この作品は、国立心肺血液研究所によってサポートされていましたHL56237、糖尿病および消化器の国立研究所腎臓病研究所DK97391-03、国立科学財団（NSF-1227359およびEPS-1003907）を付与します。

1.マイクロ流体デバイスの製造<ol><li> SU-8 50マスター型の標準的なフォトリソグラフィ製作<ol><li>スピンコーティングする前に、シリコンウエハを清掃してください。 15分間イソプロピルアルコール（IPA）、続いて15分間アセトンで裸の2インチのシリコンウエハをすすぎます。 1時間150℃のホットプレート上に配置することによって、ウエハを脱水。脱水後、室温でウエハを冷却します。 </li><li> SU-8フォトレジストをシリコンウェハをコートをスピン。ウェハ上に2ミリリットルSU-8フォトレジストを追加します。 30秒毎分300回転/秒の加速度で1000rpmで、続いて10秒間100回転/秒の加速で500回転にウェハをランプアップします。 （補足ビデオ1を参照してください） </li><li>プリベーク30分間、95℃で10分間、次いで、ソフトベーク65℃のホットプレート上のウエハ。 </li><li>スピンコートされたフォトレジストにフィルムマスクから設計パターンを変換するためにUV露光を使用してください。フィルムマスクのような薄い透明フィルム上にパターンを印刷します。の上にフィルムマスクを配置フォトレジストをコーティングし、スピンとを300mJ / cm 2の線量でUVにさらします。 （補足動画2を参照してください） 注：このプロトコルでは、マイクロチャネルネットワークのパターン（4幅100μmの娘チャネルに分岐する159ミクロン幅の広い母チャンネル）は、CADソフトウェアで設計されています。フィルム上のパターンは、クリアフィールドとして表示され、フィルムの残りはブラックインクで覆われています。 SU-8ネガ型フォトレジストであるため、UVに曝露されるフォトレジストの部分が架橋され、​​金型の開発（ステップ1.1.6）中の溶剤に不溶となるであろう。現像後、この不溶部分が設計されたネットワークのパターンを複製し、マスターモールドとしての役割を果たす。 </li><li>ポストベーク1分、10分後、95℃で65℃のホットプレート上で露光されたウエハ。 </li><li>マスターモールドを開発します。使用未架橋フォトレジストを除去するための溶媒としてのSU-8の開発者。 3分間のSU-8現像液にウェハを浸し、IPAですすぎます1分間。 </li><li> IPAリンス後には白スジの形成（非硬化フォトレジストの残留物）が存在しなくなるまで、この開発サイクルを2-3回繰り返します。静かに窒素ガスでウエハを乾燥し、顕微鏡下でのパターンの小さな特徴を調べます。必要に応じて追加の開発サイクルを繰り返します。 </li><li>ハード15分間、150℃のホットプレート上でウェーハを焼きます。 </li></ol></li><li>ソフトリソグラフィー<ol><li>手動重量で2部のポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー（ベースと硬化剤）を混ぜます。 10：1の比。 </li><li>脱ガス15分間ハウスバキュームに接続されたデシケーターとPDMS混合物。フォトレジストマスターモールドにPDMSソリューションをキャストします。 PDMSの厚さは、入口/出口管の安定した保持を提供するために、3 mm以上である必要があります。 15分間、再び脱ガスPDMS、および必要に応じて窒素ガスで残りの気泡を除去。 3時間65℃のオーブンでキャストPDMSを治します。 </li><li>の表面を清掃してくださいスコッチテープとプラズマクリーナー（30秒プラズマ処理）を有するガラスカバースリップ。 30秒間500回転/秒の加速レートで4,000 rpmのにランピングすることにより、カバーガラス上にスピンコート未硬化PDMS（0.5ミリリットル）。少なくとも30分間、65℃のオーブン中でPDMSをスピンコートしたカバースリップを硬化させます。 </li><li>カットし、マスターモールドから硬化PDMSをリリース。次に母チャンネルの先端に直径1mmの穴パンチャーを有する入口および出口を作成します。 </li><li> PDMSスピンコートしたカバーガラスにデバイスを結合。 1分間のプラズマクリーナーとPDMSとカバーガラスの表面を酸化させます。酸素プラズマ処理後、接合面での脱イオン水（DI水）の液滴を配置し、2つの部品を配置します。永久的な結合を達成するために30分間65℃のオーブンでデバイスを焼きます。 </li></ol></li></ol><img alt="補足ビデオ1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">補足ビデオ1（右クリックしてダウンロード）。</a> <img alt="補足動画2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">補足動画2（右クリックしてダウンロード）。</a> 2.内皮細胞播種と文化<ol><li>デバイス滅菌およびフィブロネクチンコーティング<ol><li>酸化からの入口/出口の周りにPDMS表面の疎水性を保持します。酸化を防止するために、スコッチテープの小さなストライプと入口と出口の周りにPDMSの表面を覆います。この手順では、充填工程（2.1.3）の間に、すべてのデバイスの上面の上に広がるのDI水を防止することができます。 </li><li>酸素プラズマFOとPDMS装置を扱いますR 5分では、このように、表面が親水性に変化するマイクロチャネルを通る流体の流れを促進し、充填手順（2.1.3）に捕捉気泡を防止します。 </li><li>入口からDI水でデバイスを埋めるために取り付けられた針またはピペットで注射器のいずれかを使用してください。出口に蓄積されたDI水（30-50μL）の液滴があるまで充填を続けます。マイクロチャネル内に閉じ込められた気泡があるかどうかを確認するために、顕微鏡下でデバイスを調べます。ティッシュペーパーとの入口と出口での過度の水滴を除去します。 </li><li>層流バイオセーフティフード内で3時間の最小値のためのUVとペトリ皿の中でデバイスを滅菌します。 、蒸発を防ぐPDMSの薄片と入口/出口をカバーするには、皿の内側に濡れたティッシュペーパーを入れ、パラフィルムで皿を包みます。 </li><li>コー​​トフィブロネクチンを持つデバイス。 （冷蔵庫に/ mlのフィブロネクチンで一晩100μgので被覆次いで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で最初にデバイスをリンス4°C）。入口で溶液の液滴を配置し、その後、ハウス真空、針またはピペットで注射器と出口で負圧を作成します。 </li><li>細胞培養培地でデバイスを記入してください。細胞培養培地をロードする前に3回手動でPBSでデバイスを洗浄します。 37℃のインキュベーター内でデバイスをウォームアップ。 </li></ol></li><li> ECの播種および長期灌流 注：従来の静的な2DのEC文化と比較すると、連続灌流を用いたin vitro微小血管ネットワークモデルは、より近いin vivoの条件に細胞培養環境を作りました。このプロトコルで実証インビトロ微小血管ネットワークは二週間まで維持することができます。十分に制御された灌流は、連続的に、栄養素を補給廃棄物を削除して、過合流EC単層の防ぐことができます。したがって、異なるphysiologica下で細胞および血行力学環境​​を模倣し、長期の研究に拡張することができますリットルおよび病理学的条件。 <ol><li> 8％のデキストラン（モル重量7万）でHUVEC培地中の一次のHUVEC（MCDB 131）を混合します。デキストランは、ローディング媒体の粘度を増加させ、より良い細胞播種の結果を達成するために使用されます。推奨される細胞密度は、約2~4×10 6細胞/ mlです。 </li><li>デバイスに細胞を播種します。入口の上に細胞の10-20μlの液滴を配置します。出口でのガラスパスツールピペットを使用して、デバイス、または毛細管作用を傾けることのいずれかによって穏やかな流れを導入します。成功したセルの負荷のための鍵は、最小のチャネル内の流速1mm未満/秒を制御することです。 </li><li>細胞播種を確認してください。最初の播種後、顕微鏡下で播種の状態をチェックする前に、（37℃、5％CO 2の加湿雰囲気下）、15〜20分間デバイスをインキュベートします。必要であれば、所望の細胞密度を達成するために追加のセル負荷を行います。 </li><li>穏やかに37（細胞培養培地でデバイスをリンス°C）は、デキストランを除去しました。文化（37℃、5％のCO 2）インキュベーターの最初の6時間の流れの不在下での装置。 </li><li>長期灌流用チューブの接続を設定します。移動を防止するためにペトリ皿にデバイスをテープ。入口と出口のチューブ挿入用のシャーレのふたに小さな穴を作成します。細胞培養培地灌流用の針で注射器に入口チューブを接続します。ごみ収集作業員への出口チューブを接続します。 インキュベーターの外に灌流ポンプを配置しながら、細胞培養インキュベーターに入れ、デバイスと廃棄物の収集をし、長い入口チューブにより、デバイスとそれを接続します。注意して​​ください。灌流速度は、実験設計によって決定されます。本発明の装置では、0.35マイクロリットル/分の灌流速度と1-2ダイン/ cm 2の間のせん断応力範囲を使用しています。この灌流条件では、HUVECを約3-4日でコンフルエンスに達します。 </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent染色<ol><li>室温で15分間すすぎ、そして30分間ブロッキングの1％BSA PBSを1倍、続いて4℃で30分間、2％パラホルムアルデヒドの灌流によってデバイスでのECを修正しました。細胞培養に用いたものと同じである灌流速度を使用します。 </li><li> 0.1％トリトンX-100抗体染色のために固定された電気部品を透過。 VEカドヘリンをラベルに5-7分間トリトンでデバイスを灌流し、ラベルF-アクチンへ3分。 </li><li>デバイスに抗体をロードします。従来のソリューションを洗い流すために15分間、1×PBSでデバイスを灌流。手動での2μg/ mlの（総容量は20-50μlである）の濃度で、デバイスへのVEカドヘリン（抗ヤギ）に対する一次抗体をロードします。 4°Cで一晩冷蔵庫にデバイスを保管してください。 45〜60分間7μgの/ mlの濃度でシリンジポンプによって二次抗体（ロバ抗ヤギ）を灌流。 </li><li>ファロイジンでEC F-アクチンにラベルを付けます。 1×PBS FOでデバイスを灌流手動で7-10分間ファロイジン（10μg/ ml）をロードする前に、R 15分。 </li><li>ラベルEC核は（材料リストを参照してください）​​。 </li><li> 1×PBSでデバイスをすすぎ、およびイメージングするまで4℃でそれを維持します。 </li></ol>内皮の4蛍光イメージングの[Ca 2+] i の <ol><li>アルブミン（10 mg / mlで）37℃で15分間-Ringer溶液でデバイスを灌流。細胞培養に用いたのと同じ灌流速度を使用します。アルブミン-リンゲル液のすべての成分の濃度は、 物質一覧に記載されています。 </li><li> ECのための共焦点システムのfluo-4 AMでの[Ca 2+] i のイメージングを設定します。 Ca 2+イメージングのための共焦点顕微鏡システムを使用してください。励起用アルゴンレーザー（488 nm）を使用し、510〜530 nmのように発光帯を設定します。 512×512走査フォーマットで：25X目標（0.95水浸、NA）を使用して画像を収集します。私の各スタックのための2ミクロンのzステップとスキャン間隔を使用します20秒の魔術師。 </li><li>アルブミン - リンゲル液とルーメンのfluo-4 AMを洗い流した後、37℃で40分間のfluo-4 AM（5μM）を持つデバイスを灌流。 </li><li>フルオ4ロードされた微小血管の画像を取得します。 10分間のベースラインの画像を収集します。 ATP（10μM）でデバイスを灌流し、20分間の蛍光強度（FI）の変更を記録。 </li></ol>一酸化窒素生産の5蛍光イメージング<ol><li> 15分間のアルブミン - リンゲル液でデバイスを灌流。細胞培養に用いたものと同じである灌流速度を使用します。 </li><li> ATP誘導性の一酸化窒素産生を測定するための蛍光イメージングシステムをセットアップします。 12ビットのデジタルCCDカメラと一酸化窒素測定のためのコンピュータ制御シャッターを備えた顕微鏡を使用します。光源として75 Wキセノンランプを使用してください。 注：干渉フィルタ（40分の480 nm）をダイクロイックミラーによってDAF-2 DA用の励起および発光波長を選択バンドパス障壁と（505 nm）を（50分の535 nm）で。画像を収集するために：20X対物レンズ（NA0.75）を使用してください。光退色最小限に抑えるために、干渉フィルタの前に中性濃度フィルタ（0.5 N）を位置決めし、0.12秒の露光時間を制限します。 </li><li> DAF-2 DA（5μM）で細胞をロードします。 37℃で約35-40分間、DAF-2 DAを持つデバイスを灌流。最初のロード後にDAF-2の蛍光強度（FI DAF）のベースラインを記録します。 注：DAF-2 DAは実験7を通して灌流液で連続的に存在しています。 </li><li> DAF-2画像を収集します。 5分間FI DAFのベースラインを記録します。 ATP（10μM）でデバイスを灌流し、1分間隔で30分間の画像を収集。同じ焦点面に細胞の同一グループからのすべての画像を収集します。 </li></ol> 6.データ解析<ol><li>手動で個々の細胞レベルで収集した画像からの利益（ROIを）の地域を選択します。各ROIは、蛍光輪郭によって示すことができる一つの個別のセルの面積をカバーします。 </li><li>バックグラウンド蛍光を減算し、各ROIの平均FIを計算します。 </li><li> ECにおけるATP誘導性の変化を測定した[Ca 2+] iとNO産生。 （FI 0アルブミン -リンガー灌流中の平均ベースラインFIは、ATPを添加する前に、あるFI / FI 0 * 100）のFluo-4 FIの変化を計算することにより、ECの[Ca 2+] i の中のATP誘導性の変化を定量化マイナス測定バックグラウンド。経時FI DAFの第一の差動変換を行うことにより、NO産生量を定量化しません。 注：FI DAFの時間経過は、時間とともに累積NO産生を表します。したがって、NO産生率は、基礎とATPが条件刺激の両方の下でFI DAFのプロファイルに基づいて計算されていません。データ分析及び実験手順の詳細は、以前の刊行物7に記載されています。 </li></ol>

<ol>
	<li>Curry, F. R. E., Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+modulation+at+the+cell,+microvessel,+or+whole+organ+level:+towards+closing+gaps+in+our+knowledge.">Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge.</a> Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).</li><li>Michel, C. C., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+permeability.">Microvascular permeability.</a> Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).</li><li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+soft+lithography.">Recent progress in soft lithography.</a> Mater Today. 8, 50-56 (2005).</li><li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research.">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507, 181-189 (2014).</li><li>Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+recapitulation+of+functional+microvessels+for+the+study+of+endothelial+shear+response,+nitric+oxide+and+[Ca2+]I.">In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I.</a> PLoS One. 10, 0126797 (2015).</li><li>He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytoplasmic+calcium+in+single+microvessels+with+increased+permeability.">Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability.</a> Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+intracellular+nitric+oxide+in+intact+microvessels+using+4,5-diaminofluorescein+diacetate.">Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate.</a> Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).</li><li>Yuan, D., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+alters+adhesion+protein+and+cytoskeleton+reactions+to+inflammatory+stimuli+resulting+in+enhanced+permeability+increases+in+rat+venules.">Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules.</a> Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).</li><li>He, P., Zhang, X., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++entry+through+conductive+pathway+modulates+receptor-mediated+increase+in+microvessel+permeability.">Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+[Ca2+]i+and+caveolin-1+antagonistically+regulate+eNOS+activity+and+microvessel+permeability+in+rat+venules.">Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules.</a> Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).</li><li>Zhu, L., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-activating+factor+increases+endothelial+[Ca2+]+i+and+NO+production+in+individually+perfused+intact+microvessels.">Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels.</a> Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization+modulates+endothelial+cell+calcium+influx+and+microvessel+permeability.">Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+hyperpolarization+increases+[Ca2+]i+and+venular+microvessel+permeability.">Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability.</a> J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).</li><li>Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+scaffolding+domain+promotes+leukocyte+adhesion+by+reduced+basal+endothelial+nitric+oxide-mediated+ICAM-1+phosphorylation+in+rat+mesenteric+venules.">Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).</li><li>Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Mediated+Elevated+Intracellular+Calcium+and+Angiogenesis+in+Human+Microvascular+Endothelial+Cells+In+Vitro+are+Inhibited+by+Dominant+Negative+TRPC6.">VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6.</a> Microcirculation. 15, 605-614 (2008).</li><li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology.">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).</li><li>D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+monitoring+of+ATP-stimulated,+endothelium-derived+nitric+oxide+production+in+channels+of+a+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+device.">Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device.</a> Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).</li><li>Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-induced+endothelial+NO+production+contributes+to+vascular+cell+apoptosis+and+increased+permeability+in+rat+venules.">H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules.</a> Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).</li><li>Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+microbioreactor+array+for+quantitative+cell+biology.">Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.</a> Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).</li><li>Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angioadaptation:+Keeping+the+Vascular+System+in+Shape.">Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape.</a> Physiology. 17, 197-201 (2002).</li><li>Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+blood+rheological+parameters+in+the+microvasculature+of+cat+mesentery.">The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery.</a> Circulation Research. 43, 738-749 (1978).</li><li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion.">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).</li><li>McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+flow+behavior+in+a+parallel+plate+flow+chamber+:+alters+endothelial+cell+responses.">Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses.</a> Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).</li><li>Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+venular+microvessel+permeability+by+calcium+influx+into+endothelial+cells.">Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells.</a> FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).</li><li>Kojima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+imaging+of+nitric+oxide+with+novel+fluorescent+indicators:+diaminofluoresceins.">Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins.</a> Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

著者らは、開示することは一切競合する利益や利害を持っていません。

<html>この記事では、の[Ca 2+] iおよびNO産生が、マイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管ネットワーク、ECジャンクションおよび細胞骨格F-アクチン分布の特徴付け、およびECの定量的測定の開発のための詳細なプロトコルを提示します。灌流マイクロ流体デバイスは、生体内微小血管の形状とせん断流動条件の近いシミュレーションを可能にするin vitroモデル?...

インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型1,2を示しています。マイクロフルイディクス技術は、所望の流れ条件の下で成長し、特に血管のECのために、培養細胞のための機会を提供する幾何学的に拘束されたマイクロスケール（サブミリメートル）チャネル3を介して正確に制御された流体を可能にします。これらの機能は、従来の静的な2D細胞培養物よりもin vivoでの細胞培養条件近づけます。彼らは、マイクロ流体デバイスは、血管系の種類をモデル化するために使用され、機械的および/または化学的な刺激に対するEC応答を研究する際に非常に重要です。 静的な細胞培養、生物医学Fにおける適応とマイクロフルイディクスのアプリケーションの上にマイクロチャネルネットワークによって実証利点にもかかわらずieldは限られたままです。最近のレビューによって報告された、この分野（85％）の出版物の大半は、エンジニアリングジャーナル4に残っています。マイクロ流体デバイスの性能は、ほとんどの生物学者は、このようなトランスウェルアッセイおよびこの小型化されたデバイスへのマクロスケール培養皿/ガラススライドのような現在の技術からスイッチするための十分な説得力はなかったです。マイクロフルイディクスは、前方にこのフィールドを移動するには学際的なコラボレーションを必要とする学際的なフィールドです。この技術的な記事の目的は、生物学的なアプリケーションおよびマイクロ流体微小血管の機能的検証を提供しながら、専門分野間の知識のギャップを減らし、生物学者によって製造手順が理解できるようにすることです。可視化実験プロトコルは、マイクロ流体デバイスとエンジニアと生物学者の間で緊密な連携を表し、それらの生物学的ユーティリティ、両方の製造を含みます。 我々は最近、いくつかの報告しましたマイクロ流体素子5でのin vitro微小血管ネットワークを使用して生物学的用途。適切マイクロチャネルネットワークの寸法を設計し、所望のせん断応力を適用するためには、数値モデルは密接に流れプロファイルを推定する計算流体力学ソフトウェアで構築されました。 すなわちコンフルエンスに達したマイクロチャンネル中に播種した一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、連続灌流で3~4日で、マイクロチャネルの全内面を覆っ。適切なバリアの形成はVE-カドヘリン染色によって実証および静的細胞培養条件下で無傷の微小血管内に形成されたものと比較しました。個別に灌流し、無傷の微小血管6-8で開発された実験プロトコルを適用することにより、我々は定量的に蛍光とアデノシン三リン酸（ATP）に応答して、ECの変化の[Ca 2+] iおよび一酸化窒素（NO）の産生を測定しましたdicators共焦点と従来の蛍光顕微鏡。 ECにおけるアゴニスト誘導増加は、の[Ca 2+] iおよびNO産生は、微小血管の透過性6-15における炎症性メディエータによって誘発される増加のために必要な細胞内シグナルとして報告されています。いくつかの以前の研究は、DAF-2 DAロードマイクロ流体デバイス16,17の画像を示したが、適切な解像度およびデータ分析はまだ18を達成していませんでした。我々の知る限りでは、この研究は、内皮におけるアゴニスト誘導性の動的変化の[Ca 2+] iとNO産生利用マイクロ流体ベースのシステムの最初の定量的測定を示しています。 微細加工技術は、ダウンして数ミクロンのマイクロチャネルを作製し、in vivoでの微小血管系の幾何学的構造を模倣するために複雑なパターンの開発を可能にする柔軟性を持っています。ここでは、分岐、3つのレベルを持つ典型的なマイクロチャネルネットワークを提示しました。このネットワークは、微細加工クリーンルーム及びソフトリソグラフィーで行われるフォトリソグラフィ技術の組合せによって製造されます。

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Brain Extract (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (nuclei staining)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffered Saline Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE microbore tubing, 0.012&quot; ID x 0.030&quot; OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithography bench</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &amp;amp; Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Shutter for the CCD camera</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simulation software</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Images acquire and analyse for NO production&amp;nbsp;</td><td>Universal Imaging</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型を示しています。マイクロ流体デバイスの開発は、二十年以上のエンジニアに受け入れてきたが、それらの生物学的用途が限定されたまま。より生理学的に関連する生物学的用途によって検証試験管内微小血管モデル内のフィールドを進め、in vivoでおよびin vitroの研究で間のギャップを埋めることが重要です。ここで、我々は長期的な灌流能力を備えたマイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管網の開発のための詳細な手順を提示します。また、共焦点と従来の蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムでECの[Ca 2+] iおよび一酸化窒素（NO）の生産におけるアゴニスト誘発変化の定量的測定のためのアプリケーションを示しています。形成された微小血管ネット連続灌流との仕事は、ECの間でよく発達した接合部を示しました。 VEカドヘリン分布を静的培養EC単層よりも無傷の微小血管で観察されたものと近かったです。 EC過渡増加するATP誘発性の[Ca 2+] iとNO産生を定量的培養微小血管の機能性を検証し、個々の細胞レベルで測定しました。このマイクロ流体デバイスは、電気部品が近いin vivoでの従来の静的な2D培養に比べ細胞培養環境を作るよく制御され、生理学的に関連する流れ、下に成長することができます。マイクロチャンネルネットワーク設計は、非常に汎用性があり、製造プロセスが簡単で、再現性があります。デバイスは、容易に高解像度の画像化を可能にする共焦点又は従来の顕微鏡システムに一体化することができます。培養された微小血管ネットワークが初代ヒトのECにより形成することができるので、最も重要なのは、このアプローチはどのように調査するために有用なツールとして機能します病理学的に患者サンプルから変更された血液成分は人間のECに影響を与え、臨床問題への洞察を提供します。それはまた、薬物スクリーニングのためのプラットフォームとして開発することができます。

このセクションでは、このプロトコルを使用して開発した培養微小血管網で得られた結果の一部を示しています。マイクロチャネルのパターンは、3レベルの分岐ネットワーク（ 図1A）です。この設計では、4幅100μm娘チャネルに再び2 126ミクロン幅チャネル、および支店に159μmの広い母のチャネルブランチ。 3次元数値シミュレーションは、このマイクロ?...

Watch this Scientific Journal Video about Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production at JoVE.com

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

の開発と特性評価<em&gt;インビトロ</em&gt;微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt;私</sub&gt;と一酸化窒素の生産

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.5K ビュー.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

ビデオ: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

生物工学

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

アン<em&gt; ex vivoで</em&gt;メソッド培養ラット腸間膜微小血管ネットワークのタイムラプスイメージングのための

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

発生生物学

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナ ミックスを定量化します。

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

hiPSC由来内皮細胞の分化と機械的刺激

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

著者スポットライト:流体媒介性機械的刺激下で培養されたhiPSC由来内皮細胞の研究 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

の開発と特性評価

要約

さらに動画を探す

この動画の章

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

アン

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナミックスを定量化します。

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

微細と3D微小血管の組立

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ

の開発と特性評価

要約

さらに動画を探す

この動画の章

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

アン

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナ ミックスを定量化します。

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

微細と3D微小血管の組立

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ

血管の運動論的解析血管発生と血管新生の in Vitroのダイナミックスを定量化します。

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

イン・ビトロ発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル