This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

倫理文：ラッサ熱患者はチューレーン大学、ハーバード大学、ブロード研究所、Irrua専門教育病院（ISTH）、ケネマ政府病院（KGH）、健康、イバダンのオヨ州省でのヒト被験者委員会によって承認されたプロトコルを使用して、この研究のために募集されました、ナイジェリアと健康のシエラレオネ省。すべての患者は、彼らが研究に参加することを決めたかどうか、治療の同様の規格で処理し、薬物リバビリン提供されました。ラッサ熱（LF）の患者について、リバビリンによる治療は、現在、推奨ガイドラインに従い、一般的に、すぐにLFが強く疑われたとして提供されていました。 エボラウイルス病（EVD）に深刻な流行に、患者は、当社の標準的なプロトコルを使用して同意することができませんでした。 EVD患者からの臨床過剰サンプルの代わりに使用することは評価され、シエラレオネで、ハーバード大学の制度審査委員会によって承認されました。オフィヒト対象の使用に関するシエラレオネ倫理と科学審査委員会、保健衛生のシエラレオネ省、およびハーバード大学委員会のCEは、シーケンスに同意の放棄を付与しているし、患者と接触したサンプルから得られた公的に利用可能なウイルス配列を作りますシエラレオネエボラ流行中に収集されました。これらの機関はまた、流行の応答の間にケアを受けてすべての疑いのあるEVDの患者から採取匿名化されたサンプルについての臨床および疫学データの使用を認めました。シエラレオネ保健省と衛生にも流行サンプルのゲノム研究のためのシエラレオネからのブロード研究所、ハーバード大学への非感染性、非生物学的サンプルの出荷を承認しました。 サンプルRNAの1 DNアーゼ処理（最大55μlを抽出した全RNAを、〜4時間） <ol><li> 表1に記載されているように安全キャビネットに氷上で96ウェルPCRプレート中のDNase反応を設定します</strong&gt;、1.1（総容量、70μL/ウェル）をステップ。注：マスターミックスを調製することができます。 </li><li>やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 </li><li> 37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> RNA固相可逆的固定化（SPRI）ビーズを使用してクリーンアップ。 <ol><li>暖かいRNAビーズを30分間室温に。 </li><li>静かに落ち着いた可能性のある磁性粒子を再懸濁し、RNAビーズボトルを振ります。 DNase処理RNA（70マイクロリットル）へのRNAビーズの1.8倍の容量（126μl）を追加し、ピペットで10回を混合し、（まあ、196μlの総容量）を室温で5分間インキュベートします。 </li><li>磁気ステーションに混合物を置きます。 （ - 10分5）をクリアするためのソリューションを待ちます。 </li><li>ピペットおよび廃棄によってステーション上ながらクリアソリューションを削除します。ステーションの間に、70％エタノールでペレットを被覆することにより、ビーズを洗浄し、1分間インキュベートします。ピペットでエタノールを除去し、廃棄します。 2回の洗浄の合計のために繰り返します。 注：正確には70％新たに調製されたらを使用します&lt;70％エタノールは、サンプル7の損失を引き起こす可能性があり、一方、より高い割合は、より小さなサイズの分子の非効率的な洗浄になりますようhanolは、非常に重要です。 </li><li>ステーションにプレートを維持し、空気乾燥にオープンにしてください。注：ビーズが割れ始めるまでビーズが完全に乾燥することを可能にしてください。 </li><li> RNAを溶出するためにプレートにヌクレアーゼフリー水55μlを添加します。徹底的にピペッティングしてビーズと水を混合するステーションからプレートを取り外します。注：別の方法として、全RNAを濃縮するために、少ない水（≤10μl）を使用します。 </li><li>背面ステーションにプレートを置きます。解決策は、長期保存のための新しいスクリューキャップチューブにピペットで転送するためにクリアするまで待ちます（-80°C）。枯渇のための新しい96ウェルPCRプレートに5μlのRNAを置きます（ステップ2.4​​）。 </li><li>オプション：保存し、rRNAの定量RT-PCRのために19μlの水（1時20分）に1μlのを希釈（ 例えば 、18S、28S rRNAの）（ 表2）およびウイルスマーカー5 &lt;/李&gt; </ol></li></ol>ウイルスRNAサンプルからリボソームとキャリアRNAの2選択的枯​​渇（〜4時間） <ol><li> 表1に記載されているように直鎖状アクリルアミドキャリアと5倍ハイブリダイゼーションおよび10倍のRNase Hの反応緩衝液、およびヌクレアーゼフリー水を作ります。 </li><li> 表1に記載したように、96ウェルPCRプレート中、氷上でのrRNA枯渇オリゴ（ 表3）を用いてRNAを合成し、オリゴ（dT）でハイブリダイゼーション反応をセットアップします。 注：マスターミックスを調製することができます。ユニークな合成RNA（ERCCs 8）の50フェムトグラム（FG）は、ウイルスの配列決定プロセスや潜在的な指標読み交差汚染の両方を追跡するために追加することができます。 <ol><li>やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 毎秒-0.1℃で45℃までゆっくりランプ、2分間95℃でインキュベートします。 45℃でサーモサイクラーを一時停止します。 </li></ol></li><li>説明するように氷上でのRNase H反応ミックスを設定します表1のdは、次に2分間45℃で予熱します。注：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li> 45℃でサーモサイクラー中でプレートを維持しながらプレートにハイブリダイゼーション反応に予備加熱されたRNアーゼHミックスを加えます。 </li><li> 8回 - 穏やかにピペッティング6でよく混ぜます。さらに30分間45℃でインキュベートします。氷の上に置きます。 </li></ol></li><li> 表1に記載したように氷上でのDNase反応ミックスを設定注意：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li> 、プレート内のRNase H反応に追加やさしく、徹底的にボルテックスし、1分間室温で280×gで遠心します。 37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 5μlの0.5 M EDTAを添加することにより、DNアーゼ反応を停止します。やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 </li></ol></li><li> 1.8倍の容量（144μl）をビーズを用いてRNAビーズを使用してクリーンアップ（ステップ1.3を参照してください）​​。ヌクレアーゼフリー水11μlの溶出。注：安全な低温貯蔵のために、ストアはRNを枯渇しました-80°C O / Nサンプル。 </li></ol> 3. cDNA合成（〜6時間） <ol><li>ミックスのrRNA / 96ウェルPCRプレート中の氷上でランダムプライマーとキャリア枯渇RNA、表1に記載されているように、渦やさしく、徹底的に、その後1分間室温で280×gで遠心します。 <ol><li>サーモサイクラー中で10分間70℃で混合物を加熱します。 5分 - すぐに熱変性した後、1氷上でRNAを置きます。 RNAは、従来の第一鎖の反応により長い5分間（でも、氷上で）放置することはできません。 </li></ol></li><li> 表1に記載したように氷上で第一鎖合成反応ミックスを設定します。 注：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li>その後、1分間室温で280×gで遠心し、RNA /プレート内のランダムプライマーミックス、やさしく、徹底的にボルテックスに追加します。 10分間25°C - 22でインキュベートします。 </li><li> 60分間空気インキュベーター中、55℃でインキュベートします。反応を停止し、氷上でプレートを置きます。しませんE：空気インキュベーターの使用は、プライマーのアニーリングおよび第一鎖が細長くし始める時の第一鎖反応の漸進的な温暖化を作成することをお勧めします。 </li></ol></li><li> 表1に記載したように氷上で第二鎖合成反応ミックスを設定します。 注：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li> 、プレート内の第一鎖合成反応に追加やさしく、徹底的にボルテックスし、1分間室温で280×gで遠心します。 16°C（25°Cで蓋を保つ）で2時間インキュベートします。温度が16°Cを超えないようにしてください。 </li><li>次いで1分間室温で280×gで遠心分離し、静かによく混ぜ、0.5 M EDTAを5μlを加えて反応を不活性化、氷上にプレートを置きます。 </li></ol></li><li>ビーズの1.8倍の容量（153μl）を用いてDNAビーズ（プロトコルのためのステップ1.3を参照）でクリーンアップ。溶出緩衝液（EB）の9μlの溶出。定量化のための1μLを保存します。 subsequeのcDNA 1ngのを使用しますNTの手順を実行します。 cDNA濃度は、検出tagmentationのcDNAを4μlのを使用することが低すぎる場合（ステップ4.1参照）。 </li><li>長期保存のための安全な冷蔵、C°4°CO / Nまたは-20ストア二本鎖cDNAのため。 </li></ol> 4.ライブラリの準備 - DNAライブラリーの構築（〜4時間） <ol><li> cDNAの転送4μlを96ウェルプレートに、必要な場合は、2番目の試みのために残りのcDNAを保存します。 </li><li> 表1に記載されているように氷上でtagmentation反応を設定します。 注：マスターミックスを調製することができます。背景と全体的なコストを削減するために、tagmentation反応の総容量は、20〜10マイクロリットルから減少されます。 cDNAを制限する要因であるように、反応に用いられるATM（ すなわち、transposome）の量はまた、組み込み部位の数を減少させるために減少されます。 <ol><li> 1分間（室温で）280×gで静かに、徹底的に、プレートにcDNAに渦をtagmentationミックスを追加し、遠心分離機。5分間55℃でインキュベートし、10℃で保持します。 </li><li>いったん10℃で、すぐに反応を終了するために中和するTagmentバッファー（NT）の2.5μlを添加します。その後、1分間（室温で）280×gで遠心し、上下にピペッティングにより混和します。 </li><li>室温で5分間インキュベートします。 </li></ol></li><li> 表1に記載されているように氷上でPCR増幅反応を設定します。 <ol><li>やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 </li><li> 表1に記載の条件を用いて、サーマルサイクラーにPCRを行います。 注：PCRの12サイクルはtagmented cDNAの1 ngのために提案されています。しかし、ウイルスの臨床サンプルは、多くの場合、cDNAの検出不可能な量を持っています。 cDNAを（&lt;1 ngの）低量のために、配列決定のために十分なライブラリーを作成するために、PCRの18サイクルまで使用しています。 </li></ol></li><li>ライブラリの準備 - クリーンアップおよび配列決定のためのプール<ol><li> EB 50μlにサンプルを起動します。 </li><li>とクリーンアップ0.6x量（30μl）をビーズを用いたDNAビーズ（プロトコルのためのステップ1.3を参照してください）​​。 15μlのEBで溶出します。 </li><li>領域分析からプライマーダイマー（〜120 bp）を除く、バイオアナライザソフトウェア9を使用して、領域分析（150〜1,000 bp）を行うことにより、ライブラリーの濃度（ 図3）を決定します 。注：また、定量PCRは、ライブラリ10を定量するために使用することができます。 </li><li> 1 nMもしくはそれ以上の最低のモル濃度でプールライブラリ。ライブラリが1nm未満の場合、これらのライブラリーからの配列情報を取得するために、プール（他のライブラリの〜1倍容量）に、ライブラリの少量を加えます。 </li><li>上記のように0.7倍のDNAビーズとクリーンアッププール（ステップ2を参照）。 15μlのEBで溶出します。注：ビーズのボリュームプールの最終容積に依存するであろう。 </li><li>プール9を分析します。領域分析（150〜1,000 bp）の9を行うことにより、モル濃度を決定します。注：また、定量PCRは、ライブラリープール10を定量するために使用することができます&lt;/ SUP&gt;。 </li><li>デュアルバーコード11を読み取ると10pMの101塩基対を生成するためのライブラリ濃度のロードシーケンサは、ペアエンドを読み込みます。 </li></ol></li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> 4代表的なエボラウイルス（EBOV）ライブラリのエボラウイルス臨床サンプル。ゲル画像から構築図3.ライブラリ 。ライブラリとプライマーダイマーの領域が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The authors have no competing financial interests.

概説的なアプローチは、堅牢、普遍的、迅速なシーケンシングを可能にし、2014年流行の2,4の間にエボラウイルスの配列を決定するために使用されました。 tagmentationライブラリー構成の選択的枯渇及びcDNA合成を結合することにより、全体の処理時間は、前のアダプターライゲーション方法から1~2日後に減少しました。最近では、このプロトコルは大成功15,16との国際共同研究者らによって採用されたと地元ゲノミクスベースの調査研究および診断17をサポートするために西アフリカのラボに展開されます。 ここで説明するプロトコルは、ウイルスRNA-seqのライブラリのcDNAを準備するために、ランダムプライマーを使用しています。前回のウイルスRNA-seqのアプローチとは異なり、それは特定のウイルスまたはクレードのための配列データや精巧で時間のかかるプライマー設計の事前知識を必要としません。この方法は、任意のウイルスRNA試料に適用することができます。例えば、エボラウイルスの両方からコンテンツを生成するために使用されましたそして、ラッササンプル6。プロトコルは、ホスト・トランスクリプトーム、メタゲノムおよび病原体検出の配列決定プロジェクト1のために使用することができます。 プロトコルの重要なステップは、RNアーゼH消化、高スループット、ウイルスのサンプルから不要なキャリアと宿主RNAを除去するための低コストの方法を対象としています。プロトコルの選択的枯渇のステップは、多くのコンポーネントを使用し、スキルと精度を必要とします。余分な時間とケアは、初期設定時に注意すべきです。 ほとんどの臨床血清および血漿サンプルは、多くの場合、非常に少ない核酸物質を有するので、汚染および試料の損失が一般的です。このプロトコルを使用する場合、これらの問題を回避するために、特別な注意が払われるべきです。まず、RNAが分解に対して非常に敏感です。したがって、すべてのエリアは清潔でヌクレアーゼの自由であるべきです。第二に、このプロトコルで使用するのに適したサンプルを識別するために、宿主RNAとウイルスの両方のためのqRT-PCRアッセイは、定量5,6のために使用されるべきです</suP&gt;。入力を比較すると、少なくとも100 pgのトータルRNAとウイルスの千のコピーを含まれるサンプルと相関プロトコル、シークエンシングの成功（フルウイルス構築のための十分なデータがすなわち、発生）からの配列決定の結果に相当します。第三に、核酸の環境源への曝露を避けるべきです。ここで概説プロトコルは、安全上の注意事項は、環境汚染物質を制限するための安全キャビネットで行われます。また、当社グループなどが市販酵素は、低入力サンプル6,18中の細菌の核酸を汚染する別の源になる可能性があることに気づきました。クリーンな作業領域（ 例えば 、PCRフード、安全キャビネット）および陰性対照（ 例えば 、水または緩衝液）の使用は、それぞれ、軽減と汚染を追跡します。 &lt;全RNAの100 pgの、唯一のポリ（RA）キャリアRNA、ないのrRNAとサンプルについては、材料の損失を制限しながら、高品質の配列決​​定結果を確実にするために枯渇されるべきです。以下のために非常にポリ（RA）キャリアはcDNA合成の前に除去しなければならないが、低入力サンプルは、cDNAの増幅方法は、19より適切であり得ます。 宿主rRNAの枯渇は、配列ライブラリー中のウイルス含有量を富化し、血清又は血漿、及びげっ歯類および非ヒト霊長類5,6からの組織の複数のタイプを含む異なるサンプルのコレクションに適用可能です。ヒト以外の生物では、28S rRNAのに整列させることは28S rRNAのは、人間と他の種6,20間の少ない保存されて示唆し、枯渇した後に残った読み取り。非ヒト分離株で、この方法を使用する場合、特定のホスト3,21の発散rRNA配列に相補的なDNAオリゴと補完する必要があるかもしれません。 プロトコルは公平であるので、ウイルスは、全ライブラリの内容のごく一部を表すことができる読み取ります。 rRNAが宿主RNAの最も豊富な種であるとrRNAのわずかな割合は、（読み込みが0;）1％が選択的枯渇後に発見され、他のすべての宿主RNA（ 例えば 、mRNA）が枯渇した後に残る、多くのシーケンシングは、サンプルからの読み取りを説明することができます。したがって「オーバーサンプリング」（ すなわち 、oversequencing）個々のライブラリは、ウイルスアセンブリおよびバリアントの呼び出しのための十分なカバレッジを持っているために必要とされます。私たちの研究のために、私たちは順番にしよう〜2000万は、ウイルスゲノムおよび関連する変異体の解析のために十分な深さだけでなく、メタゲノムコンテンツ2,5を持っているために、サンプルごとに読み込みます。メタゲノムおよび病原体検出の研究のために、汚染宿主DNAは、DNアーゼ消化によって除去されることに留意することが重要です。したがって、ウイルスおよびDNAゲノムを含む他の病原体は、しかし、RNA中間体がまだ配列決定され得る、プロセスの間に失われることがあります。

臨床情報源からのウイルスの次世代シーケンシングは、送信および感染症の疫学、ならびに診断ヘルプサポート小説、ワクチンや治療の開発に知らせることができます。ランダムプライマーを用いてcDNA合成は、検出およびアセンブリ発散からゲノムの共感染あるいは新規ウイルス1,2を可能にしました。他の公正な方法と同様に、不要な汚染物質は、多くのシーケンシングを読み取って、負の配列決定の結果に影響を与える占めます。ホストおよびポリ（RA）キャリアRNAは、多くの既存のウイルスサンプルのコレクションに存在する汚染物質です。 プロトコルは公平全RNA-seqのに基づいて、深いシーケンシングRNAウイルスのゲノムの効率的かつ費用対効果の高い方法を説明します。この方法は、不要なホストリボソームとキャリアRNAを除去するためのRNase H選択的枯渇のステップ3を利用しています。選択的枯渇は、ウイルスコンテンツ（ 図1）のために豊かにし、配列決定データの全体的な品質を向上させます臨床サンプルから（ 図2）。また、tagmentationは、著しくライブラリー構築時間を低減するようなプロトコルに適用されます。これらの方法は、迅速にエボラおよびラッサウイルスゲノム2,4,5の大規模なデータセットを生成するために使用されており、RNAウイルスの広い範囲を研究するために使用することができます。最後に、このアプローチは、ヒトのサンプルに限定されるものではありません。選択的な枯渇の有用性は、ラッサ感染げっ歯類および非ヒト霊長類疾患モデル5,6から採取した組織サンプルで実証されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> 図1.全RNAのコンテンツは、コンテンツ全体（RNA入力）を開始しています。選択的枯渇を使用したラッサウイルス、コンテンツの充実を反映し、ユニークなラッサウイルス（LASV）の濃縮は、9つの異なる臨床分離株からのrRNA枯渇時（ライブラリコンテンツ）を読み込みます。この図は、6から変更されています<em&gt;。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> 図2.品質向上シングキャリアRNA枯渇。ポリシークエンシングサイクル（RA）あたりの中央値ベースの資質は、ラッサウイルスライブラリ（赤）とQCレポート13からの制御（黒ライブラリに観察されなかったキャリアを、）-contaminated 後 。両方が1を読み、ペアエンドの2を読んで、ライブラリのBAMファイルにマージされ、品質スコアは、各ベースで示されている読み込みます。この図は、6から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 抽出から直接ライブラリのウイルスRNA-seqのプロトコルの詳細建設RNAは、臨床的および生物学的サンプルから収集します。個人の安全を確保するために、全てのウイルスの血清、血漿および組織サンプルは、RNA抽出前に適切な緩衝液で不活性化されるべきです。いくつかの不活性化および抽出キットにおいて、キャリアポリ（RA）RNAが含まれています。これは初期のRNase H選択的枯渇ステップの間に削除されます。完全な回復に基づいて、キャリアRNAの予想濃度は100 ngの/μlです。プロトコルでは、110 ngの/μlのオリゴdT RNA（1.1倍のキャリア濃度）を枯渇するために使用されます。ポリ（RA）担体が試料中に存在しない場合は、オリゴ（dT）が枯渇する前に添加されるべきではありません。 以下のプロトコルは、（250μlの容量まで）PCRプレート形式で24の反応のために設計されています。このプロトコルの以前のバージョンはMatranga らに報告された。6。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="965">
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:376px;">96-Well PCR Plates</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">47743-953</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Strips of Eight Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47745-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>50 ml bottle</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">TURBO DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td>post RNA extraction step, 2 U/&#181;L, buffer included</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">PCR cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any PCR cyclers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Agencourt RNAClean XP SPRI beads&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td>A63987</td>
			<td>beads for RNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Real Time qPCR system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any system</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">qRT-PCR primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">5M NaCl&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M Tris-HCl pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2663-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M Tris-HCl pH 7.5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M MgCl2&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Linear acrylamide&#160;</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM9520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DNA oligos covering entire rRNA region</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>see Table 3, order lab-ready at 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Oligo (dT)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>40 nt long, desalted</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Hybridase Thermostable RNase H&#160;</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>H39100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">RNase-free DNase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>post selective depletion step</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">SUPERase-In RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Random Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>48190-011</td>
			<td>mostly hexamers</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">10 mM dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">SuperScript III Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>with first-strand buffer, DTT</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Air Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any air incubator cyclers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6117S</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli DNA Ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0205L</td>
			<td>10 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli DNA Polymerase I&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0209L</td>
			<td>10 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli RNase H&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0297L</td>
			<td>2 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">0.5M EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Agencourt AMPure XP SPRI beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td>A63881</td>
			<td>beads for DNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Elution Buffer&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Qubit fluorometer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nextera XT DNA Sample Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nextera XT DNA Index Kit&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Tapestation 2200</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">BioAnalyzer 2100&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity DNA reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Library Quantification Complete kit (Universal)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

ここでは、 デノボアセンブリおよび臨床的および生物学的供給源から収集されたウイルスゲノムのホスト内のバリアントの呼び出しを可能にする次世代のRNAの塩基配列決定プロトコルの概要を説明します。この方法は、公平かつ普遍的です。それは、cDNA合成のためのランダムプライマーを使用し、ウイルス配列のコンテンツの予備知識を必要としません。含むポリ（RA）キャリアとリボソームRNA - - ウイルスRNAサンプルからライブラリー構築する前に、選択のRNase Hベースの消化は、不要なRNAを枯渇させるために使用されます。選択的枯渇は、データ品質とウイルスRNAシーケンシングライブラリを読み込んでユニークな数の両方を向上させます。それは全体のライブラリー構築時間を低減するようにまた、トランスポザーゼ系」tagmentation」ステップは、プロトコルで使用されています。プロトコルは、血液および組織の両方からの600以上のラッサ熱とエボラウイルスサンプル-を含むコレクションの急速な深いシーケンシングは、隔離、および他の微生物ゲノム研究に広く適用可能である可能となりました。

記載されているプロトコルは、固有のウイルスのコンテンツを充実しつつ、高品質なシーケンシングの発生は、低入力ウイルスRNAサンプルから読み取ることができます。 図1に示すように 、プロトコルは、一意ラッサウイルス含有量が、少なくとも18S rRNAの少なくとも一つ万枚（約100 pgのトータルRNA）を用いて（非枯渇した対照と比較して）すべての試料の5倍濃縮されました。同様に、シークエンシングの成功はまた、与えられた試料中のウイルス量と相関していました。ウイルス量の代用〜ほとんどの場合、完全なアセンブリを作成した1000以上のウイルスゲノムコピーを含有サンプルとして定量RT-PCRを使用して（データは示さず）。また、ポリデプレッション（RA）キャリアクリーナー製剤が得られる、ライブラリー中のAとTのホモポリマー配列を低減し、より高品質の配列決定を確保する（ 図2）を読み出します。低入力から最終的なライブラリーは、ウイルスの臨床サンプルは、多くの場合、150〜1,000塩基対から広い断片長を有します（ 図3）。 配列決定の後、プール12内のライブラリ間のサンプルの誤認やクロストークを低減するために、唯一のインデックスが25（Q25）のベース品質スコアで読み取り、ゼロ不一致が分離プロセス中に保たれていることを確認します。ウイルスゲノムは、発散ウイルス2,4-6のための具体的なバイオインフォマティクスパイプラインを使用して組み立てられています。これらのツールは、https://github.com/broadinstitute/viral-ngsで、または商用クラウドプラットフォーム4を介して使用できます。 <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ステップ1.1：DNアーゼ反応 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のDNaseバッファー</td><td> 7 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 6 </td></tr><tr><td>抽出されたウイルスRNA </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNアーゼ（2 U /＆＃181;リットル） </td><td> 2 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 70 </td></tr><tr><td> ステップ2.1：5×ハイブリダイゼーションバッファー </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td> 1ミリリットルのための容量（μL） </td></tr><tr><td> 5 M NaClを</td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 Mトリス-HCl（pH7.4） </td><td> 500 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 300 </td></tr><tr><td>全容積</td><td>千</td></tr><tr><td> ステップ2.1：10倍のRNase H反応バッファー </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td> 1ミリリットルのための容量（μL） </td></tr><tr><td> 5 M NaClを</td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 Mトリス-HCl（pH7.5） </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 MのMgCl 2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 500 </td></tr><tr><td>全容積</td><td>千</td></tr><tr><td> ステップ2.1：水のwi番目の直鎖状アクリルアミド</td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td> 1ミリリットルバッファの容量（μL） </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 992 </td></tr><tr><td>直鎖状アクリルアミド（5 mg / mlで） </td><td> 8 </td></tr><tr><td>全容積</td><td>千</td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ2.2：選択的枯渇するためのハイブリダイゼーション反応 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 5×ハイブリダイゼーションバッファー</td><td> 2 </td></tr><tr><td> rRNAを枯渇オリゴミックス（100μM） </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td>オリゴ（d）のT（550 NG /μL） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNアーゼ処理した総RNA </td><td> 5まで</td></tr><tr><td>スパイクにRNA（これはオプションです） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> （直鎖状アクリルアミドとの）水</td><td> 10総に持ち出します</td></tr><tr><td>総volu私に</td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ2.3：選択的枯渇のためのRNase H反応 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のRNase H反応緩衝液</td><td> 2 </td></tr><tr><td> （直鎖状アクリルアミドとの）水</td><td> 5 </td></tr><tr><td>耐熱性リボヌクレアーゼH（5 U /μl）を</td><td> 3 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ2.4：DNアーゼ反応後の選択的枯渇 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のDNaseバッファー</td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> （直鎖状アクリルアミドとの）水</td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> RNaseインヒビター（20 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNaseフリーのDNase I（2.72 U /μl）を</td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> （RNアーゼHの反応を含む）の合計量</td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ3.1：cDNA合成、ランダムプライマーハイブリダイゼーション </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> rRNA /キャリアが枯渇したRNA </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3μgのランダムプライマー</td><td> 1 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 11 </td></tr><tr><td> 第一鎖cDNA合成反応：3.2手順 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td> 5Xファーストストランド反応緩衝液</td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10mMのdNTPミックス</td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNaseインヒビター（20 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td>逆転写酵素（最後の追加） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> （上記RNAとの）総容量&lt;/ TD&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ3.3：第二鎖cDNA合成反応 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td> RNaseフリー水</td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10倍の第二鎖反応緩衝液</td><td> 8 </td></tr><tr><td> 10mMのdNTPミックス</td><td> 3 </td></tr><tr><td> 大腸菌 DNAリガーゼ（10 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 大腸菌 DNAポリメラーゼI（10 U /μl）を</td><td> 4 </td></tr><tr><td> 大腸菌のRNase H（2 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td> （第1鎖反応を含む）全体積</td><td> 80 </td></tr><tr><td> ステップ4.2：Tagmentation反応 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td>アンプリコンTagmentミックス（ATM） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNAバッファー（TD） </tD&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> （cDNAでの）総体積</td><td> 10 </td></tr><tr><td> ステップ4.3：ライブラリーのPCR反応 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td> PCRマスターミックス（NPM） </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td>インデックス1プライマー（I7） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td>インデックス2プライマー（I5） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> （tagmented cDNAでの）総体積</td><td> 25 </td></tr><tr><td> ステップ4.3.2：ライブラリPCR条件 </td><td></td></tr><tr><td> 72℃、3分</td><td></td></tr><tr><td> 95℃、30秒</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 95℃で18サイクル、10秒、55℃で30秒、30秒まで72℃で</td></tr><tr><td> 72℃、5分</td><td></td></tr><tr><td>永遠に10°C、 </td><td></td></tr></tbody></table>表1：反応セットアップおよびバッファステップバイステップの全てのバッファとの反応混合物の内容を持つテーブル。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> オリゴ名 </td><td> 配列（5 &#39;から3&#39;） </td></tr><tr><td>エボラKGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td>エボラKGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td>エボラKULESH FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td>エボラKULESH RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td>ラッサSL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYAのAABのCC </td></tr><tr><td>ラッサSL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNAのFW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNAのRV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tことができます&gt; 表2：定量RT-PCRプライマー配列ホスト（18SリボソームRNA）およびウイルス（エボラおよびラッサ）含量を測定するために使用したプライマー。 「KGHは「エボラプライマーは2を試験したシエラレオネ、中ケネマ政府病院です。 「Kuleshは&#39;プライマーセット14設計研究者です。 表3：リボソームRNA（rRNAの）枯渇オリゴ選択的枯渇のステップ6のためのヒトのrRNAに相補的な195の50ヌクレオチド長の配列が、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

臨床サンプルからのRNAウイルスの公平なディープシーケンシング

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K ビュー.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

ビデオ: Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

医学

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

アダプティブ脳深部刺激とパーキンソン病の防除

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

腫瘍溶解性ウイルスの前臨床評価のための研究のコットンラットの取扱い

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding the clonal composition changes that occur within a tumor in response to certain micro-environment or treatments may lead to the design of more sophisticated and effective approaches to eradicate tumor cells. However, tracking tumor clonal sub-populations has been challenging due to the lack of distinguishable markers. To address this problem, a VDJ-seq protocol was created to trace the clonal evolution patterns of diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) relapse by exploiting VDJ recombination and somatic hypermutation (SHM), two unique features of B cell lymphomas.
In this protocol, Next-Generation sequencing (NGS) libraries with indexing potential were constructed from amplified rearranged immunoglobulin heavy chain (IgH) VDJ region from pairs of primary diagnosis and relapse DLBCL samples. On average more than half million VDJ sequences per sample were obtained after sequencing, which contain both VDJ rearrangement and SHM information. In addition, customized bioinformatics pipelines were developed to fully utilize sequence information for the characterization of IgH-VDJ repertoire within these samples. Furthermore, the pipeline allows the reconstruction and comparison of the clonal architecture of individual tumors, which enables the examination of the clonal heterogeneity within the diagnosis tumors and deduction of clonal evolution patterns between diagnosis and relapse tumor pairs. When applying this analysis to several diagnosis-relapse pairs, we uncovered key evidence that multiple distinctive tumor evolutionary patterns could lead to DLBCL relapse. Additionally, this approach can be expanded into other clinical aspects, such as identification of minimal residual disease, monitoring relapse progress and treatment response, and investigation of immune repertoires in non-lymphoma contexts.

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-のSeq：B細胞リンパ腫のクローン進化のパターンを明らかに転位免疫グロブリン重鎖遺伝子のディープシーケンシング解析

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

正常および病的脳機能を研究するために脳深部刺激でSaccadometryを使用します

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

ラットにおける同所性肝細胞癌の局所領域治療のための腫瘍溶解性ウイルスのTransarterial管理

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

サンプリング戦略とブタの生物医学的モデルからバイオバンク組織サンプルの処理

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations often cause a distorted reading frame and premature stop codons, resulting in an almost total lack of dystrophin protein. The reading frame can be corrected using antisense oligonucleotides (AONs) that induce exon skipping. The morpholino AON viltolarsen (code name: NS-065/NCNP-01) has been shown to induce exon 53 skipping, restoring the reading frame for patients with exon 52 deletions. We recently administered NS-065/NCNP-01 intravenously to DMD patients in an exploratory investigator-initiated, first-in-human trial of NS-065/NCNP-01. In this methods article, we present the molecular characterization of dystrophin expression using Sanger sequencing, RT-PCR, and western blotting in the clinical trial. The characterization of dystrophin expression was fundamental in the study for showing the efficacy since no functional outcome tests were performed.

Here, we present the molecular characterization of dystrophin 38 expression using Sanger sequencing, RT-PCR, and western blotting in the clinical trial.

アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床試験におけるDMD患者サンプルにおけるエキソンスキップ効率の特徴付け

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

臨床サンプルからのRNAウイルスの公平なディープシーケンシング

要約

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