Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y la Sangre otorga HL56237, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales Instituto DK97391-03, la Fundación Nacional de Ciencia (NSF-1227359 y EPS-1003907).

1. La fabricación de dispositivos de microfluidos <ol><li> La fabricación estándar de fotolitografía de un SU-8 maestro molde 50 <ol><li> Limpiar la oblea de silicio antes de spin-coating. Enjuagar una oblea de silicio de 2 pulgadas desnudo con acetona durante 15 min seguido de alcohol isopropílico (IPA) para 15 min. Deshidratar la oblea colocándolo en una placa caliente a 150 ° C durante 1 hr. Después de la deshidratación, enfriar la oblea a temperatura ambiente. </li><li> Spin-capa de la oblea de silicio con SU-8 fotoprotector. Añadir 2 ml SU-8 fotoprotector sobre la oblea. Rampa de la oblea a 500 rpm a 100 rpm de aceleración / s durante 10 s, seguido de 1.000 rpm a 300 rpm / seg aceleración para 30 seg. (Ver Suplementario vídeo 1) </li><li> Pre-hornear la oblea en una placa caliente a 65 ° C durante 10 minutos, luego horneado suave a 95 ° C durante 30 minutos. </li><li> Utilice la exposición UV para transformar el patrón diseñado a partir de una máscara de película a la fotoprotección spin-revestido. Imprimir el patrón sobre una fina película transparente como una máscara de película. Coloque la máscara de la película en la parte superior de lamediante revestimiento por centrifugación fotorresistente y exponer a los rayos UV con una dosis de 300 mJ / cm 2. (Ver Suplementario vídeo 2) Nota: En este protocolo, el patrón de red de microcanales (159 micras de ancho madre canales de derivación en cuatro canales de 100 micras de ancho hija) está diseñado con el software de CAD. El patrón en la película muestra como un campo claro y el resto de la película está cubierta por la tinta de color negro. Debido SU-8 es un fotorresistente negativo, la parte de la resina fotosensible que se expone a los rayos UV se pueden reticular y convertirse en insoluble al disolvente durante el desarrollo del molde (etapa 1.1.6). Después del desarrollo, esta porción insoluble se replicará el patrón de red diseñado y servir como un molde maestro. </li><li> Post-hornear la oblea expuesta sobre una placa caliente a 65 ° C durante 1 min, luego 95 ° C durante 10 min. </li><li> Desarrollar el molde maestro. Uso SU-8 desarrollador como disolvente para eliminar la resina fotosensible no reticulado. Sumergir la oblea en el SU-8 revelador durante 3 minutos y enjuagar con IPApara 1 min. </li><li> Repita este ciclo de desarrollo de 2-3 veces hasta que no hay formación de estrías de color blanco (residuo de resina fotosensible no curada) después del enjuague IPA. secar suavemente la oblea con gas nitrógeno y examinar las pequeñas características del patrón con un microscopio. Repetir los ciclos de desarrollo adicionales si es necesario. </li><li> Duro hornear la oblea en una placa caliente a 150 ° C durante 15 minutos. </li></ol></li><li> La litografía blanda <ol><li> mezclar manualmente las dos partes (base y agente de curado) de polidimetilsiloxano de elastómero (PDMS) en un peso. relación de 10: 1. </li><li> De-gas la mezcla de PDMS con un desecador de vacío conectado con una casa de 15 min. Reparto de la solución de PDMS en el molde maestro fotoprotector. El espesor de la PDMS tiene que ser mayor de 3 mm para proporcionar una sujeción estable de la tubería de entrada / salida. De-gas el PDMS de nuevo durante 15 min, y eliminar las burbujas de aire que quedan con gas nitrógeno, si es necesario. Curar el PDMS fundidos en un horno a 65 ° C durante 3 horas. </li><li> Limpiar la superficie deel cubreobjetos de vidrio con una cinta adhesiva y un limpiador de plasma (tratamiento con plasma de 30 segundos). Spin-capa de PDMS ONU-curado (0,5 ml) sobre el cubreobjetos de vidrio por el aumento gradual a 4.000 rpm a velocidad de aceleración / seg a 500 rpm durante 30 segundos. Curar el cubreobjetos recubierto spin-PDMS en un horno a 65 ° C durante al menos 30 min. </li><li> Cortar y liberar el PDMS curado del molde maestro. A continuación, cree una entrada y una salida con una perforadora 1 mm de diámetro en el extremo distal de los canales madre. </li><li> Unir el dispositivo a la cubreobjetos de vidrio recubiertos-spin PDMS. Oxidar la superficie de los PDMS y el cubreobjetos con un limpiador de plasma para 1 min. Después del tratamiento con plasma de oxígeno, colocar una gota de agua desionizada (agua DI) en la superficie de unión, y colocar las dos piezas juntas. Hornear el dispositivo en un horno a 65 ° C durante 30 min para lograr una unión permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Suplementario de vídeo 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Suplementario de vídeo 1 (Haga clic derecho para descargar).</a> <img alt="Suplementario Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Suplementario Video 2 (Haga clic derecho para descargar).</a> 2. endotelial siembra de células y Cultura <ol><li> La esterilización de dispositivos y fibronectina Revestimiento <ol><li> Preservar la propiedad hidrófoba de la superficie de PDMS alrededor de la entrada / salida de la oxidación. Cubrir la superficie de PDMS alrededor de la entrada y la salida con pequeñas tiras de cinta adhesiva para evitar la oxidación. Este procedimiento puede evitar que el agua DI se propague por toda la superficie superior del dispositivo durante la etapa de llenado (2.1.3). </li><li> Se trata el dispositivo de PDMS con plasma de oxígeno for 5 min para cambiar la superficie para que sea hidrófila, de este modo facilitar el flujo de fluido a través del microcanal y prevenir la burbuja atrapando en el procedimiento de llenado (2.1.3). </li><li> Utilice una jeringa con una aguja unida o una pipeta para llenar el dispositivo con agua DI desde la entrada. Continuar el relleno hasta que hay una gota de agua DI (30-50 l) acumulada en la salida. Examine el dispositivo bajo un microscopio para verificar si hay burbujas atrapadas en el interior del microcanal. Eliminar la gotita de agua excesiva en la entrada y la salida con un pañuelo de papel. </li><li> Esterilizar el dispositivo en una placa de Petri con UV durante un mínimo de 3 horas en una campana de bioseguridad laminar. Para evitar la evaporación, cubra la entrada / salida con una fina pieza de PDMS, poner un pañuelo de papel húmedo en el interior del plato, y envolver el plato con Parafilm. </li><li> Recubrir el dispositivo con fibronectina. Enjuague el dispositivo por primera vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), a continuación, cubrir con 100 mg / ml de fibronectina durante la noche en un refrigerador (4 ° C). Coloque una gota de la solución en la entrada, y luego crear una presión negativa en la salida con un vacío de la casa, una jeringa con una aguja o una pipeta. </li><li> Complete el dispositivo con medios de cultivo celular. Enjuague el dispositivo con PBS manualmente por 3 veces antes de cargar el medio de cultivo celular. Calentar el dispositivo en una incubadora a 37 ° C. </li></ol></li><li> EC Siembra y la perfusión a largo plazo Nota: En comparación con la cultura 2D CE estática convencional, el modelo de red de microvasos in vitro con perfusión continua hizo que el ambiente de cultivo celular más cerca de las condiciones in vivo. El vitro red de microvasos en demostrado en este protocolo se puede mantener hasta dos semanas. La perfusión bien controlada va a reponer los nutrientes de forma continua, eliminar los desechos y evitar el exceso de confluencia de la monocapa CE. Por lo tanto, se puede extender a unos estudios a largo plazo, imitando el entorno celular y hemodinámica bajo diferentes physiological y condiciones patológicas. <ol><li> Mezclar HUVECs primarias en medios de cultivo de HUVEC (MCDB 131) con 8% de dextrano (peso molecular 70.000). El dextrano se utiliza para aumentar la viscosidad de los medios de carga y lograr un mejor resultado la siembra de células. La densidad celular recomendada es de alrededor de 2-4 x 10 6 células / ml. </li><li> Sembrar las células en el dispositivo. Coloque una gota de 10-20 l de células sobre la entrada. Introducir un flujo suave ya sea por la inclinación del dispositivo, o la acción capilar usando una pipeta Pasteur de vidrio en la salida. La clave para el éxito de carga de las células es el control de la velocidad de flujo de menos de 1 mm / s dentro de los canales más pequeños. </li><li> Compruebe la siembra de células. Después de la siembra inicial, incubar el dispositivo durante 15-20 min (atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C) antes de comprobar el estado de la siembra en el microscopio. Si es necesario, realizar la carga celular adicional para alcanzar una densidad celular deseada. </li><li> Enjuague suavemente el dispositivo con medio de cultivo celular (37° C) para eliminar el dextrano. Cultura del dispositivo en ausencia de flujo para la primera 6 h en una incubadora (5% de CO2 a 37 ° C). </li><li> Configurar la conexión de tubos para la perfusión a largo plazo. Tape el dispositivo en una placa de Petri para evitar el movimiento. Crear pequeños agujeros en la tapa de la placa de Petri para las inserciones de entrada y tubo de salida. Conectar el tubo de entrada a una jeringa con una aguja para la perfusión medios de cultivo celular. Conecte el tubo de salida a un colector de residuos. Nota: Coloque el dispositivo y el colector de residuos en una incubadora de cultivo de células, mientras que la colocación de una bomba de perfusión fuera de la incubadora y conectarlo con el dispositivo por el tubo de entrada de largo. La tasa de perfusión se determina por el diseño experimental. En el presente dispositivo, utilice una velocidad de perfusión de 0,35 l / min y un rango de tensiones de cizallamiento entre 1-2 dinas / cm 2. Bajo esta condición de perfusión, las HUVECs alcanzan la confluencia en aproximadamente 3-4 días. </li></ol></li></ol> 3. ILa tinción mmunofluorescent <ol><li> Fijar el ECs en el dispositivo por perfusión de paraformaldehído al 2% durante 30 min a 4 ° C, seguido de 1x PBS enjuague a temperatura ambiente durante 15 min, y el bloqueo de 30 min 1% de BSA. Utilice una velocidad de perfusión que es el mismo que el utilizado para el cultivo celular. </li><li> Permeabilizar las ECs fijo para la tinción de anticuerpo con 0,1% Triton X-100. Perfundir el dispositivo con Triton de 5-7 minutos a la etiqueta VE-cadherina, y 3 minutos a la etiqueta de F-actina. </li><li> Cargar los anticuerpos en el dispositivo. Perfundir el dispositivo con 1x PBS durante 15 min para lavar las soluciones anteriores. cargar manualmente el anticuerpo primario contra cadherina VE (anti-cabra) en el dispositivo a la concentración de 2 mg / ml (el volumen total es de 20 a 50 l). Mantenga el dispositivo en un refrigerador a 4 ° C durante la noche. Perfundir el anticuerpo secundario (de burro anti-cabra) por una bomba de jeringa a una concentración de 7 g / ml durante 45-60 min. </li><li> Etiqueta CE F-actina con faloidina. Perfundir el dispositivo con PBS 1x for 15 min antes de cargar manualmente faloidina (10 mg / ml) durante 7-10 min. </li><li> Etiqueta núcleos CE (véase la Lista de Materiales). </li><li> Enjuague el dispositivo con 1x PBS, y mantenerla a 4 ° C hasta que la imagen. </li></ol> 4. Obtención de imágenes de fluorescencia endotelial [Ca2 +] i <ol><li> Perfundir el dispositivo con la albúmina (10 mg / ml) la solución de -Ringer durante 15 min a 37 ° C. Utilizar la misma tasa de perfusión que el utilizado para el cultivo celular. Las concentraciones de todos los componentes de la solución de albúmina-Ringer se describen en la Lista de materiales. </li><li> Establecer un sistema confocal para EC [Ca2 +] i la formación de imágenes con fluo-4 PM. Utilice un sistema de microscopio confocal para obtener imágenes de Ca 2+. Utilizar un láser de argón (488 nm) para la excitación y ajustar la banda de emisión como 510-530 nm. Recoger las imágenes con un objetivo 25X (inmersión en agua, NA: 0,95) a 512 x 512 formato de exploración. Use un z-escalón de 2 my un intervalo de exploración para cada pila de imagos de 20 seg. </li><li> Perfundir el dispositivo con fluo-4 de AM (5 M) durante 40 minutos a 37 ° C, y luego lavar el lumen fluo-4 AM con la solución de albúmina-Ringer. </li><li> Adquirir imágenes de microvasos fluo-4 cargado. Recoger las imágenes de línea de base durante 10 minutos. Perfundir el dispositivo con ATP (10 mM) y registrar los cambios de intensidad de fluorescencia (FI) para 20 min. </li></ol> 5. Obtención de imágenes de fluorescencia producción de óxido nítrico <ol><li> Perfundir el dispositivo con la solución de albúmina-Ringer durante 15 min. Utilice una velocidad de perfusión que es el mismo que el utilizado para el cultivo celular. </li><li> Configurar el sistema de imágenes de fluorescencia para medir la producción de óxido nítrico inducida por ATP. Use un microscopio equipado con una cámara CCD digital de 12 bits y un obturador controlado por ordenador para la medición de óxido nítrico. Utilice una lámpara de xenón de 75 W como fuente de luz. Nota: Seleccionar la excitación y emisión de longitudes de onda para DAF-2 DA por un filtro de interferencia (480/40 nm) y un espejo dicroico(505 nm) con una barrera de paso de banda (535/50 nm). Use un lente objetivo de 20X (NA: 0,75) para recoger las imágenes. Para minimizar photobleaching, coloque un filtro de densidad neutra (0,5 N) delante del filtro de interferencia y limitar el tiempo de exposición a 0,12 seg. </li><li> Cargar las células con DAF-2 DA (5 M). Perfundir el dispositivo con DAF-2 DA durante aproximadamente 35-40 minutos a 37 ° C. Grabar la línea de base de DAF-2 intensidad de fluorescencia (FI DAF) después de la carga inicial. Nota: DAF-2 DA está continuamente presente en el perfundido durante todo el experimento 7. </li><li> Recoger DAF-2 imágenes. Grabar la línea de base de FI DAF durante 5 min. Perfundir el dispositivo con ATP (10 mM) y recoger las imágenes durante 30 minutos con intervalos de 1 min. Recoge todas las imágenes de un mismo grupo de células en el mismo plano focal. </li></ol> Análisis 6. Datos <ol><li> seleccionar manualmente la región de interés (ROI) de las imágenes recogidas a nivel de células individuales. CadaRetorno de la inversión cubre la superficie de una célula individual que puede ser indicada por el contorno de fluorescencia. </li><li> Restar la fluorescencia de fondo y calcular la media de cada FI ROI. </li><li> Medir los cambios inducidos por el ATP en CE [Ca2 +] i y la producción de NO. Cuantificar los cambios inducidos por el ATP en CE [Ca2 +] i mediante el cálculo de los cambios en el Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, donde 0 es la FI FI basal media durante la perfusión de albúmina-Ringer antes de añadir ATP) menos la medida fondo. NO cuantificar la tasa de producción mediante la realización de la primera conversión diferencial de la FI DAF con el tiempo. Nota: El curso temporal de FI DAF representa una producción de NO acumulado con el tiempo. Por lo tanto, NO tasa de producción se calcula en base al perfil de FI DAF bajo tanto basal como estimulada condiciones ATP. Los detalles de análisis de datos y procedimientos experimentales se han descrito en una publicación anterior 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Curry, F. R. E., Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+modulation+at+the+cell,+microvessel,+or+whole+organ+level:+towards+closing+gaps+in+our+knowledge.">Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge.</a> Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).</li><li>Michel, C. C., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+permeability.">Microvascular permeability.</a> Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).</li><li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+soft+lithography.">Recent progress in soft lithography.</a> Mater Today. 8, 50-56 (2005).</li><li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research.">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507, 181-189 (2014).</li><li>Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+recapitulation+of+functional+microvessels+for+the+study+of+endothelial+shear+response,+nitric+oxide+and+[Ca2+]I.">In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I.</a> PLoS One. 10, 0126797 (2015).</li><li>He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytoplasmic+calcium+in+single+microvessels+with+increased+permeability.">Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability.</a> Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+intracellular+nitric+oxide+in+intact+microvessels+using+4,5-diaminofluorescein+diacetate.">Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate.</a> Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).</li><li>Yuan, D., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+alters+adhesion+protein+and+cytoskeleton+reactions+to+inflammatory+stimuli+resulting+in+enhanced+permeability+increases+in+rat+venules.">Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules.</a> Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).</li><li>He, P., Zhang, X., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++entry+through+conductive+pathway+modulates+receptor-mediated+increase+in+microvessel+permeability.">Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+[Ca2+]i+and+caveolin-1+antagonistically+regulate+eNOS+activity+and+microvessel+permeability+in+rat+venules.">Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules.</a> Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).</li><li>Zhu, L., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-activating+factor+increases+endothelial+[Ca2+]+i+and+NO+production+in+individually+perfused+intact+microvessels.">Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels.</a> Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization+modulates+endothelial+cell+calcium+influx+and+microvessel+permeability.">Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+hyperpolarization+increases+[Ca2+]i+and+venular+microvessel+permeability.">Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability.</a> J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).</li><li>Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+scaffolding+domain+promotes+leukocyte+adhesion+by+reduced+basal+endothelial+nitric+oxide-mediated+ICAM-1+phosphorylation+in+rat+mesenteric+venules.">Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).</li><li>Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Mediated+Elevated+Intracellular+Calcium+and+Angiogenesis+in+Human+Microvascular+Endothelial+Cells+In+Vitro+are+Inhibited+by+Dominant+Negative+TRPC6.">VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6.</a> Microcirculation. 15, 605-614 (2008).</li><li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology.">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).</li><li>D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+monitoring+of+ATP-stimulated,+endothelium-derived+nitric+oxide+production+in+channels+of+a+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+device.">Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device.</a> Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).</li><li>Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-induced+endothelial+NO+production+contributes+to+vascular+cell+apoptosis+and+increased+permeability+in+rat+venules.">H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules.</a> Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).</li><li>Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+microbioreactor+array+for+quantitative+cell+biology.">Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.</a> Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).</li><li>Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angioadaptation:+Keeping+the+Vascular+System+in+Shape.">Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape.</a> Physiology. 17, 197-201 (2002).</li><li>Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+blood+rheological+parameters+in+the+microvasculature+of+cat+mesentery.">The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery.</a> Circulation Research. 43, 738-749 (1978).</li><li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion.">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).</li><li>McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+flow+behavior+in+a+parallel+plate+flow+chamber+:+alters+endothelial+cell+responses.">Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses.</a> Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).</li><li>Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+venular+microvessel+permeability+by+calcium+influx+into+endothelial+cells.">Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells.</a> FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).</li><li>Kojima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+imaging+of+nitric+oxide+with+novel+fluorescent+indicators:+diaminofluoresceins.">Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins.</a> Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen intereses en competencia o intereses en conflicto a revelar.

<html> En este artículo, se presentan los protocolos detallados para el desarrollo de la red de microvasos culta, la caracterización de los cruces de la CE y el citoesqueleto de actina F de distribución, y las mediciones cuantitativas de la CE [Ca2 +] i y la producción de NO usando un dispositivo de microfluidos. El dispositivo de microfluidos perfundido proporciona un modelo in vitro que permite un cierre de simulación de las geometrías microvasculares in vivo y las condicio...

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria 1,2. La tecnología microfluídica permite un fluido controlada con precisión a través de una microescala geométricamente limitados (sub-milímetro) los canales 3, lo que proporciona la oportunidad para que las células cultivadas, especialmente para ECs vascular, creciendo bajo condiciones de flujo deseadas. Estas características hacen que las condiciones de cultivo celular in vivo más cerca de que los cultivos convencionales, estáticas 2D celulares. Son extremadamente importante cuando los dispositivos de microfluidos se utilizan para modelar los diferentes tipos de vasculatures y para estudiar las respuestas de las CE a estímulos mecánicos y / o químicos. A pesar de las ventajas demostradas por la red de microcanales a través de un cultivo de células estático, la adaptación y aplicación de la microfluídica en la f biomédicaield siguen siendo limitados. Informado por una revisión reciente, la mayoría de las publicaciones de este campo (85%) se encuentran todavía en revistas de ingeniería 4. El rendimiento de los dispositivos de microfluidos no ha sido lo suficientemente convincente como para la mayoría de los biólogos para pasar de las técnicas actuales, tales como el ensayo Transwell y la macro-escala de diapositivas placa de cultivo / vidrio para este dispositivo miniaturizado. Microfluídica es un campo multidisciplinario, que requiere la colaboración interdisciplinaria para progresar en este campo. El objetivo de este artículo técnico es reducir las brechas de conocimiento entre disciplinas y realizar los procedimientos de fabricación comprensible por los biólogos, mientras que proporciona la aplicación biológica y validación funcional de los microvasos de microfluidos. Los protocolos experimentales visualizados incluyen la fabricación de ambos dispositivos de microfluidos y sus utilidades biológicas, lo que supone una estrecha colaboración entre los ingenieros y biólogos. Recientemente hemos informado de algunosaplicaciones biológicas que utilizan la red de microvasos in vitro con dispositivo de microfluidos 5. Con el fin de diseñar apropiadamente las dimensiones de la red de microcanales y aplicar la tensión de corte deseado, un modelo numérico fue construido con el software de dinámica de fluidos computacional para estimar estrechamente el perfil de flujo. Las células primarias humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) que fueron sembradas en los microcanales alcanzaron la confluencia, es decir, cubiertas las superficies interiores enteras del microcanal, en 3-4 días con perfusión continua. La formación de la barrera adecuada se demostró por tinción VE-cadherina y en comparación con los formados en condiciones de cultivo de células estáticos y en microvasos intactas. Mediante la aplicación de los protocolos experimentales desarrolladas en microvasos intactas perfundidos individualmente 6-8, que mide cuantitativamente los cambios en la CE [Ca2 +] i y el óxido nítrico (NO) en respuesta a la adenosina trifosfato (ATP) con fluorescente inindicadores y confocal y microscopía de fluorescencia convencional. Los aumentos inducidos por agonistas en CE [Ca2 +] i y la producción de NO se han reportado como señales intracelulares necesarias para inflamatorias mediador aumentos inducidos en la permeabilidad microvascular 6-15. Aunque algunos estudios anteriores mostraron imágenes de dispositivos de microfluidos DAF-2 DA cargados 16,17, resolución y los datos apropiados análisis todavía no había alcanzado 18. Para nuestro conocimiento, este estudio demuestra las primeras mediciones cuantitativas de cambio dinámico inducida por el agonista en endotelial i y la producción de NO utilizando microfluidos sistema basado en [Ca 2 +]. Técnicas de microfabricación tienen la flexibilidad para fabricar microcanales a unas pocas micras y permitir el desarrollo de patrones complejos para imitar las geometrías de la microvasculatura en vivo. Aquí presentamos una red de microcanales típico con tres niveles de ramificación. Estala red se fabrica mediante la combinación de fotolitografía que se realiza en una sala limpia de microfabricación y litografía blanda.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Brain Extract (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (nuclei staining)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffered Saline Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE microbore tubing, 0.012&quot; ID x 0.030&quot; OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithography bench</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &amp;amp; Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Shutter for the CCD camera</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simulation software</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Images acquire and analyse for NO production&amp;nbsp;</td><td>Universal Imaging</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

Las células endoteliales (EC) que recubren las paredes de los vasos sanguíneos in vivo están constantemente expuestos a fluir, pero ECs cultivadas a menudo se cultivan en condiciones estáticas y exhiben un fenotipo pro-inflamatoria. Aunque el desarrollo de dispositivos de microfluidos ha sido abrazado por los ingenieros de más de dos décadas, sus aplicaciones biológicas siguen siendo limitados. Un modelo in vitro de microvasos fisiológicamente más relevantes en validada por aplicaciones biológicas es importante para avanzar en el campo y salvar las diferencias entre in vivo e in vitro estudios. A continuación, presentamos los procedimientos detallados para el desarrollo de la red de microvasos cultivan utilizando un dispositivo de microfluidos con una capacidad de perfusión a largo plazo. También demuestran sus aplicaciones para mediciones cuantitativas de los cambios inducidos por agonistas en EC I y el óxido nítrico (NO) [Ca 2+] en tiempo real utilizando confocal y microscopía de fluorescencia convencional. La red de microvasos formadotrabajo con perfusión continua mostró uniones bien desarrollados entre los CE. VE-cadherina distribución estaba más cerca de la observada en los microvasos intacto que monocapas CE estáticamente cultivadas. ATP-indujo aumentos transitorios en la CE [Ca2 +] i y la producción de NO se midió cuantitativamente en los niveles de células individuales, que haya validado la funcionalidad de los microvasos cultivadas. Este dispositivo de microfluidos permite ECs para crecer bajo un bien controlado, el flujo fisiológicamente relevante, lo que hace que el entorno de cultivo celular más cercano a in vivo que el de los cultivos 2D convencionales, estáticas. El diseño de la red de microcanales es altamente versátil, y el proceso de fabricación es simple y repetible. El dispositivo se puede integrar fácilmente en el sistema microscópico confocal o convencional que permite imágenes de alta resolución. Lo más importante, ya que la red de microvasos cultivadas puede estar formado por ECs humanos primarios, este enfoque servirá como una herramienta útil para investigar cómopatológicamente componentes sanguíneos alterados a partir de muestras de pacientes humanos afectan a los EC y dar una idea de los problemas clínicos. También puede ser desarrollado como una plataforma para la detección de drogas.

Esta sección muestra algunos de los resultados obtenidos con la red de microvasos cultivaron desarrollado con este protocolo. El patrón de microcanales es una red de ramificación de tres niveles (Figura 1A). En este diseño, unas 159 micras de ancho ramas del canal madre en dos canales de 126 micras de ancho, y las ramas de nuevo en cuatro canales de 100 micras de ancho hija. Una simulación numérica 3D se realizó para estimar la distribución de esfuerzo cortante b...

Watch this Scientific Journal Video about Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production at JoVE.com

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desarrollo y caracterización de<em&gt; In Vitro</em&gt; Red de microvasos y mediciones cuantitativas de endotelial [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; Y la producción de óxido nítrico

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.5K vistas.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Video: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método para time-lapse de rata cultivadas mesentéricas microvasculares Redes

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Bioingeniería

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

Análisis cinético de vasculogénesis cuantifica la dinámica de la vasculogénesis y angiogénesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Diferenciación y estimulación mecánica de células endoteliales derivadas de hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autor destacado: Estudio de células endoteliales derivadas de hiPSC cultivadas bajo estimulación mecánica mediada por fluidos 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudio de la angiogénesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Desarrollo y caracterización de

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video

Un

Procedimiento para el Desarrollo de la Multi-profundidad Circular transversal endotelizado microcanales-on-a-chip

Análisis cinético de vasculogénesis cuantifica la dinámica de la vasculogénesis y angiogénesis In Vitro

Un modelo 3D In Vitro y una tubería computacional para cuantificar el potencial vasculogénico de los progenitores endoteliales derivados de iPSC

Sistema de ensayo de angiogénesis tridimensional utilizando esferoides de cocultura formados por células formadoras de colonias endoteliales y células madre mesenquimales

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

In vitro Modelo de vaso humano fetal en chip para estudiar la mecanobiología del desarrollo

Ensayo de formación de tubos de células endoteliales para la