Diese Arbeit wurde von National Heart, Lung unterstützt, and Blood Institute gewährt HL56237, National Institute of Diabetes und Magen-Darm-und Nierenerkrankungen Institut DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 und EPS-1.003.907).

1. Mikrofluidikvorrichtung Fabrication <ol><li> Standard-Lithografie Herstellung eines SU-8 50 Master-Mold <ol><li> Reinigen Sie den Siliziumwafer vor Spin-Coating. Spülen mit einem nackten 2 inch Siliciumwafer mit Aceton für 15 min, gefolgt von Isopropylalkohol (IPA) für 15 min. Dehydratisieren des Wafers, indem es auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 1 Stunde platziert. Nach der Dehydratisierung, Abkühlen des Wafers bei Raumtemperatur. </li><li> Spin-Beschichtung der Silizium-Wafer mit SU-8 Photoresist. 2 ml SU-8 Photoresist auf dem Wafer. Rampe des Wafers auf 500 Upm bei 100 rpm / sec Beschleunigung für 10 sec, gefolgt von 1000 Umdrehungen pro Minute bei 300 rpm / sec Beschleunigung für 30 sec. (Siehe Zusatz Video 1) </li><li> Pre-Bake-Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 10 min, dann weich backen bei 95 ° C für 30 min. </li><li> Verwenden UV-Belichtung die entworfenen Muster von einer Filmmaske auf den Photoresist schleuderbeschichtet, zu transformieren. Drucken Sie das Muster auf einem dünnen transparenten Film als Filmmaske. Legen Sie den Film Maske oben auf derschleuderbeschichtet Photoresist und belichten mit einer Dosis von 300 mJ / cm 2 bis UV - Licht. (Siehe Zusatz Video 2) Hinweis: In diesem Protokoll, das Mikrokanalnetzmuster (159 &amp; mgr; m breite Mutter Kanäle in vier 100 &amp; mgr; m breit Tochter Kanäle Verzweigung) wird mit CAD-Software entwickelt. Das Muster auf dem Film zeigt, als ein klares Feld und der Rest des Films wird durch schwarze Tinte bedeckt. Weil SU8 ein negativer Photoresist ist, der Teil des Photolacks, die UV ausgesetzt wird, vernetzt sein und während der Entwicklung der Form (Schritt 1.1.6) zu dem Lösungsmittel unlöslich werden. Nach der Entwicklung wird das unlösliche Teil des entworfen Netzmuster replizieren und dienen als Masterform. </li><li> Post-Bake der belichtete Wafer auf einer Heizplatte bei 65 ° C für 1 min, dann 95 ° C für 10 min. </li><li> Entwickeln Sie die Urform. Verwenden SU-8-Entwickler als Lösungsmittel das unvernetzte Photoresist zu entfernen. Tauchen Sie die Wafer in SU-8-Entwickler für 3 min und Spülen mit IPAfür 1 min. </li><li> Wiederholen Sie diesen Entwicklungszyklus 2-3 mal, bis es keine weiße Streifenbildung (Rückstand von nicht ausgehärteten Photoresist) ist nach der IPA-Spülung. Trocknen Sie vorsichtig den Wafer mit Stickstoffgas und untersuchen die kleinen Merkmale des Musters unter einem Mikroskop. Wiederholen Sie zusätzliche Entwicklungszyklen, wenn nötig. </li><li> Hartbacken des Wafers auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 15 min. </li></ol></li><li> Weich-Lithographie <ol><li> mischen Sie manuell die beiden Teile (Basis und Härter) von Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomer bei einem Gew. Verhältnis von 10: 1. </li><li> De-Gas die PDMS-Mischung mit einem Exsikkator mit einem Hausvakuum für 15 Minuten verbunden. Cast der PDMS-Lösung auf dem Photoresist-Vorlagenform. Die Dicke des PDMS muss mehr als 3 mm sein, um eine stabile Halterung des Einlass- / Auslass-Rohrleitung zu schaffen. De-Gas das PDMS wieder für 15 Minuten, und entfernen Sie die verbleibenden Luftblasen mit Stickstoffgas, wenn nötig. Härten des gegossenen PDMS in einem Ofen bei 65 ° C für 3 Stunden. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche vondas Deckglas mit einem Klebeband und einem Plasma-Reiniger (30 sec Plasmabehandlung). Spin-coat ungehärteten PDMS (0,5 ml) auf das Deckglas von 30 s bei 500 rpm / sec Beschleunigungsrate bis 4000 rpm ramping. Härten des PDMS schleuderbeschichtet Deckglas in einem Ofen bei 65 ° C für mindestens 30 min. </li><li> Schneiden Sie und lassen Sie die gehärtete PDMS aus der Urform. Dann einen Einlass schaffen und einen Auslass mit einem Durchmesser von 1 mm Lochers am distalen Ende der Mutter Kanäle. </li><li> Bond das Gerät mit dem PDMS durch Spin-Coating Deckglas. Oxidieren der Oberflächen der PDMS und mit einem Plasmareiniger für 1 min Deckglas. Nach der Plasmabehandlung Sauerstoff, stellen ein Tröpfchen entionisiertes Wasser (DI-Wasser) an der Verbindungsfläche, und legen die beiden Teile zusammen. Backen der Vorrichtung in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min eine dauerhafte Bindung zu erreichen. </li></ol></li></ol><img alt="Supplemental Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Supplemental Video 1 (Rechtsklick zum Download).</a> <img alt="Supplemental Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Supplemental Video 2 (Rechtsklick zum Download).</a> 2. Endothelzell Säen und Kultur <ol><li> Vorrichtung Sterilisation und Fibronectin Coating <ol><li> Erhalten, die die hydrophobe Eigenschaft der PDMS-Oberfläche um den Einlass / Auslass von Oxidation. Decken Sie die PDMS-Oberfläche um den Einlass und Auslass mit kleinen Streifen Klebeband auf die Oxidation zu verhindern. Dieses Verfahren kann DI-Wasser verhindern, dass überall auf der Oberseite des Gerätes während des Befüllungsschritt (2.1.3) zu verbreiten. </li><li> Behandeln Sie die PDMS-Gerät mit Sauerstoffplasma for 5 min die Oberfläche hydrophil zu ändern ist, wodurch eine Fluidströmung durch den Mikrokanal zu erleichtern und die Blase zu verhindern in dem Füllvorgang Trapping (2.1.3). </li><li> Verwenden Sie entweder eine Spritze mit einer Nadel befestigt oder einer Pipette das Gerät mit DI-Wasser von dem Einlass zu füllen. Weiterhin die Füllung bis ein Tröpfchen aus DI Wasser (30-50 ul) am Auslass angesammelt. Untersuchen Sie das Gerät unter einem Mikroskop zu prüfen, ob Blasen im Inneren der Mikrokanal gefangen sind. Entfernen Sie die überschüssige Wassertropfen am Einlass und Auslass mit einem Papiertuch. </li><li> Sterilisieren der Vorrichtung in einer Petrischale mit UV für mindestens 3 Stunden in einer laminaren Biosicherheit Haube. Um zu verhindern, Verdunstung, decken Sie den Einlass / Auslass mit einem dünnen Stück PDMS, legte ein nasses Papiertuch in der Schale, und wickeln Sie die Schale mit Parafilm. </li><li> Coat das Gerät mit Fibronektin. Spülen Sie das Gerät zunächst mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), dann streicht es mit 100 ug / ml Fibronektin über Nacht im Kühlschrank (4 ° C). Platzieren eines Tropfens der Lösung am Einlaß, und dann ein Unterdruck an dem Auslass mit einem Hausvakuum erzeugen, eine Spritze mit einer Nadel oder einer Pipette. </li><li> Füllen Sie das Gerät mit Zellkulturmedien. Spülen Sie das Gerät mit PBS manuell für 3-mal, bevor die Zellkulturmedien zu laden. Wärmen Sie das Gerät in einem Inkubator bei 37 ° C. </li></ol></li><li> ECs Säen und Langzeit Perfusions Hinweis: Im Vergleich mit konventionellen statischen 2D - EC - Kultur, die in - vitro - microvessel Netzwerk - Modell mit kontinuierlicher Perfusion machte die Zellkulturumgebung näher an den in - vivo - Bedingungen. Die in vitro microvessel Netzwerk in diesem Protokoll demonstriert können bis zu zwei Wochen aufrechterhalten werden. Die gut kontrollierte Perfusion werden Nährstoffe kontinuierlich ergänzen, entfernen Abfälle und Über Einmündung der EG einschichtigen verhindern. Daher kann es zu einer längerfristigen Untersuchungen erweitert werden, um die zellulären und hämodynamischen Umgebung unter verschiedenen PHYSIOLOGISCHER nachahmtl und pathologischen Bedingungen. <ol><li> Mischen Sie primäre HUVECs in HUVEC Kulturmedien (MCDB 131) mit 8% Dextran (Molekulargewicht 70.000). Das Dextran wird verwendet, um die Viskosität der Lade Medien zu erhöhen und eine bessere Zellaussaat Ergebnis erzielen. Die empfohlene Zelldichte beträgt etwa 2-4 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Seed die Zellen in das Gerät. Legen Sie eine 10-20 ul Tröpfchen von Zellen über den Einlass. Einführung einer sanften Strömung entweder durch Kippen des Geräts oder Kapillarwirkung unter Verwendung einer Glaspasteurpipette am Ausgang. Der Schlüssel für eine erfolgreiche Zellenbelastung wird die Strömungsgeschwindigkeit kleiner als 1 mm / sec innerhalb der kleinsten Kanäle zu steuern. </li><li> Überprüfen Sie die Zellaussaat. Nach dem anfänglichen Aussäen bebrüten das Gerät für 15-20 min (befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C) , bevor die Aussaat Status unter dem Mikroskop zu prüfen. Falls erforderlich, zusätzliche Zelle Laden eines gewünschten Zelldichte zu erreichen. </li><li> Spülen Sie vorsichtig das Gerät mit Zellkulturmedium (37° C), um das Dextran zu entfernen. Kultur die Vorrichtung in Abwesenheit von Strömung für die ersten 6 Stunden in einem Inkubator (5% CO 2 bei 37 ° C). </li><li> Stellen Sie die Schlauchverbindung für die Langzeit Perfusion auf. Band das Gerät in eine Petrischale Bewegung zu verhindern. Erstellen kleine Löcher auf dem Deckel der Petrischale für Ein- und Auslaufschlauch Einfügungen. Verbinden der Einlassleitung an einer Spritze mit einer Nadel für den Zellkulturmedien Perfusion. Schließen Sie den Ablaufschlauch an einen Abfallsammler. Hinweis: Stellen Sie das Gerät und den Abfallsammler in einer Zellkultur-Inkubator, während eine Perfusions-Pumpe außerhalb des Inkubators platzieren und verbinden Sie es mit dem Gerät durch den langen Zulaufschlauch. Die Perfusionsrate wird durch die Versuchsanordnung bestimmt. In der vorliegenden Vorrichtung verwenden , um eine Perfusion Rate von 0,35 ml / min und einer Scherspannungsbereich zwischen 1-2 dyn / cm 2. Unter dieser Bedingung Perfusion erreichen die HUVECs Einmündung in etwa 3-4 Tage. </li></ol></li></ol> 3. ichmmunofluorescent Anfärben <ol><li> Fixieren den ECs in der Vorrichtung durch Perfusion mit 2% Paraformaldehyd für 30 min bei 4 ° C, gefolgt von 1x PBS bei Raumtemperatur für 15 min gespült, und 1% BSA für 30 min blockiert. Verwenden eine Perfusionsrate, die die gleiche wie die für die Zellkultur verwendet wird. </li><li> Permeabilisieren die feste ECs für Antikörper-Färbung mit 0,1% Triton X-100. Perfuse das Gerät mit Triton für 5-7 min zu Etikett VE-Cadherin und 3 min zu Label F-Actin. </li><li> Laden Sie die Antikörper in das Gerät. Perfuse das Gerät mit 1x PBS für 15 min die bisherigen Lösungen auszuwaschen. laden Sie manuell den primären Antikörper gegen VE-Cadherin (anti-Ziege) in das Gerät bei einer Konzentration von 2 ug / ml (das Gesamtvolumen beträgt 20-50 ul). Halten Sie das Gerät in einem Kühlschrank bei 4 ° C über Nacht. Perfundieren des sekundären Antikörpers (Esel-anti-Ziege) durch eine Spritzenpumpe bei einer Konzentration von 7 ug / ml für 45-60 min. </li><li> Schild EC F-Aktin mit Phalloidin. Perfuse das Gerät mit 1x PBS for 15 min vor Phalloidin (10 ug / ml) für 7-10 min manuell geladen werden. </li><li> Schild EC-Kerne (siehe Materialliste). </li><li> Spülen der Vorrichtung mit 1x PBS und halten sie bei 4 ° C bis zur Bildgebung. </li></ol> 4. Fluoreszenz - Imaging von Endothelial [Ca 2+] i <ol><li> Perfundieren, die Vorrichtung mit Albumin (10 mg / ml) -Ringer Lösung für 15 min bei 37 ° C. Verwenden Sie die gleiche Perfusionsrate wie die für die Zellkultur verwendet. Die Konzentrationen aller Komponenten von Albumin-Ringer-Lösung sind in der Materialliste beschrieben. </li><li> Richten Sie konfokales System für EG [Ca 2+] i - Bildgebung mit Fluo-04.00. Verwenden Sie ein konfokales mikroskopisches System für Ca 2+ Bildgebung. Verwenden Sie ein Argon-Laser (488 nm) für die Anregung und stellen Sie den Emissionsband als 510-530 nm. Sammeln Sie die Bilder mit einem 25X Objektiv (Eintauchen in Wasser, NA: 0,95) bei 512 x 512 Scan-Format. Verwenden, um eine z-Schritt von 2 um und einem Abtastintervall für jeden Stapel von iMagiern von 20 sec. </li><li> das Lumen fluo-4 AM mit Albumin-Ringerlösung perfundiert, die Vorrichtung mit Fluo-4 AM (5 &amp; mgr; M) für 40 min bei 37 ° C, dann auszuwaschen. </li><li> Erwerben Sie Bilder von Fluo-4 geladen microvessels. Sammeln Sie die Basis-Images für 10 min. Perfuse das Gerät mit ATP (10 &amp; mgr; M) und die Änderungen der Fluoreszenzintensität (FI) für 20 Minuten aufzeichnen. </li></ol> 5. Fluoreszenz-Imaging von Stickoxid-Produktion <ol><li> Perfundieren das Gerät mit Albumin-Ringer-Lösung für 15 min. Verwenden eine Perfusionsrate, die die gleiche wie die für die Zellkultur verwendet wird. </li><li> Stellen Sie die Fluoreszenz-Bildgebungssystem auf ATP-induzierte Produktion von Stickoxid zu messen. Verwenden eines Mikroskops, ausgestattet mit einem 12-Bit-Digital-CCD-Kamera und einer computergesteuerten Shutter für Stickstoffmonoxid-Messung. Verwenden Sie eine 75-W-Xenonlampe als Lichtquelle. Hinweis: Wählen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlänge für DAF-2 DA durch ein Interferenzfilter (480/40 nm) und einen dichroitischen Spiegel(505 nm) mit einem Bandpasssperre (535/50 nm). Verwenden Sie ein 20-fach Objektivlinse (NA: 0,75), um die Bilder zu sammeln. Um Photobleichens minimieren, positionieren Sie einen Neutraldichtefilter (0,5 N) vor dem Interferenzfilter und begrenzen Sie die Belichtungszeit auf 0,12 Sekunden. </li><li> Legen Sie die Zellen mit DAF-2 DA (5 uM). Perfundieren, die Vorrichtung mit DAF-2 DA für ca. 35-40 min bei 37 ° C. Notieren Sie sich die Basislinie von DAF-2 - Fluoreszenzintensität (FI DAF) nach dem ersten Laden. Hinweis: DAF-2 DA im Perfusat während des gesamten Experiments 7 kontinuierlich vorhanden ist. </li><li> Sammeln Sie DAF-2 Bilder. Notieren Sie sich die Basislinie von FI DAF für 5 min. Perfuse das Gerät mit ATP (10 uM) und sammeln Sie die Bilder für 30 Minuten mit 1-Minuten-Intervallen. Sammle alle Bilder aus der gleichen Gruppe von Zellen bei der gleichen Brennebene. </li></ol> 6. Datenanalyse <ol><li> wählen Sie manuell die Region von Interesse (ROIs) aus den gesammelten Bilder in einzelnen Zellebene. JederROI umfasst den Bereich einer einzelnen Zelle, die durch die Fluoreszenz Umriß angedeutet werden kann. </li><li> Subtrahiert Hintergrundfluoreszenz und den Mittelwert FI jedes ROIs. </li><li> Messen Sie ATP-induzierten Veränderungen in EG [Ca 2+] i und NO - Produktion. Quantifizieren-ATP induzierte Veränderungen in EC [Ca 2+] i durch die Änderungen in Fluo-4 FI Berechnung (FI / FI 0 * 100, wobei FI 0 die mittlere Ausgangswert FI während albumin Ringer Perfusion vor der Zugabe von ATP) minus dem gemessenen Hintergrund. Quantifizieren der NO - Produktion Rate durch die erste Differenz Umwandlung des FI DAF im Laufe der Zeit durch. Hinweis: Der Zeitverlauf der FI DAF stellt eine kumulative NO - Produktion mit der Zeit. Daher wird keine Produktionsrate basierend auf dem Profil von FI DAF sowohl unter basalen berechnet und ATP stimulierten Bedingungen. Details der Datenanalyse und experimentellen Verfahren wurden in einer früheren Veröffentlichung 7 beschrieben. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen oder Interessenkonflikte offen zu legen.

<html> In diesem Artikel präsentieren wir detaillierte Protokolle für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk, die Charakterisierung von EC Kreuzungen und Zytoskelett F-Actin - Verteilung und die quantitative Messungen der EG [Ca 2+] i und NO - Produktion eine Mikrofluidik - Vorrichtung verwendet wird . Perfundierten mikrofluidischen Vorrichtung stellt ein in vitro - Modell , das eine enge Simulation der in vivo mikrovaskulärer Geometrien und Scherströmungsbedingu...

Endothelzellen (ECs) , um die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und weisen eine pro-inflammatorischen Phänotyp 1,2. Die Mikrofluidik - Technologie ermöglicht eine präzise gesteuerte Fluid durch eine geometrisch eingeschränkten mikroskaligen (Submillimeterbereich) Kanäle 3, die die Möglichkeit für die kultivierten Zellen bietet, insbesondere für vaskulären ECs unter gewünschten Strömungsbedingungen zu wachsen. Diese Eigenschaften machen die Zellkulturbedingungen näher an in vivo als die herkömmlichen, statischen 2D - Zellkulturen. Sie sind äußerst wichtig, wenn die Mikrofluidik-Vorrichtungen verwendet werden, um verschiedene Arten von Gefäßsystemen modellieren und EC Reaktionen auf mechanische und / oder chemische Reize zu studieren. Trotz der Vorteile, die durch die Mikrokanalnetzwerk über eine statische Zellkultur zeigten, die Anpassung und Anwendung von Mikrofluidik in der biomedizinischen field begrenzt bleiben. Berichtet von einer kürzlich erfolgten Überprüfung, die Mehrheit der Veröffentlichungen dieser Bereich (85%) sind nach wie vor in den Ingenieurzeitschriften 4. Die Leistung von mikrofluidischen Systemen ist nicht überzeugend genug gewesen, um für die meisten Biologen von aktuellen Techniken zu wechseln wie die Transwell-Assay und der Makroebene Kulturschale / Glasträger auf diese miniaturisiertes Gerät. Mikrofluidik ist ein multidisziplinäres Feld, das interdisziplinäre Zusammenarbeit erfordert uns darauf, dieses Feld zu bewegen. Das Ziel dieser technischen Artikel ist es, die Wissenslücken zwischen den Disziplinen zu reduzieren und die Herstellungsverfahren verständlich von Biologen machen, während die biologische Anwendung und funktionale Validierung der mikrofluidischen microvessels bereitstellt. Die visualisierten experimentelle Protokolle umfassen die Herstellung von sowohl Mikrofluidik-Vorrichtungen und deren biologische Dienstprogramme, die eine enge Zusammenarbeit zwischen Ingenieuren und Biologen darstellt. Vor kurzem berichteten wir einigebiologische Anwendungen , die in vitro microvessel Netzwerk mit mikrofluidischen Vorrichtung 5 verwendet wird . Um in geeigneter Weise die Dimensionen des Mikrokanalnetz entwerfen und anwenden, um das gewünschte Schubspannung, ein numerisches Modell mit Computational Fluid Dynamic Software gebaut, um genau das Strömungsprofil abzuschätzen. Primäre humane Nabelschnurvenen - Endothelzellen (HUVECs), die in die Mikrokanäle erreicht Konfluenz ausgesät wurden, dh bedeckt die gesamten Innenflächen des Mikrokanals, in 3-4 Tagen mit kontinuierlicher Perfusion. Die geeignete Barrierebildung wurde durch VE-Cadherin-Färbung nachgewiesen, und im Vergleich mit denen unter statischen Zellkulturbedingungen und in intakten microvessels gebildet. Durch die Anwendung der experimentellen Protokolle einzeln durchbluteten intakten microvessels entwickelt 6-8, gemessen wir quantitativ die Veränderungen in der EG [Ca 2+] i und Stickstoffmonoxid (NO) in Reaktion auf Adenosintriphosphat (ATP) mit Fluoreszenz - inindikatoren und konfokale und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie. Die Agonist-induzierten Anstieg der EG [Ca 2+] i und NO - Produktion wurden als notwendig intrazelluläre Signale für Entzündungsmediator-induzierten Anstieg der microvessel Permeabilität 6-15 berichtet. Obwohl einige frühere Studien Bilder zeigten DAF-2 DA geladen mikrofluidischen Geräte 16,17, entsprechende Auflösung und Datenanalyse war noch nicht erreicht 18. Unseres Wissens zeigt diese Studie die erste quantitative Messungen von Agonisten induzierte dynamische Veränderung der endothelialen [Ca2 +] i und NO - Produktion unter Verwendung von Mikrofluidik - basierten System. Mikrofabrikationstechniken haben die Flexibilität , Mikrokanäle bis zu wenigen Mikrometern herzustellen und die Entwicklung von komplexen Mustern zu ermöglichen , um die Geometrien der in vivo microvasculature imitieren. Hier präsentierten wir ein typisches Mikrokanalnetz mit drei Ebenen der Verzweigung. DiesNetzwerk wird durch die Kombination von Photolithographie hergestellt, die in einem Mikrofabrikations Reinraum- und Weichlithographie durchgeführt wird.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Brain Extract (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (nuclei staining)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffered Saline Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE microbore tubing, 0.012&quot; ID x 0.030&quot; OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithography bench</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &amp;amp; Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Shutter for the CCD camera</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simulation software</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Images acquire and analyse for NO production&amp;nbsp;</td><td>Universal Imaging</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

Endothelzellen (ECs) sind die Wände der Blutgefäße in vivo Futter ständig fließen ausgesetzt, aber kultiviert ECs werden oft unter statischen Bedingungen gezüchtet und eine pro-inflammatorischen Phänotyp aufweisen. Obwohl die Entwicklung von Mikrofluidik-Vorrichtungen hat von den Ingenieuren mehr als zwei Jahrzehnten, ihre biologischen Anwendungen beschränkt bleiben gut angenommen. Eine physiologisch relevanten in vitro microvessel Modell durch biologische Anwendungen validiert ist wichtig , um das Feld zu fördern und um die Lücken zwischen in vivo- und in vitro - Studien überbrücken. Hier präsentieren wir detaillierte Verfahren für die Entwicklung von kultivierten microvessel Netzwerk eine Mikrofluidik-Vorrichtung mit einer langfristigen Perfusions-Fähigkeit verwenden. Wir zeigen auch , ihre Anwendungen für die quantitative Messung von Agonist-induzierter Veränderungen in EC [Ca 2+] i und Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in Echtzeit konfokale und konventionelle Fluoreszenzmikroskopie. Das gebildete microvessel NetzArbeit mit kontinuierlicher Perfusion zeigte gut ausgebaute Verbindungen zwischen ECs. VE-Cadherin war Verteilung zu beachten, dass eine engere in intakten microvessels als statisch kultivierten EC Monolayern. ATP-induzierte vorübergehende Erhöhung des EC [Ca 2+] i und NO - Produktion wurden bei einzelnen Zellebenen quantitativ gemessen, die die Funktionalität der gezüchteten microvessels validiert. Diese mikrofluidischen Vorrichtung ermöglicht ECs unter einer gut kontrollierten, physiologisch relevanten Strömungs zu wachsen, die die Zellkulturumgebung näher an in vivo als bei den herkömmlichen, statischen 2D - Kulturen macht. Das Mikrokanalnetzdesign ist sehr vielseitig, und der Herstellungsprozess ist einfach und wiederholbar. Das Gerät kann einfach an die konfokale oder konventionellen mikroskopischen System integriert werden ermöglicht hochauflösende Bildgebung. Am wichtigsten ist, weil das kultivierte microvessel Netzwerk kann durch primären humanen ECs gebildet werden, wird dieser Ansatz als ein nützliches Instrument dienen zu untersuchen, wiepathologisch veränderten Blutkomponenten aus Patientenproben beeinflussen menschliche ECs und Einblick in die klinische Fragen bieten. Es kann auch als Plattform für Arzneimittelscreening entwickelt werden.

Dieser Abschnitt zeigt einige der Ergebnisse mit dem kultivierten microvessel Netzwerk mit diesem Protokoll entwickelt erhalten. Die Mikrokanalmuster ist ein Dreipegel - Verzweigungsnetzwerk (1A). In diesem Entwurf ein 159 &amp; mgr; m breiten Mutterkanal verzweigt sich in zwei 126 &amp; mgr; m breite Kanäle und Äste wieder in vier 100 &amp; mgr; m breit Tochter Kanäle. Eine 3D numerische Simulation wurde durchgeführt , um die Scherspannungsverteilungen unter der Str...

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Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Entwicklung und Charakterisierung von<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrogefäßnetz und quantitative Messungen von Endothelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Und die Produktion von Stickoxid

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.5K Aufrufe.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Serie: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Biotechnik

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro-

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Differenzierung und mechanische Stimulation von hiPSC-abgeleiteten Endothelzellen

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von hiPSC-abgeleiteten Endothelzellen, die unter fluidisch vermittelter mechanischer Stimulation kultiviert wurden 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studium der Angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Entwicklung und Charakterisierung von

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Ein

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Kinetische Analyse der Vaskulogenese quantifiziert Dynamik der Vaskulogenese und Angiogenese In-vitro-

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

In vitro On-Chip-Modell eines fötalen menschlichen Gefäßes zur Untersuchung der Entwicklungsmechanobiologie

Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die