このアプローチは、心不全の発症中の収縮機能の変化を検出します。神経ホルモンおよび潜在的な治療薬に対する筋細胞における機能的応答もスクリーニングすることができる。筋細胞の位置決めには練習が必要ですが、一貫したサルコメア長イメージングを得るために不可欠です。
手順を実演するのは、研究所の准教授兼主任研究者であるマーガレットウェストフォールです。実験を開始する前に、ゲルパックと培地をインキュベーター内で摂氏37度で30分間予熱します。原稿に記載されているように収縮機能プラットフォームコンポーネントの電源を入れ、チューブを蠕動ポンプに組み立てます。
次に、予熱したゲルパックをチューブホルダーに移し、細胞刺激装置の電源を入れて真空にします。メディアの入った50ミリリットルのチューブを断熱チューブホルダーに入れて、蠕動ポンプチューブを通して毎分0.5ミリリットルで灌流を開始します。次に、2ミリリットルの予熱培地を小さな計量ボートに加え、筋細胞を含むカバースリップ1枚を刺激チャンバーから計量ボートに移します。
刺激室を摂氏37度と5%二酸化炭素でインキュベーターに戻します。計量ボートからカバースリップを取り外し、下側をそっと拭いてから、グリースを塗りたてのカバースリップチャンバーに移し、カバースリップにメディアを一滴加えます。プラチナ電極マウントをカバースリップの上に置き、次に新しいカバースリップを鉗子で上部に置き、カバースリップサンドイッチの上にトップマウントを置きます。
2つまたは4つのゼロなべネジを取り付けて、チャンバーの組み立てを完了します。蠕動ポンプで、チューブ全体に媒体が存在する場合は、チューブを予熱器に取り付け、予熱器をカバースリップチャンバーに取り付けます。次に、毎分0.5ミリリットルで灌流を開始し、漏れがないことを確認するためにチャンバーの下にティッシュワイプを置きます。
カバースリップチャンバーを顕微鏡のステージアダプターに配置した後、加熱システムをオンにし、アセンブリを5〜10分間平衡化して、チャンバーの中央で摂氏37度の一定の媒体温度を達成します。真空システムに接続されたチューブを使用して、チャンバーの反対側の端に灌流された媒体が収集されるのを観察します。平衡化時間中に、40倍の水浸対物レンズで筋細胞を顕微鏡で可視化します。
ペーシング刺激装置をアクティブにするには、電圧を35〜40ボルトに設定し、刺激周波数を0.2ヘルツに調整して、収縮機能と筋細胞の生存を最適化します。サルコメア短縮トレースを収集するには、コンピューターでソフトウェアを開き、[OK]、[ファイル]、および[新しい]タブを選択します。トレースを選択して画面テンプレートを準備し、ユーザー制限とサルコメアの長さを編集します。
ファイルと新しいタブでサルコメアの長さのトレースを記録し、収縮筋細胞を特定し、筋細胞をカメラの縦軸に沿って配置して、線条パターンが垂直になるようにします。コンピューターのマウスを使用して、関心領域またはROIボックスを筋細胞の上に配置します。収集を選択して収縮機能の記録を開始します。
0.5ヘルツの低刺激周波数で各筋細胞から60秒間の短縮を記録します。カバースリップごとに5セルから10セルに短縮するサルコメアを記録します。周波数範囲の短縮を測定するには、各周波数に筋細胞を配置して、記録前に定常状態の短縮を取得します。
灌流速度を2倍にし、刺激後15〜20秒で0.2〜2ヘルツの範囲の新しい周波数で記録を開始し、所定の範囲の刺激周波数にわたって短縮するためにカバースリップごとに2つ以下の筋細胞を記録します。セルごとに少なくとも7つの収縮を記録して、信頼性の高い信号平均データを取得します。ファイルを選択し、記録されたトレースを選択して、[開く] を選択します。
基本トレースのタブ 1 を選択し、トレースの上部にある黄色のパネルを設定して、sarc の長さを取得します。操作単調過渡解析オプションとTTLイベントマークを含む解析テンプレートを、メニューから必要なオプションの[T Zeroの定義]ボックスに用意します。テンプレートを選択してこれらの解析オプションを保存し、解析テンプレートを識別子とともに保存します。
各トレースを分析する前に、分析テンプレートをロードします。データを解析するには、マークを選択し、ゲートし、過渡値を追加してから、イベントマークと解析範囲から変換します。0.2ヘルツでペースを合わせた筋細胞の時間範囲をマイナス0.01秒から1.20秒に設定します。
より高い周波数で刺激された筋細胞については、より短い時間範囲を選択します。操作と平均イベントを選択して、元のベーストレースの下に平均化された信号記録を生成します。次に、信号平均トレースのタブ1を選択し、上部メニューのマークに移動してから過渡を追加し、操作と単調過渡解析を選択して、ベースラインサルコメアパラメータの信号平均値を信号平均表示パネルに表示します。
単調過渡解析とクリップボード電流をエクスポートし、複数の筋細胞の複合解析のために非定常サルコメア解析をスプレッドシートに転送します。信号平均トレースをコピーするには、エクスポート、現在のトレース、クリップボード、オプションの順に選択し、小数点以下の桁数を5に設定します。タブ区切り文字を選択し、[OK]をクリックします。
各筋細胞のシグナル平均トレースを2番目のスプレッドシートに記録します。この研究は、圧力過負荷またはPOが、偽群と比較して筋細胞の収縮機能を低下させることを示した。しかし、心筋トロポニンIT144DまたはcTnIT144Dの遺伝子導入から4日後、PO筋細胞の収縮能力は偽レベルに戻り、筋細胞の機能が回復する可能性があることを示しました。
初期の研究では、cTnIT144Dの遺伝子導入は、CTnIと比較してピーク短縮と拡張期カルシウムレベルの上昇を促進しました。心筋細胞の位置の微調整は、明確な短縮痕跡を得るためにしばしば必要とされる。このプロトコルは、Fura-2 AMなどのカルシウム感受性蛍光色素を負荷した心筋細胞に対して実行して、短縮に加えてカルシウム過渡現象を検出することもできます。
