この方法は、マクロファージがこの病原体を認識または貪食する場合や食作用方法など、クロストリジウム感染における自然免疫系の役割に関する重要な質問に答えることができます。この方法の主な利点は、多くの異なる嫌気性細菌に適用できること、感染時間を操作できること、および経口投与が正常なヒト感染をはるかに近く表していることである。培養後、培養液を1ミリリットル分光光度計キュベットに移し、OD600を測定する。
最終体積の1ミリリットルで1〜1.2の最終ODに到達するために、必要な量を新鮮な1.5ミリリットルのチューブに移します。1回1ミリリットルの1回PBSで洗浄し、遠心分離機を5,000倍gで室温で3分間洗浄します。1X PBSの1ミリリットルで再中断します。
調製した蛍光染料の3マイクロリットルの作業溶液を1ミリリットルの細菌懸濁液に加える。暗い温度で室温で15分間サンプルをインキュベートします。その後、染色したクロストリダイドを1X PBSで1回洗浄して残留色素を除去し、1ミリリットルの1ミリリットルで再懸濁して1.0のOD600を達成した。
まず、ペトリ皿のゼブラフィッシュの幼虫に0.8%低融解アガロースを置いてカバーします。幼虫を横の位置にそっと調整します。ペトリ皿を氷の上に30〜60秒間置き、低融点アガロースを固めます。
アガロースを覆うために0.02%から0.04%トリケーヌを含む30%ダニアウの培地を追加します。注射液を調製するには、PBS溶液に0.5%フェノールレッドの1マイクロリットルを、色素染色クロストリジオイドジフィシル接種物の9マイクロリットルに添加します。マイクロローダーを使用して、注射液で校正されたマイクロインジェクションニードルをロードします。
装填された針をマイクロマニピュレータに取り付け、ステレオ顕微鏡の下に置きます。600~900ヘクトパスカルの射出圧力を調整します。0.5 ~ 1.0 ナノリットルを得るために、射出時間を 0.1 ~ 0.3 秒に設定します。
マイクロマニピュレーターの針を約45度の角度に設定し、埋め込まれた幼虫に向けます。針の先端を胃腸管の上に置き、泌尿生殖毛の近くに置きます。アガロースを突き抜け、次に針先の筋肉を突き刺す。
次に腸管腔に挿入し、0.5〜1.0ナノリットルのクロストリダイオイドジフィシルを注入する。蛍光顕微鏡を使用して注入された幼虫を監視し、柔軟なマイクロローダーチップを使用して、適切に注入された幼虫を共焦点イメージングに取り上げる。溝のある1.5%のアガロースプレートに、0.8%の低融解アガロースをゼブラフィッシュの幼虫に滴下して覆います。
溝の45度の角度で頭を直立して、溝の壁に尾を向けて幼虫をそっと調整します。アガロースを通して針を穏やかに操作し、ゼブラフィッシュの幼虫の口の中に、食道を通して穏やかに操作します。針の先端が前腸球根の内側に入ったら、注入ペダルを押して0.5~1ナノリットルの細菌培養液を放出します。
腸の内腔を満たす。食道やクロアカからあふれないようにしてください。ゼブラフィッシュの口から針をそっと引き出します。
ガベージに続いて、感染したゼブラフィッシュの幼虫を、最初にアガロースを切り取り、次に幼虫を持ち上げることによって、柔軟なマイクロローダーチップでアガロースから救出する。これらの幼虫を滅菌30%ダニアウの培地に移し、2回すすいでください。ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔した後、麻酔幼虫を覆うために1%低融解アガロースの200〜300マイクロリットルを加えます。
幼虫の感染した領域をガラススライドにできるだけ近づけます。アガロースを氷の上で30〜60秒間固めます。アガロースを0.02%から0.04%トリカインを含む30%ダニアウの培地に沈水する。
共焦点レーザー走査顕微鏡で幼虫の画像化に進みます。感染したゼブラフィッシュの幼虫を安楽死させた後、頭に近いゼブラフィッシュ幼虫の後部トランクに針を挿入してゼブラフィッシュを固定化する。ランセットでエラの後ろの頭を取り除きます。
2本目の針を後尻の幹の中央に挿入します。ゼブラフィッシュの腹部に3本目の針を挿入し、体腔から腸を引き抜きます。マイクロインジェクションニードルを使用して、10~15個の腸を200マイクロリットルの無菌1X PBSを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。
腸を害虫で均質化して組織を破壊し、均質化を準備する。すべての腸を完全に破壊するために、害虫がチューブの底に達することを確認します。ホモジナイトに、D-シクロセリンおよびセフォキシチンを含むクロストリジオイドジフィシレを添加し、タウロコレートの有無にかかわらず、嫌気性チャンバーにインキュベートする。
本研究では、好中球とマクロファージの両方が感染部位に到達する。活性化されたマクロファージ食作用の例は、2つの細菌を貪食し、標識されたクロストリジオイドジフィシルの貪食および消化による消量を示す。蛍光標識クロストリダイドをマクロファージおよび好中球レポーターラインの腸内腔に受精後5日間で拡散させるマイクロガビンジは、クロストリダイドジフィシル感染の自然経路を模倣する。
しかし、好中球およびマクロファージは、微小藻後12時間まで胃腸管への明らかな移動を示さなかった。その間、標識されたクロストリダイオイドス・ディフィシルの蛍光は、マイクロガビン後約5時間後に消失した。感染後24時間の腸管サンプルを解剖し、細菌の増殖を示した。
対照群に細菌は増殖しなかった。後の時点で、インキュベートされたサンプルはTCAを含む培地でのみ成長し、腸内の全クロストリダイオイドジフィシルが胞子を形成していたことを示唆した。16S rDNA PCRは、成長した細菌をクロストリダイオイド・ディフィシルと同定し、約800塩基対の予測可能なサイズの特異的PCRアンプリコンを産生する。
CHROMIDプレート上に成長した細菌培養物は典型的な黒コロニーとして現れ、ゼブラフィッシュ腸からの細菌がクロストリダイオイド・ディフィシルであることをさらに示した。嫌気性細菌を扱うには、好気性のステップは、もちろん細菌の生物学に影響を与えるので、短く保たれている必要があります。ゼブラフィッシュの自然免疫細胞を操作することができます。
例えば、感染に対する自然免疫細胞応答のメカニズムを解読することができる。我々の方法は、ゼブラフィッシュがヒト腸から嫌気病原体を研究するためのツールであり得ることを示した。多耐性病原体を使用するには、適切な安全対策が必要です。
