 1A). </li><li> Segure o mouse vertical, cabeça para cima e massageie suavemente no peito para garantir o corante se espalha por todo o pulmão. </li></ol> 2. Preparações sobre Dissecção e Dia Análise <ol><li> Preparar 10 ml0; Ganglia dissociação Solução (GADs) por combinação dos ingredientes tal como especificado no Quadro 1. </li><li> Realizar a extracção de ARN em uma área de laboratório dedicado. Antes de começar a experiência, limpar as superfícies com 70% de etanol, 10% de água sanitária, e reagente de descontaminação RNase. Isto inclui a centrifugação de ARN, quaisquer suportes de tubos, e as pipetas. Garantir que não dedicados ponta caixas de filtro para uso apenas RNA. Não utilize este equipamento e área para preparação de ADN, como isso vai contaminar as amostras. </li><li> Mistura fresca de 70% e 80% de etanol com água livre de RNase. Prepare 1 ml para cada amostra a ser usado na extracção de ARN. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Quantidade </td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutamina </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> suplemento N2 </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> B27 (sem vitamina A) </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Mistura Reagente para Ganglia dissociação Solution (gads). 3. Dissecção Procedimento <ol><li> Encher tubos de 1,5 ml com 500 ul GADs, uma para cada amostra experimental, um como contraprova positiva de triagem, e uma para um controlo negativo de triagem. tubos de loja no gelo durante todo dissecção. </li><li> Dissecar o gânglio nodoso e fazer dois cortes parciais para facilitar a dissociação, em seguida, colocá-lo no tubo de ensaio experimental. Por favor, consulte o seguinte protocolo JoVE para dissecção dos gânglios nodosos 16 e DRG 17. </li><li> Dissecar e parcialmente em corte gânglios não marcado, tais como gânglio da raiz dorsal (DRG), para os controlos de triagem. Use dois gânglios para o controlo positivo e dois Ganglium para o controlo negativo. </li><li> Para obter neurónios nodosos suficientes para classificar bem sucedida, combinar gânglios a partir de 5 ratos em um tubo de amostra experimental contendo GADs. </li></ol> 4. Sensorial Ganglia dissociação <ol><li> Pipeta 500 GADs ul, deixando gânglios no tubo. Lave gânglios uma vez, adicionando 1 ml PBS, aguarde gânglios para assentar no fundo do tubo, então pipeta PBS. </li><li> Adicionar 1 ml GADs e 22 ul da enzima de digestão de colagenase (I / II e mistura de protease, 2,5 mg / ml em H2O) a cada tubo. </li><li> Adicionar 20 ul azuis Rápido (5,26 mm) para o tubo de controlo positivo. </li><li> Colocar os tubos num banho de água ou bloco de aquecimento já fixada em 37 ° C. Nota: O tempo de digestão gânglios depende da idade da enzima de digestão. No espaço de 1 mês de dissolução do enzima de digestão, digestão durante 30 min, a 2 - 6 meses digerir durante 45 min. Se a enzima é mais de 6 meses de idade, digerir gânglios fou 60 min. </li><li> A cada 15 minutos tubos de agitar brevemente e agite-los para assegurar gânglios são cobertos pela solução. </li><li> Enquanto estão a ser digerido gânglios, preparar gradientes de densidade, utilizando uma solução de partículas (partículas de sílica coloidal revestida com polivinilpirrolidona). <ol><li> Misturar a solução de partículas% 12 em GADs, 500 ul por amostra. </li><li> Misturar a solução de partículas% 28 em GADs, 500 ul por amostra. </li><li> Lentamente e cuidadosamente adicionar solução densidade de 400 ul de 12% na parte superior da solução densidade de 400 ul de 28% em um tubo de 1,5 ml fresco para cada amostra. Não permita que as duas camadas para misturar. Duas camadas distintas deve ser visível no tubo; uma mais escura que a outra. </li></ol></li><li> Enquanto gânglios estão sendo digerida, rotular novos tubos de 1,5 ml de coleta para ordenar (um tubo rápido Azul positivo e um rápido Azul negativo por amostra de classificação). Dependendo dos requisitos da instalação de triagem, estes tubos devem ter tampas amovíveis de modo a não interferirE com o classificador de células. </li><li> Após o tempo de digestão adequada, remova GADs com enzima de digestão e lavar gânglios duas vezes com 1 ml PBS. Adicionar 200 ul de GADs fresco a cada tubo. </li><li> Usar uma pipeta de 200 mL, definido como volume de 100 mL, e gânglios pipeta cima e para baixo várias vezes para separar as células. Repita até que nenhum pedaço intacto do tecido é visto. Evitar a criação de bolhas na solução. </li><li> Passa células dissociadas através de um filtro celular de 70 uM. </li><li> Adicionar mais 100 GADs ul ao tubo de dissociação original para pegar todas as células perdidas restantes esquerda e passar a solução adicional através do filtro de células. Utilizando uma nova ponta de pipeta, recolher qualquer líquido contendo células remanescente que passou através do filtro e agarrou-se à malha. O volume final de células suspensas em GADs é 300 ul. </li><li> camada cuidadosamente os 300 ul de células no topo do gradiente de densidade previamente feita. Evitar bolhas e mistura de cells com as camadas de densidade. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 2900 xg à temperatura ambiente. </li><li> Enquanto as células são na centrífuga, mistura de tampão de lise (1 ml por amostra experimental) como se segue: 10 ul de 2-mercaptoetanol em 1 ml de tampão de RLT (estojo de extracção de ARN). <ol><li> Adicionar 300 mL de tampão de lise de tubo de coleta positiva Azul Rápido e 600 mL ao tubo rápido Azul negativo de coleta (tubos rotulados a partir do passo 4.7). Esse volume depende do número de células que se espera serem recolhidos. Para &lt;2000 células, adicionar 300 ul, durante&gt; 7.000 células adicionar 600 ul. Isto irá assegurar que o fluido de revestimento de classificação não dilui significativamente o tampão de lise. </li></ol></li><li> Uma vez que a centrifugação estiver concluída, remova cuidadosamente e elimine a camada ul top 700. Esta camada contém a maioria dos resíduos celulares que de outra forma interfira com a separação de células. </li><li> Adicionar 700 ul GADs frescos para a célula restante contendo solução e pipetate para cima e para baixo várias vezes para misturar. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 2900 xg para sedimentar as células. </li><li> Enquanto as células são na centrífuga, misturar triagem GADs (500 ul por amostra) pela adição de 5 ul de ADNase (10 mg / ml) até 1 ml GADs. </li><li> Depois de centrifugação é feito, cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante, deixando o sedimento celular. </li><li> Re-suspender pellet celular em 200 - 300 ml de classificação GADs pipetando cima e para baixo com uma pipeta de 1000 mL ajustado para 200 mL várias vezes. Coloque as amostras em gelo. As células são agora pronto para ser classificado. </li></ol> 5. fluorescência celular ativado (FAC) Classificando Nota: Esta seção requer conhecimento operacional de um classificador FACS ou a assistência de pessoal qualificado. <ol><li> Adicionar uma solução de estoque ul iodeto de propídio (PI) (50 ug / ml) para cada amostra a testar para a viabilidade celular. Divisão de controle negativo em 2 tubos, um com PI e um sem. PI se liga ao ADN apenas em células mortas. E seapós os primeiros tipos não há células mortas, para rotular, não é necessário o uso de PI. </li><li> Células de transporte para citometria de fluxo instrumento, por exemplo., BD FACS AriaII executando o software Diva 8, em gelo. </li><li> Uma vez que o tamanho da célula é variável nesta população, usar um grande bocal (100 uM) para a classificação. Para diminuir a quantidade de tensão da experiência as células e aumentar a viabilidade celular utilizar baixa pressão (20 psi). </li><li> Use o software classificador FACS para configurar as parcelas de análise, de dispersão para a frente, dispersão lateral (SSC), Blue rápido e PI, se necessário. </li><li> Para as células re-suspender, gentilmente vortex brevemente a amostra antes de o colocar na classificador. </li><li> Comece com o controlo negativo, nenhum Fast Blue ou IP, para definir o limite de portão (Figura 2A). Isto vai determinar a quantidade de autofluorescência na população de células. Opcional: Executar a amostra negativa com PI para identificar se existe uma população de células mortas. </li><li> Classificar a amostra de controlo positivo (incubated com Fast Blue), para definir os parâmetros de compensação. </li><li> Uma vez que os portões e parâmetros são definidos, começam a triagem das amostras experimentais. As amostras são classificadas dentro dos tubos de coleta de preparados contendo tampão RNA lise. </li><li> Manter as amostras classificadas em gelo até que a separação de células é completa. </li><li> Comece a etapa de extração de RNA imediatamente após as células são classificadas. </li></ol> 6. Extracção de ARN <ol><li> Vortex células classificadas em tampão de lise durante 1 min para homogeneizar. </li><li> Adicionar 1 volume de etanol a 70% e misture pipetando cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transferir para 700 ul da amostra a uma coluna de centrifugação. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g. Descartar o fluxo de passagem. <ol><li> Repetir até que o volume total da amostra é passada através da coluna de centrifugação. </li></ol></li><li> Adicionar 350 ul de tampão de RW1 e continuar o processo de purificação de ARN, incluindo o passo de tratamento com ADNase, de acordo com Protoco do fabricantel para as células. </li><li> Uma vez que o RNA foi extraído, testar a qualidade de ARN utilizando um sistema de electroforese de microfluidos de acordo com as especificações do fabricante. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo descreve um método para alvejar neurónios das vias aéreas-inervação nos gânglios nodosos do nervo vago. Uma vez marcado, os gânglios são suavemente dissociados para otimizar a preservar o número de células e viabilidade. Estes neurónios são, então, classificados FAC directamente em tampão de lise e o ARN é extraído. A importância deste protocolo é a capacidade de segmentar, isolar e preservar a qualidade de uma população de células sensorial específica. A expressão de genes é descr...

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes nervos aferentes estão localizados em gânglios sensoriais, tais como a raiz dorsal, trigeminal, ou gânglios nodosos. Cada gânglio sensorial inerva regiões específicas do corpo e contém células que inervam órgãos e tecidos separadas dentro dessa região. Por exemplo, os gânglios da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros, enquanto que o gânglio trigeminal estão localizados no crânio, contendo neurónios que inervam a face, olhos, meninges ou das vias aéreas superiores 1, 2. A gânglios nodosos do nervo vago está localizado no gargalo abaixo do crânio e contém corpos celulares que se estendem fibras nervosas ao longo do tracto gastrointestinal, no coração e pulmões e vias aéreas inferiores 3. Nos seres humanos o gânglio nodoso está sozinho, no entanto, no ratinho é fundidacom o gânglio jugular, que também inerva os pulmões 4. Este gânglio fundido é muitas vezes chamado a jugular / nodose complexa, gânglio vagal, ou simplesmente nodose gânglio 5. Aqui, é referido como o gânglio nodoso. fibras aferentes do nodosos passar informações de vísceras para o núcleo do tracto solitário (NTS) no tronco cerebral. Entrada sensorial para esta gânglio único controla um conjunto diversificado de funções, tais como a motilidade intestinal 6, 7 da frequência cardíaca, a respiração 8,9, e as respostas respiratórias activado-irritantes 10,11. Com esta diversidade de funções e órgãos inervados, é crítico para alvejar e isolar subpopulações específicas de órgãos do gânglio nodoso, a fim de estudar vias neuronais individuais. No entanto, dado o pequeno tamanho do nodosos e ao limitado número de neurónios que contém esta não é uma tarefa trivial. Cada rato nodose gânglio contém cerca de 5.000 neurônios 12em adição a uma grande população de células de suporte satélite. Dos 5.000 neurónios nodosos, apenas 3 - 5% inervam as vias aéreas. Portanto, quaisquer alterações funcionais, morfológicos ou moleculares dentro dos neurônios das vias aéreas-inervação, devido a estimulação respiratória ou patologias, serão perdidos no gânglio nodoso densamente. Para resolver este problema, foi desenvolvido um método para identificar e isolar neurónios que inervam as vias aéreas. As vias aéreas foram expostos a um corante marcador fluorescente para identificar os neurónios nodosos inervação subsequentes. Azul rápida foi apanhada por neurônios e viaja rapidamente para seus corpos celulares, onde é retido por até oito semanas 13 - 15. Uma vez identificados, um protocolo de dissociação suave, mas eficiente foi usado para preservar rotulagem corante e viabilidade celular para celular ativado fluorescente (FAC) de classificação. As células seleccionadas são usadas para extrair o ácido ribonucleico de alta qualidade (ARN) para determinar a expressão do gene ou fou outra análise molecular a jusante. Este protocolo proporciona uma técnica útil e robusto para isolar neurónios sensoriais que inervam um tecido de interesse.

<table><tbody><tr><td>Fast Blue</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>stock 2 mg/ml in water</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamine (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (no vitamin A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &amp;micro;g/ml in PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>stock 2.5 mg/ml in water</td></tr><tr><td>particle solution (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>DNase kit, RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>stock 10 &amp;micro;g/ml in PBS</td></tr><tr><td>Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

nervos Somatosensoriais transduzir estímulos nocivos causados ​​por ambos os agentes endógenos e ambientais térmica, mecânica, química, e. Os corpos celulares destes neurónios aferentes estão localizados dentro do gânglio sensorial. gânglios sensoriais que inervam um órgão específico ou porção do corpo. Por exemplo, o gânglio da raiz dorsal (DRG) são localizados na coluna vertebral e extensão dos processos ao longo do corpo e membros. O gânglio trigeminal estão localizados no crânio e inervam a face, e das vias aéreas superiores. aferentes vagais dos gânglios nodosos se estender por todo o intestino, coração e pulmões. Os neurónios nodosos controlar um conjunto diversificado de funções, tais como: freqüência respiratória, irritação das vias aéreas, e reflexo de tosse. Assim, entender e manipular a sua função, é crítica para identificar e isolar sub-populações neuronais específicas das vias aéreas. No rato, as vias aéreas estão expostas a um corante marcador fluorescente, azul rápido, para rastreamento retrógrado de neurônio nodose específica das vias aéreass. Os gânglios nodosos são dissociados e de células activadas por fluorescência (FAC) de classificação é usado para coletar células positivas de corante. Em seguida, o ácido ribonucleico, de alta qualidade (ARN) é extraído a partir de células positivas de corante para a próxima geração de sequenciação. Usando este método de expressão do gene de vias aéreas neuronal específica é determinada.

Usando este método, os neurónios da via aérea-inervação são rotulados por via intranasal incutir Fast Blue (Figura 1A). Após dois dias, as células marcadas azul depressa aparecem nos gânglios nodosos (Figura 1C). Essas células formam 3-5% da população neuronal total do gânglios nodosos. Outros corantes retrógrada, que têm sido utilizados para este fim incluem DiI (1,1&#39;-dioctadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-perclorato tetramethylindocarbocyan...

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A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K visualizações.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

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A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biologia

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Medicina

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Neurociência

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

<meta charset="utf8"></head><body>Investigação de neurônios sensoriais olfativos de camundongos ativados por meio de imunocoloração combinada e hibridização in situ

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Investigação de neurônios sensoriais olfativos de camundongos ativados por meio de imunocoloração combinada e hibridização in situ

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Direcionamento de neurônios simpáticos de camundongos: uma abordagem de simpatectomia lombar

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

Autor em destaque: explorando a plasticidade dos neurônios simpáticos

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

Simpatectomia Lombar Cirúrgica em Camundongos

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

Um método para alvejar e Isolar Airway-inervação neurônios sensoriais em Ratos

Resumo

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A reversível, método não-invasivo para medições de Resistência das Vias Aéreas e Amostragem Líquido da Lavagem Broncoalveolar em Ratos

Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury

Visualização direta do Murino Dorsal Coclear Nucleus para Optogenetic Estimulação da via auditiva

Perfurado gravação patch-clamp de rato Olfactory neurônios sensoriais na Intact neuroepitélio: Análise Funcional do Neurônios Expressando uma Odorant Receptor Identificados

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

A Preparação de Oblique Spinal Cord Fatias de Estimulação raiz ventral

Investigação de neurônios sensoriais olfativos de camundongos ativados por meio de imunocoloração combinada e hibridização in situ

Investigação de neurônios sensoriais olfativos de camundongos ativados por meio de imunocoloração combinada e hibridização in situ

Simpatectomia Lombar Cirúrgica em Camundongos

Simpatectomia Lombar Cirúrgica em Camundongos