この作品は、私たちは、原稿の重要な読書のためのアレムGiorgisに感謝CHSにGTEC（2731336および1411318）、NIH（K01DK081351）、およびNSF（1354837）からの助成金によって部分的にサポートされていました。

ゼブラフィッシュは上昇し、国立衛生研究所の基準を満たしており、ジョージア工科大学施設内動物管理使用委員会により承認された標準プロトコルを使用して飼育しました。 ソリューションの調製<ol><li>胚/幼虫のゼブラフィッシュを維持するために、（同義的に「胚培地」で使用される）20 Lの卵の水を準備します。蒸留水250ミリリットル中に1.5グラムのCaSO 4と6グラムインスタント海の海の塩を溶解させます。 20 Lの蒸留水で満たされたカーボイに注ぎ、かき混ぜます。 </li><li> 1 L 1-フェニル-2-チオ尿素（PTU）ストック溶液（20倍）を準備します。 1 Lの蒸留水に0.6グラムのPTU粉末を溶かします。作動液として0.003％の最終濃度は、20 mlの胚培地当たりストック溶液1mlを加えます。 注意：PTUは、吸入または皮膚暴露後の全身毒性を引き起こす可能性があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 </li><li> 1 Lのエチル3- aminobeを準備nzoateメタン（トリカイン）ストック溶液（20倍）。蒸留水で4グラムのトリカイン粉末を溶かします。 1 Mトリス緩衝液（pH 9）を加えることによりpHを7に調整し、蒸留水で1Lの最終容量をもたらします。 -20℃で50ミリリットルにアリコートとストア。使用前に解凍します。 注意：トリカインは、感覚の喪失を誘導することができます。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 </li><li> 100ミリリットル幼虫メトロニダゾール（MTZ）ワーキング溶液を調製します。 100 mlの胚培地中の0.1％のジメチルスルホキシド（DMSO）0.25グラムMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な15mMのMTZ溶液を作ります。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。 注意：MTZが、炎症を引き起こす場合があります。準備し、適切な取り扱いガイドラインに従って使用しています。 </li><li> 100ミリリットル幼虫のエタノール/メトロニダゾール（エタノール/ MTZ）ワーキング溶液を調製します。新鮮なMTZ溶液を作製し、光触媒ドを防ぐためにアルミ箔を使用MTZのグラデーション。使用直前に1.5％の最終濃度まで100ミリリットルMTZ溶液に1.5ミリリットルの100％エタノールを追加します。 </li><li> 500ミリリットル大人MTZ作業溶液を準備します。 500ミリリットルシステムの水に0.1％のDMSO中に0.83グラムのMTZ粉末を溶解することにより、新鮮な10mMのMTZソリューションを作成します。激しく振盪によって完全にMTZ粉末を溶かします。新鮮なMTZ溶液を作成し、MTZの光触媒分解を防ぐためにアルミ箔を使用しています。 </li><li> 1 L PEMバッファを準備します。 30.2グラムのPIPES、0.74グラムのEGTA、および0.12グラムの蒸留水に硫酸マグネシウムを溶解させます。 NaOHでpHを7に調整します。蒸留水で1リットルに最終容量を持参。 </li></ol>幼虫のゼブラフィッシュの調製<ol><li> [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11] のTg（hand2：EGFP）で15,17大人のゼブラフィッシュは、交配タンク内の13の大人のゼブラフィッシュをPD24。時限交配を行うために仕切りを使用します。 </li><li> Dを削除します翌朝ividerと魚が中断することなく交尾することを可能にします。 2時間後、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより収穫胚。 </li><li>ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10時間ポスト受精（HPF）の後に0.003％の最終濃度にフェニルチオ尿素（PTU）を追加します。 </li></ol>幼虫ゼブラフィッシュ3.エタノール、メトロニダゾール治療と肝再生<ol><li> 1.5％の最終濃度まで胚培地にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。 PTUを追加しないでください。 </li><li> 56〜80 HPFからペトリ皿当たり20ミリリットルのエタノール溶液で胚を扱います。エタノールの蒸発を防ぐためにラップでペトリ皿をカバーしています。 </li><li>ソートアウト[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1。 Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11 </SUP&gt;; Tgは（hand2：EGFP）同様の肝臓サイズとPD24]幼虫、80 HPFで、CFP式によって決定されます。エタノールで処理した幼虫をソートするとき、これは、その後のエタノール/ MTZ処理と高い死亡率の原因となりますので、トリカインを使用しないでください。ペトリ皿当たり30の胚の密度でソートされた幼虫を保管してください。 </li><li> 0.1％DMSO中の胚培地中で新鮮な15mMのMTZを準備します。 1.5％の最終濃度にするMTZ溶液にエタノールを適量加えます。 28℃で24時間、ペトリ皿当たり20ミリリットルのEtOH / MTZ溶液中の幼虫をインキュベートします。光から保護するために、エタノール濃度とアルミホイルでを維持するために、プラスチック製のラップでカバーペトリ皿。 </li><li>治療の終わりに、新鮮胚培地で新しいペトリ皿に幼虫を転送することによってエタノール/ MTZ溶液を除去。胚培地で幼虫を3回洗浄し、PTUなし20ミリリットル胚培地に保管してください。 </li><li>肝細胞のほぼ完全な切除で幼虫を整理するには、蛍光を観察します80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下で。肝臓での最小限のCFPの蛍光と大幅に減少肝体積で成功したアブレーション結果。 </li><li>エタノール/ MTZ-処理した幼虫の死を回避するために、ソートにトリカインを使用しないでください。免疫染色のための幼虫を修正しました（セクション5を参照）、またはさらなる分析のために28℃でペトリ皿に並べ替えられた幼虫を保ちます。 </li></ol>エタノール/ MTZ-処理した幼虫のゼブラフィッシュ4.化学画面<ol><li> DMSO中の10mMに化学銘柄を含む96ウェルプレートを持参℃の冷凍庫から-80（商業化学物質ライブラリーに関する詳細については、物質一覧を参照してください）​​。化学物質の光触媒分解を防ぐためにアルミホイルで覆います。緩やかに揺り動かしながら室温でストック溶液を解凍します。 </li><li>初期秒：96ウェルプレートで、50μMの最終濃度（に胚培地と10mMストック溶液を希釈して薬液を準備creen;再テスト）：1.5ミリリットルチューブインチ対照幼虫を胚培地中のDMSOの同じ濃度で処理しました。 </li><li> 1.5％のEtOH / 15mMのMTZで処理し、96ウェル（初期画面）またはの密度で胚培地を予め充填し、24ウェル（再検査）プレートのどちらかに、前述のように分類したほぼ完全な肝切除と転送幼虫ウェルあたり5幼虫。各化学物質のための二連のウェルを使用してください。 </li><li>胚培地を削除し、各ウェルに250μlの（96ウェルプレート）または500μlの（24ウェルプレート）化学溶液のいずれかを追加します。アルミホイルでカバープレートとは、28℃で50時間、幼虫を扱います。毎日化学浸漬幼虫を点検し、個々のウェルからの任意の死んだ幼虫を削除します。 </li><li>化学的処理の終わりには、80Xの倍率でCFPフィルターと落射蛍光顕微鏡下でCFPを発現する肝細胞の数および/または強度を観察します。写真ライブ幼虫を増強または低下させる示しますD番号および/またはレコードのデジタルカメラでCFPを発現する肝細胞の強度。 </li><li>セクション5で説明したように、共焦点イメージングのためのホルムアルデヒド固定によって幼虫を保持します。 </li><li>初期画面での肝細胞の再生を促進する化学物質を再テストするには、4.1から4.5（「再試験」）に記載されている手順と最も効果的な濃度を見つけるために、より高い及びより低い濃度でその効力を調べます。 </li></ol> 5.幼虫ゼブラフィッシュ固定、免疫染色、および共焦点イメージング<ol><li> 0.02％の最終濃度までトリカインを追加することによって幼虫を麻酔。 1.5mlチューブに10~15幼虫を移し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの1ミリリットルを追加します。 注意：ホルムアルデヒドは炎症を引き起こし、ヒトの発癌物質であることが知られています。化学ドラフト内で取り扱います。 </li><li> WA正しく、次いで溶液を固定捨てます室温でPBSでshが3回。固定された幼虫は、数日間まで4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、速やかに優れた免疫染色の結果が得られます。 </li><li>慎重に実体顕微鏡下で＃55ピンセットを用いて肝臓領域をカバー卵黄と皮膚を取り除きます。 </li><li> 4℃で透過処理し、ブロックバッファ内のブロックの幼虫（4％のウシ血清アルブミン、PBS中の0.3％トリトンX-100）O / N。 </li><li> 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液（PBS中0.3％トリトンX-100）で15分間ずつ5回洗浄します。 </li><li> 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄バッファーで15分間ずつ5回洗浄します。その後、PBSで1回洗浄。 </li><li>静かに左側面を上に向けてガラスピペット、および配向固定幼虫を用いてガラススライドに幼虫を移します。キムワイプを使用して過剰のPBSを削除してください。取り付けメディアのドロップを追加します。マニキュアと、シールカバーガラス。すぐに共焦点イメージングを行うことは大いに推奨されます。 </li><li>画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。 </li></ol>アダルトゼブラフィッシュの6準備<ol><li> [Tgは（fabp10a：CFP-NTR）のセットアップ交配GT1。 Tgは：交配タンク内（Tp1とmCherryを）JH11] 15,17大人のゼブラフィッシュ。収穫は、システムの水に負担し、胚培地で100ミリメートルペトリ皿に胚を転送することにより、翌朝胚。 </li><li>ペトリ皿当たりのない100以上の胚を保管してください。実体顕微鏡下では、ガラスピペットを用いて、未受精卵を削除します。 28℃で胚を成長し、顔料の開発を阻害するために10 HPF後の0.003％の最終濃度にPTUを加えます。 </li><li> 4 DPFでは、幼虫を麻酔し、整理してトリカインを使用して、[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1; Tgは（Tp1の：mCherryを）JH11]幼虫。新鮮胚培地を数回に変更することにより、トリカインを洗浄します。彼らは分18あたり120〜180拍の正常な心拍数を達成するまで、幼虫は28℃で回復させます。 </li><li>標準的な手順19に基づいて、6-12ヶ月齢にソートされた幼虫を上げます。 </li></ol>アダルトゼブラフィッシュ7.エタノール、メトロニダゾール治療、および肝再生<ol><li> 6-12ヶ月齢[Tgは（fabp10a：CFP-NTR）転送GT1を 。 Tgは：ネットを使用して、相手側のタンクへ（Tp1のmCherryを）JH11]大人のゼブラフィッシュ。タンクあたり10個以下の魚の密度で魚を保管してください。 </li><li> 1％の最終濃度になるようにシステム水にエタノールを添加することにより、新鮮なエタノール溶液を調製します。各タンク内の500ミリリットルのEtOH溶液で成魚を治療し、28℃のインキュベーターでそれらを維持します。 </li><li>毎日新鮮なエタノール溶液への転送成魚、廃棄死んだ魚の小道具バイオハザードとしてerly。連続MTZ処理の前に72時間のために動物を扱います。 </li><li> 0.1％DMSO中にシステムの水に新鮮な10 mMのMTZ溶液を調製します。 28℃インキュベーターでMTZソリューションを事前に温めます。 28℃で8時間、1 L交差タンク内の500ミリリットルMTZ溶液で魚を扱い、アルミ箔を使用して、光から保護します。 </li><li>治療中に毎時確認し、すぐに死んだ魚を削除します。バイオハザードとして適切に死んだ魚を捨てます。 MTZ処理の終了時に、二回新鮮なシステムの水に動物を転送することによりMTZを洗い流します。 </li><li>動物は28℃のインキュベーター中で回復し、それらを維持することを可能にします。フィードおよび分析のための時点まで毎日新鮮なシステムの水に魚を移します。 </li></ol> 8.アダルトゼブラフィッシュ肝臓固定、免疫染色、および共焦点イメージング<ol><li> 0.02％トリカインで大人の魚を麻酔し、15分間氷水中で安楽死させます。パット魚ペーパータオル上で乾燥し、解剖マットの上に置きます。 </li><li>以前に20を説明したように皮膚や筋肉を除去することにより、胃腸の臓器を公開します。臀鰭に戻って後方魚の側面に沿って、その後蓋に臀鰭から腹に沿って皮膚とその下の筋肉をカットするはさみを使用し、。 </li><li> 15ミリリットルコニカルチューブに魚を入れ、PBSで1回洗浄。 PBSを削除し、4℃でO / Nを固定するために、PEM緩衝液中に新たに調製した2％のホルムアルデヒドの4ミリリットルを追加します。 </li><li>適切溶液を固定捨て、そして室温でPBSで3回洗浄します。固定したサンプルは、数日間、4℃でPBS中に維持することができます。次のステップに進むには、すぐに優れた免疫染色の結果が得られます。 </li><li>食道を切断することによって、魚の体腔からの肝臓と全体の腸を解剖。セク金型内の低融点アガロース4％と胃腸器官を埋め込みます。 </li><li>前端から出発し、氷冷PBSで50μmの間隔で横断切片にサンプルをカットするためにビブラトームを使用してください。秒の転送＃1ペイントブラシを使用して、PBSで6ウェルプレートにション。 </li><li> 4℃でブロックバッファO / Nでの透過処理およびブロックセクション。 </li><li> 1の希釈でウサギ抗コラーゲンI抗体とインキュベート：ブロック・バッファ・O / Nで100 4℃。洗浄緩衝液で5回、各15分間洗浄します。 </li><li> 1の希釈でのAlexaFluor 647結合ロバ抗ウサギ抗体でインキュベートする：ブロックバッファO / Nで200 4℃。洗浄緩衝液で一度PBSで5回、各15分間洗浄します。 </li><li>静か＃1ペイントブラシを使用してガラススライドにセクションを転送します。キムワイプを使用して過剰のPBSを取り外し、取り付けメディアのドロップを追加し、マニキュアでカバーガラスをシール。共焦点イメージングを行うことは、すぐに非常に示唆されています。 </li><li>画像をキャプチャするために40X / 1.3オイルレンズを搭載した共焦点システムを使用してください。百分の20から50にレーザー強度を使用してください。 1ミクロン間隔でZスタック画像をキャプチャします。 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+school+in+liver+development:+lessons+from+zebrafish.">New school in liver development: lessons from zebrafish.</a> Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).</li><li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish.">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).</li><li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish.">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structure,+enzyme+histochemistry,+and+immunohistochemistry+of+liver+in+zebrafish.">Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).</li><li>Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repopulation+of+the+fibrotic/cirrhotic+rat+liver+by+transplanted+hepatic+stem/progenitor+cells+and+mature+hepatocytes.">Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes.</a> Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

私たちも、私はコラーゲン線維状の型を含むECMタンパク質の実質的な量の存在下では、HPCのが肝細胞として再生するために自分の能力を保持していることを示唆し、エタノール/ MTZ-扱わ回復肝臓におけるHPC媒介肝細胞の再生を観察しました。エタノールのみ処理はHPCの活性化15を誘導しなかったMTZのみ処理は、大幅にECMタンパク質の沈着を増加させませんでした。合わせたエタノール...

肝臓の主要な実質細胞型である肝細胞1、の顕著な再生能力にもかかわらず、慢性肝不全、肝前駆細胞（HPC）依存性再生2につながる、この能力を損ないます。 慢性肝障害は、主にアルコールの乱用、慢性C型肝炎ウイルス（HCV）感染3及び非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）4から誘導されます。それは、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質の蓄積に関連している持続的な肝線維症につながります。永続化ECMの蓄積はその後、高い罹患率と死亡率との肝硬変で、その結果、線維性瘢痕組織5を形成することにより、無傷の肝アーキテクチャを歪めます。多くの試みがprofibrogenicサイトカインおよび活性化筋線維芽細胞6を阻害することに焦点を当て、主に線維化反応を緩和するために行われてきました。後者は主にH（肝星細胞に由来しますSCS）、肝臓の瘢痕形成4に責任原則肝非実質細胞。それにもかかわらず、持続的な線維形成侮辱の存在下で肝細胞を再生成するのHPCを含む内因性の細胞源を刺激する再生治療は、さらなる調査を待ちます。 肝線維症の多くの実験モデルは、哺乳動物において記載されています。四塩化炭素（CCl 4）の繰り返し注射が広くマウスおよびラットモデル7における肝線維症を誘導するために使用されてきました。高脂肪（HF）ダイエットと組み合わせると、アルコールはprofibrogenic遺伝子発現と肝線維症8の実質的なアップレギュレーションにつながりました。脂肪症（脂質蓄積）が急性アルコール暴露から生じるが、それはより重度の肝損傷9に肝臓が受けやすくなります。 ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは、再生を研究するための貴重な脊椎動物モデル系として浮上しています。しかしこのようなイモリやアホロートルなどの他の下等脊椎動物は、再生のための驚くべき能力を持っている、ゼブラフィッシュは、潜在的な回生要因10を操作するために必要な遺伝子操作と可視化戦略に関して、他のモデル系を超える利点を有しています。ゼブラフィッシュは、単にそれらの水エタノール（エタノール）を添加してアルコール性肝疾患（ALD）を研究するための魅力的な脊椎動物モデルを表します。幼虫と大人のゼブラフィッシュへの急性エタノール曝露は、肝臓脂肪症11-13を引き起こしました 。成体ゼブラフィッシュは、拡張エタノール曝露を受けたときに、コラーゲン沈着は、線維症関連遺伝子14のアップレギュレーションを観察しました。ただし、必要が線維形成刺激としてのEtOHに応じて、肝臓の再生を研究するためのモデルを開発するために存在します。 最近、我々はゼブラフィッシュ15におけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルを開発しました。私たちは、幼虫とADULにエタノール治療と肝細胞特異的遺伝子除去システム​​を組み合わせましたトンのゼブラフィッシュ。我々は2つのトランスジェニック系統を生成し、Tgは（fabp10a：CFP-NTR）GT1及びTg（fabp10a：mCherryを-NTR）GT2、 大腸菌ニトロレダクターゼ（NTR）が制御の下で、それぞれシアン、mCherryを蛍光タンパク質に融合されています肝細胞特異的な脂肪酸のタンパク質10aは結合、肝臓基本 （fabp10a）プロモーター。このシステムでは、NTRは、肝細胞の明示的な死を誘導する、DNAストランド間架橋剤16に非毒性のプロドラッグメトロニダゾール（MTZ）に変換します。このモデルを使用して、我々は、Notchシグナル伝達に応答する肝細胞の集団は、肝細胞の近くにない場合およびECMを超える肝細胞に変換することを実証しました。私たちは、HPCのように、これらの細胞を指定しました。さらに、化学画面を、我々は線維症、肝臓における肝細胞の再生を増強する小分子Wntシグナル伝達の活性化剤およびNotchシグナル伝達の阻害剤を同定しました。 Therefo再は、ゼブラフィッシュにおける当社の線維性肝臓モデルは、セルculture-または哺乳動物に基づくスクリーニングシステムと比較して、優れた化学的スクリーニングシステムを表します。これは、かなりの費用と時間節約のメリットとin vivo系です。ここでは、エタノール誘発性線維症肝臓モデルを確立するためのゼブラフィッシュでは、このモデルを用いて化学スクリーンを実行するための詳細な手順を説明します。また、経時的分析は、肝細胞の再生が線維性肝臓で発生方法の検討を行いました。このプロトコルは、線維性肝臓で肝細胞の再生を促進するメカニズムと戦略を研究するための貴重なツールを提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>AC385355000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>MX0075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole (MTZ)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) tablet</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E404</td>
			<td>Dissolve one tablet with 100 ml distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose&#160;</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>BP165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Cell Signaling Compound Library</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>L2100</td>
			<td>10mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ActiProbe-1K Library</td>
			<td>Timtec</td>
			<td>ActiProbe-1K</td>
			<td>10mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 415286</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2729</td>
			<td>Dissolve with DMSO to 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR-99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td>Dissolve with DMSO to 10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab23730</td>
			<td>Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573</td>
			<td>Use at 1:200 for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media (Vectorshield)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>Dumont #55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>75x25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-045</td>
			<td>18 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22305654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1213100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluoresent microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM700</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of an ethanol-induced fibrotic liver model in zebrafish to study progenitor cell-mediated hepatocyte regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

図1は、幼虫のゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発を示しています。 EtOH中にゼブラフィッシュの幼生を露出させるためのプロトコルを最適化するには、まずエタノールの毒性を評価しました。 2.5日 - 受精後（DPF）の幼虫をEtOH濃度1％、1.5％、または同時24時間のエタノール/ MTZ処理に続いて24時間2％を暴露しました。ほぼ...

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Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

development-an-ethanol-induced-fibrotic-liver-model-zebrafish-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.1K ビュー.  Georgia Institute of Technology. Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. 

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Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

発生生物学

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために<em&gt;インビトロ</em&gt;脱落膜化

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell lineages that comprise mature blood. Isolation and identification of these HSPCs is difficult because they are defined ex post facto; they can only be defined after their differentiation into specific cell lineages. Over the past few decades, the zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop ex utero, and by 48 h post-fertilization (hpf) have generated definitive HSPCs. Assays to assess HSPC differentiation and proliferation capabilities have been developed, utilizing transplantation and subsequent reconstitution of the hematopoietic system in addition to visualizing specialized transgenic lines with confocal microscopy. However, these assays are cost prohibitive, technically difficult, and time consuming for many laboratories. Development of an in vitro model to assess HSPCs would be cost effective, quicker, and present fewer difficulties compared to previously described methods, allowing laboratories to quickly assess mutagenesis and drug screens that affect HSPC biology. This novel in vitro assay to assess HSPCs is performed by plating dissociated whole zebrafish embryos and adding exogenous factors that promote only HSPC differentiation and proliferation. Embryos are dissociated into single cells and plated with HSPC-supportive colony stimulating factors that cause them to generate colony forming units (CFUs) that arise from a single progenitor cell. These assays should allow more careful examination of the molecular pathways responsible for HSPC proliferation, differentiation, and regulation, which will allow researchers to understand the underpinnings of vertebrate hematopoiesis and its dysregulation during disease.

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Here, we present a simple method to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in embryonic zebrafish. HSPCs from dissociated zebrafish are plated in methylcellulose with supportive factors, differentiating into mature blood. This allows the detection of blood defects and allows drug screening to be easily conducted.

ゼブラフィッシュ初期胚細胞 (HSPCs) を造血幹・前駆細胞の量的にIn Vitroアッセイの開発

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult liver regeneration after 70% partial hepatectomy results in hepatocyte hypertrophy with some replication in remaining lobes with restoration of metabolic activity, but with permanent loss of the injured lobe&#39;s morphology and architecture. Here, we detail a new surgical method in the neonate that leaves a physiologic environment conducive to regeneration. This model involves amputation of the left lobe apex and a subsequent conservative management regimen, and lacks the necessity for ligation of major liver vessels or chemical injury, leaving a physiologic environment where regeneration may occur. We extend this protocol to amputations on juvenile (P7-14) mice, during which the injured liver transitions from organ regeneration to compensatory growth by hypertrophy. The presented, brief 30 min protocol provides a framework to study the mechanisms of regeneration, its age-associated decline in mammals, and the characterization of putative hepatic stem or progenitors.

Here, we present a new method for partial resection of the left hepatic lobe in neonatal (day 0) mice. This new protocol is suitable for studying acute liver injury and injury response in the neonatal setting.

肺葉切除: 形態学的肝再生手術モデル

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...