This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

declaração de ética: pacientes febre de Lassa foram recrutados para este estudo usando protocolos aprovados por comitês de assuntos humanos na Universidade de Tulane, Universidade de Harvard, o Instituto Broad, Irrua Specialist Hospital de Ensino (ISTH), Hospital Governo Kenema (KGH), Oyo Ministério da Saúde do Estado, Ibadan , Nigéria e Serra Leoa Ministério da Saúde. Todos os pacientes foram tratados com um padrão semelhante de cuidado e receberam a droga ribavirina, com ou sem eles decidiram participar do estudo. Para pacientes com febre de Lassa (LF), o tratamento com Ribavirina seguiu as diretrizes recomendadas atualmente e foi geralmente oferecido tão logo LF foi fortemente suspeito. Devido à grave surto de doença do vírus Ebola (EVD), os pacientes não poderiam ser consentido através de nossos protocolos padrão. Em vez disso utilização de amostras clínicas excesso de pacientes EVD foi avaliado e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional na Serra Leoa e na Universidade de Harvard. o Office do Comité de Serra Leoa Ética e de análise científica, a Serra Leoa Ministério da Saúde e Saneamento, e ao Comité de Harvard sobre o Uso de Seres Humanos ter concedido uma dispensa do consentimento para sequenciar e fazer sequências virais disponíveis publicamente obtidos a partir de amostras de pacientes e de contato coletadas durante o surto de Ebola em Serra Leoa. Esses órgãos também concedeu uso de dados clínicos e epidemiológicos para amostras identificou-de coletados de todos os pacientes suspeitos EVD recebem cuidados durante a resposta ao surto. A Serra Leoa Ministério da Saúde e Saneamento aprovou também as transferências de não-infecciosas amostras, não-biológicos de Serra Leoa para Broad Institute e da Universidade de Harvard para estudos genômicos de amostras de surto. 1. DNase-tratamento do RNA da amostra (até 55 jil de extracção de ARN total, ~ 4 h) <ol><li> Defina-se a reacção de ADNase numa placa de 96 poços de PCR em gelo numa cabine de segurança biológica tal como descrito na Tabela 1 </strong&gt;, Passo 1.1 (volume total, de 70 uL / ​​poço). Nota: A mistura principal pode ser preparado. </li><li> Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Limpeza usando fase sólida reversível imobilização (SPRI) grânulos de ARN. <ol><li> grânulos de RNA aquecimento à temperatura ambiente durante 30 minutos. </li><li> Agitar suavemente garrafa esferas de RNA para voltar a suspender as partículas magnéticas que podem se instalaram. Adicionar volume de 1,8x (126 ul) de grânulos de ARN para ARN tratado com ADNase (70 mL), mistura com uma pipeta de 10 vezes e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (o volume total no poço, 196 uL). </li><li> Coloque a mistura de na estação magnético. Aguarde até que a solução para limpar (5-10 min). </li><li> Remova a solução apagada, enquanto na estação com uma pipeta e descarte. Enquanto na estação, lavar grânulos através da cobertura de sedimento com etanol a 70% e incubar durante 1 min. Remover o etanol com pipeta e descarte. Repetir para um total de duas lavagens. Nota: O uso et precisamente 70% preparado de frescohanol é crítica, como uma percentagem mais elevada resultará na lavagem ineficiente de moléculas menores em tamanho, enquanto que &lt;70% de etanol poderia causar a perda de amostra 7. </li><li> Mantenha placa na estação e deixar em aberto a secar ao ar. Nota: Certifique-se de permitir que as contas para secar completamente até contas de começar a rachar. </li><li> Adicionar 55 ul de água isenta de nuclease para a placa para eluir o ARN. Retire a placa da estação para misturar os grânulos e água pipetando cuidadosamente. Nota: Em alternativa, usar menos água (≤ 10 uL), a fim de concentrar o ARN total. </li><li> Coloque placa de volta na estação. Aguardar até que a solução limpa para transferir por pipeta para novo tubo com tampa de rosca para o armazenamento a longo prazo (-80 ° C). Coloque 5 ul de ARN na nova placa de 96 poços de PCR para a depleção (passo. 2.4). </li><li> Opcional:. Excepto e dilui-se 1 ml em 19 ul de água (01:20) para qRT-PCR de rRNA (por exemplo, 18S, 28S rRNA) (Tabela 2) e os marcadores virais 5 &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. depleção selectiva de ribossomal e Carrier ARN a partir de ARN viral da amostra (~ 4 h) <ol><li> Adicione hibridação 5x e 10x tampões de reacção de RNase H, e água isenta de nuclease com o transportador linear de acrilamida, tal como descrito na Tabela 1. </li><li> Defina-se a reacção de hibridação através da combinação de ARN com oligos de depleção de rRNA (Tabela 3) e o oligo (dT) em gelo numa placa de 96 poços de PCR como descrito na Tabela 1. Nota: A mistura principal pode ser preparado. 50 femtogramas (fg) de um RNA sintético único (ERCCs 8) podem ser adicionados para acompanhar tanto o processo de sequenciamento viral e potencial índice de ler a contaminação cruzada. <ol><li> Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 95 ° C durante 2 min, rampa lento para 45 ° C a -0,1 ° C por segundo. Pause o termociclador a 45 ° C. </li></ol></li><li> Configurar RNase H mistura de reacção em gelo como descreverd na Tabela 1, em seguida, pré-aquecer a 45 ° C durante 2 min. Nota: A mistura principal pode ser preparado. <ol><li> Adicionar a mistura de RNase H de pré-aqueceu-se a reacção de hibridação em placa, mantendo a placa no termociclador a 45 ° C. </li><li> Misture bem por pipetagem suave 6 - 8 vezes. Incubar a 45 ° C durante mais 30 min. Coloque no gelo. </li></ol></li><li> Defina-se a mistura de reacção em gelo ADNase tal como descrito na Tabela 1 Nota:. A mistura principal pode ser preparado. <ol><li> Adicionar à reacção de RNase H em placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Pare ADNase reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5M. Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li></ol></li><li> Cleanup usando esferas de RNA (ver passo 1.3), utilizando um volume de 1,8x (144 mL) esferas. Eluir em 11 mL de água livre de nuclease. Nota: Para armazenamento a frio seguro, armazenamento esgotada RNA amostras a -80 ° C O / N. </li></ol> 3. Síntese de cDNA (~ 6 h) <ol><li> Mistura rRNA / ARN empobrecido-transportador com iniciadores aleatórios sobre gelo numa placa de 96 poços de PCR como descrito na Tabela 1, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. <ol><li> Aquecer a mistura a 70 ° C durante 10 minutos num termociclador. Imediatamente após a desnaturação pelo calor, colocar o ARN em gelo durante 1-5 minutos. Não permitir que o ARN em repouso (mesmo em gelo) durante mais de 5 minutos antes da reacção da primeira cadeia. </li></ol></li><li> Defina-se da primeira cadeia mistura de reacção de síntese em gelo tal como descrito na Tabela 1. Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada. <ol><li> Adicionar ao ARN / mistura de iniciadores aleatórios em placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar a 22 - 25 ° C durante 10 min. </li><li> Incubar a 55 ° C numa incubadora de ar durante 60 min. Colocar a placa em gelo para terminar a reacção. NãoE: O uso de uma incubadora de ar é recomendado para criar o aquecimento gradual da primeira cadeia de reacção durante o qual o recozimento iniciadores e a primeira cadeia começa a alongar-se. </li></ol></li><li> Defina-se da segunda cadeia mistura de reacção de síntese em gelo tal como descrito na Tabela 1. Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada. <ol><li> Adicionar à primeira cadeia de síntese de reacção na placa, de vórtice suave e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. Incubar durante 2 horas a 16 ° C (manter a tampa a 25 ° C). Não permitir que a temperatura subisse acima de 16 ° C. </li><li> Colocar a placa sobre gelo, em seguida, inactivar reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M, mistura suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li></ol></li><li> Limpeza com contas de DNA (veja o passo 1.3 para o protocolo) usando volume de 1,8x (153 mL) de contas. Eluir em 9 ul de tampão de eluição (EB). Salve 1 ul para quantificação. Use de 1 ng de cDNA para subsequepassos NT. Se a concentração de cDNA é muito baixo para detectar, utilize 4 l de cDNA para tagmentation (veja o passo 4.1). </li><li> Para o armazenamento a frio, armazene ADNc de cadeia dupla a 4 ° CO / N ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 4. Biblioteca de Preparação - Construção de ADN da biblioteca (~ 4 h) <ol><li> Transferência 4 uL de ADNc a uma placa de 96 poços e guardar o restante ADNc para uma segunda tentativa, se necessário. </li><li> Defina-se a reacção tagmentation em gelo tal como descrito na Tabela 1. Nota: Um mestre de mistura pode ser preparada. Para reduzir o fundo e o custo total, o volume total da reacção tagmentation é reduzida de 20 a 10 ul. Como ADNc é o factor limitante, a quantidade de ATM (ou seja, transposome) usado na reacção é também reduzida para diminuir o número de sítios de integração. <ol><li> Adicionar mistura tagmentation de ADNc na placa, de vórtice suave e completamente e centrifugar a 280 xg (à TA) durante 1 min.Incubar a 55 ° C durante 5 min, manter a 10 ° C. </li><li> Uma vez a 10 ° C, adicionar imediatamente com 2,5 mL de tampão de Neutralizar Tagment (NT) para terminar a reacção. Misturar por pipetagem cima e para baixo, em seguida, centrifugar a 280 xg (à temperatura ambiente) durante 1 min. </li><li> Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li></ol></li><li> Defina-se a amplificação por PCR da reacção em gelo tal como descrito na Tabela 1. <ol><li> Vortex suavemente e completamente, em seguida, centrifugar a 280 xg à temperatura ambiente durante 1 min. </li><li> Executar PCR no termociclador utilizando as condições descritas na Tabela 1. Nota: 12 ciclos de PCR são sugeridos para 1 ng de ADNc tagmented; No entanto, as amostras clínicas virais têm frequentemente quantidades indetectáveis ​​de ADNc. Para pequenas quantidades de cDNA (&lt;1 ng), utilizar até 18 ciclos de PCR para criar biblioteca suficiente para sequenciamento. </li></ol></li><li> preparação Biblioteca - limpeza e de partilha para a sequenciação <ol><li> Trazer amostra até 50 ul com EB. </li><li> Limpeza comgrânulos de DNA (veja o passo 1.3 para o protocolo), utilizando o volume de 0,6x (30 ul) grânulos. Eluir em 15 mL EB. </li><li> Determinar a concentração de biblioteca (Figura 3) através da realização de análise região (150 a 1000 pb), utilizando o software Bioanalyzer 9, excluindo dímeros de iniciadores (~ 120 pb) a partir de análise região. Nota: Em alternativa, qPCR pode ser utilizado para quantificar as bibliotecas 10. </li><li> bibliotecas piscina na concentração molar menor de 1 nM ou superior. Se biblioteca é inferior a 1 nM, adicionar um pequeno volume de biblioteca para piscina (~ 1x o volume de outras bibliotecas) para capturar informação de sequência a partir destas bibliotecas. </li><li> piscina de limpeza com contas de DNA 0,7x, conforme descrito acima (veja o passo 2). Eluir em 15 mL EB. Nota: O volume de grânulos irá depender do volume final da piscina. </li><li> Analisar piscina 9. Determinar a concentração molar através da realização de análise região (150 a 1000 pb) 9. Nota: Em alternativa, qPCR pode ser utilizado para quantificar piscina biblioteca 10 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Carga sequenciador na concentração biblioteca 22:00 para gerar 101 pb, emparelhado-end lê com dual código de barras lê 11. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> Figura 3. bibliotecas construídas a partir de vírus Ebola amostras clínicas. Image Gel de 4 de representante do vírus Ebola bibliotecas (EBOV). Regiões de biblioteca e de primers dímeros são apresentados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol>
	<li>Stremlau, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+rhabdoviruses+in+the+blood+of+healthy+individuals+from+West+Africa.">Discovery of novel rhabdoviruses in the blood of healthy individuals from West Africa.</a> PLoS Negl Trop Dis. 9, e0003631 (2015).</li><li>Gire, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+surveillance+elucidates+Ebola+virus+origin+and+transmission+during+the+2014+outbreak.">Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak.</a> Science. 345, 1369-1372 (2014).</li><li>Morlan, J. D., Qu, K., Sinicropi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+rRNA+enables+whole+transcriptome+profiling+of+archival+fixed+tissue.">Selective depletion of rRNA enables whole transcriptome profiling of archival fixed tissue.</a> PLoS One. 7, e42882 (2012).</li><li>Park, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+Virus+Epidemiology,+Transmission,+and+Evolution+during+Seven+Months+in+Sierra+Leone.">Ebola Virus Epidemiology, Transmission, and Evolution during Seven Months in Sierra Leone.</a> Cell. 161, 1516-1526 (2015).</li><li>Andersen, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Sequencing+Uncovers+Origins+and+Evolution+of+Lassa+Virus.">Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa Virus.</a> Cell. 162, 738-750 (2015).</li><li>Matranga, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+methods+for+unbiased+deep+sequencing+of+Lassa+and+Ebola+RNA+viruses+from+clinical+and+biological+samples.">Enhanced methods for unbiased deep sequencing of Lassa and Ebola RNA viruses from clinical and biological samples.</a> Genome Biol. 15, 519 (2014).</li><li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+analysis+to+capture+the+transcriptome+landscape+of+a+single+cell.">RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell.</a> Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+spike-in+standards+for+RNA-seq+experiments.">Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments.</a> Genome Res. 21, 1543-1551 (2011).</li><li>. Kapa Biosystems Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2015)</li><li>. Illumina Technologies Available from: <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2015)</li><li>Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+indexing+overcomes+inaccuracies+in+multiplex+sequencing+on+the+Illumina+platform.">Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform.</a> Nucleic Acids Res. 40, 3 (2012).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am J Trop Med Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+high-resolution+analysis+of+blood+virome+and+host+cytokines+expression+profile+of+a+patient+with+fatal+H7N9+infection+by+massively+parallel+RNA+sequencing.">Serial high-resolution analysis of blood virome and host cytokines expression profile of a patient with fatal H7N9 infection by massively parallel RNA sequencing.</a> Clin Microbiol Infect. 21, 713 (2015).</li><li>Simon-Loriere, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+lineages+of+Ebola+virus+in+Guinea+during+the+2014+West+African+epidemic.">Distinct lineages of Ebola virus in Guinea during the 2014 West African epidemic.</a> Nature. 524, 102-104 (2015).</li><li>Folarin, O. A., Happi, A. N., Happi, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empowering+African+genomics+for+infectious+disease+control.">Empowering African genomics for infectious disease control.</a> Genome Biol. 15, 515 (2014).</li><li>Blainey, P. C., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+MDA+for+enumeration+of+total+nucleic+acid+contamination.">Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination.</a> Nucleic Acids Res. 39, 19 (2011).</li><li>Malboeuf, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+viral+RNA+genome+sequencing+of+ultra-low+copy+samples+by+sequence-independent+amplification.">Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification.</a> Nucleic Acids Res. 41, 13 (2013).</li><li>Gonzalez, I. L., Sylvester, J. E., Smith, T. F., Stambolian, D., Schmickel, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+RNA+gene+sequences+and+hominoid+phylogeny.">Ribosomal RNA gene sequences and hominoid phylogeny.</a> Mol Biol Evol. 7, 203-219 (1990).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nat Methods. 10, 623-629 (2013).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

A abordagem descrita permite robusta, universal sequenciamento, rápido e foi usado para sequenciar o vírus Ebola durante a 2,4 2.014 surto. Ao acoplar a depleção selectiva de síntese de ADNc e com a construção da biblioteca tagmentation, o tempo total de processo foi reduzida em aproximadamente 2 dias de métodos adaptador de ligação anteriores. Mais recentemente, este protocolo foi empregado por colaboradores internacionais e outros com grande sucesso 15,16 e será implantado em laboratórios na África Ocidental para apoiar estudos de investigação genómica baseada em locais e diagnósticos 17. O protocolo aqui descrito utiliza iniciadores aleatórios para preparar bibliotecas de ADNc para ARN-SEQ virais. Ao contrário de abordagens de ARN-virais SEQ anteriores, que não requer um conhecimento a priori de dados de sequências ou design elaborado e demorado de iniciadores para um vírus ou subtipo específico. O método pode ser aplicado a qualquer amostra de ARN viral. Por exemplo, ele foi usado para gerar conteúdo viral de ambos Ebolae amostras de Lassa 6. O protocolo também pode ser utilizado para transcriptómica hospedeiro, projectos de sequenciação e detecção de agentes patogénicos metagenomic 1. Uma etapa fundamental do protocolo é a digestão alvo ARNase H, um de elevado rendimento, o método de baixo custo para a remoção indesejada transportadora e ARN do hospedeiro a partir de amostras virais. O passo de depleção selectiva do protocolo utiliza muitos componentes e requer habilidade e exactidão. tempo e cuidado extra deve ser tomado durante a configuração inicial. Como a maioria das amostras de soro e plasma clínicos muitas vezes têm muito pouco material de ácido nucleico, contaminação e perda de amostra são comuns. Para evitar esses problemas, cuidados especiais devem ser tomados ao usar este protocolo. Primeiro, o ARN é altamente susceptível à degradação; portanto, todas as áreas devem estar limpas e livres de nucleases. Em segundo lugar, para identificar amostras adequadas para utilização no presente protocolo, ensaios de qRT-PCR para ambos ARN do hospedeiro e vírus deve ser utilizado para quantificação 5,6 </sup&gt;. Quando se compara a entrada com montantes de sequenciação resultados do protocolo de sequenciação, o sucesso (isto é, geração de dados suficientes para a montagem virai completo) correlacionaram-se com as amostras que continham pelo menos 100 pg de RNA total e 1.000 cópias do vírus. Em terceiro lugar, a exposição a fontes ambientais de ácidos nucleicos devem ser evitados. O protocolo descrito aqui é feito de uma cabine de segurança biológica para precauções de segurança e para limitar contaminantes ambientais. Além disso, o nosso grupo e outros têm notado que as enzimas comerciais, podem ser outra fonte de ácidos nucleicos contaminantes bacterianos em amostras de entrada baixa 6,18. O uso de um espaço de trabalho limpo (por exemplo, capô PCR, cabine de segurança biológica) e controlos negativos (por exemplo, água ou tampão) vai ajudar a aliviar e controlar a contaminação, respectivamente. Para amostras com &lt;100 pg de ARN total, apenas de poli (rA) RNA transportador, não ARNr, deve ser esgotado para assegurar resultados de sequenciação de alta qualidade, evitando a perda de material. por muitoamostras de entrada baixas, métodos de amplificação de cDNA pode ser mais adequado 19, apesar de poli (rA) transportador deve ser removido antes da síntese de ADNc. A depleção de acolhimento rRNA enriquece para conteúdo viral em bibliotecas de sequenciação e é aplicável a diferentes colecções de amostras incluindo plasma ou soro, e vários tipos de tecidos de roedores e primatas não-humanos 5,6. Em organismos não humanos, as leituras de alinhamento 28S rRNA permaneceu após esgotamento, sugerindo 28S rRNA é menos conservada entre humanos e outras espécies de 6,20. Ao utilizar este método com estirpes não-humanos, pode ser necessário para completar, com oligos de ADN complementares às sequências de rRNA 3,21 divergentes do hospedeiro específico. Como o protocolo é imparcial, viral lê podem representar apenas uma pequena fração do conteúdo total de biblioteca. Embora rRNA é a espécie mais abundante de ARN do hospedeiro e apenas uma pequena percentagem de rRNA lê (0; 1%) são encontrados após a depleção selectiva, todos os outros ARN do hospedeiro (por exemplo, ARNm) permanecerá depois de exaustão e pode ser responsável por muitos sequenciação lê a partir da amostra. Portanto &quot;oversampling&quot; (ou seja, oversequencing) bibliotecas individuais é necessária, a fim de ter uma cobertura suficiente para chamadas de montagem e de variantes virais. Para os nossos estudos, tentamos sequência de ~ 20 milhões de leituras por amostra ter profundidade suficiente para a análise de variantes genômica e associado viral, bem como conteúdo metagenomic 2,5. Para os estudos de descoberta metagenomic e organismos patogénicos, é importante notar que a contaminação de ADN do hospedeiro é removido por digestão de DNase. Por conseguinte, os vírus e outros agentes patogénicos que contêm genomas de ADN podem ser perdidas durante o processo, no entanto intermediários de RNA pode ainda ser sequenciado.

geração de sequenciamento próxima de vírus a partir de fontes clínicas pode informar transmissão e epidemiologia das infecções, bem como ajuda o apoio romance de diagnóstico, vacinas e desenvolvimento terapêutico. síntese de cDNA utilizando iniciadores aleatórios permitiu a detecção e montagem de genomas de divergente, co-infectante ou mesmo novos vírus 1,2. Tal como acontece com outros métodos imparciais, contaminantes indesejados ocupam muitos sequenciamento lê e impactar negativamente os resultados de sequenciamento. Host e poli RNA transportador (RA) são contaminantes presentes em muitas colecções de amostras virais existentes. O protocolo descreve de forma eficiente e rentável de genomas virais de ARN sequenciamento profundas com base em preconceitos RNA-seq total. O método utiliza uma depleção selectiva passo 3 ARNase H para remover ribossomal hospedeiro indesejado e ARN transportador. Depleção selectiva enriquece para conteúdo viral (Figura 1) e melhora a qualidade global dos dados de sequenciação(Figura 2) a partir de amostras clínicas. Além disso, tagmentation é aplicada ao protocolo, uma vez que reduz significativamente o tempo de construção da biblioteca. Estes métodos têm sido usados ​​para gerar rapidamente grandes conjuntos de dados do Ebola e Lassa genomas de vírus 2,4,5 e pode ser usado para estudar uma grande variedade de vírus de ARN. Por último, a abordagem não está limitado a amostras humanas; a utilidade da depleção selectiva foi demonstrada em amostras de tecidos obtidas de roedores de Lassa-infectadas e modelos de doença de primatas não humanos 5,6. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> Figura 1. Total de RNA conteúdo reflete Enriquecimento de conteúdo Vírus Lassa Usando Selective esgotamento. A partir conteúdo global (entrada RNA) e enriquecimento do vírus original Lassa (LasV) lê (teor Library) sobre esgotamento rRNA de nove isolados clínicos diferentes. Esta figura foi modificado a partir de 6 <em&gt;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> Figura 2. Maior Qualidade Sequencing Após portador RNA Esgotamento. Qualidades de base medianos por ciclo de sequenciação de poli (rA) -contaminated bibliotecas de vírus de Lassa (vermelho) e controle (sem portadora observado na biblioteca, preto) do relatório de QC 13. Tanto ler 1 e leia 2 de final emparelhado lê são mesclados no arquivo BAM biblioteca e os índices de qualidade são mostrados em cada base. Este valor foi modificado a partir do 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> O detalhes do protocolo de construção RNA-seq viral de bibliotecas directamente a partir extraídoARN recolhido a partir de amostras clínicas e biológicas. Para garantir a segurança pessoal, todas as amostras de soro, plasma e tecido virais devem ser inactivado em tampões apropriados antes da extração do RNA. Em alguns kits de inactivação e de extracção, poli transportador ARN (AR) é incluído; este vai ser removida durante o passo inicial depleção selectiva de RNase H. Com base na recuperação completa, a concentração esperada de ARN transportador é de 100 ng / ul. No protocolo, 110 ng / ul de oligo dT de ARN (concentração transportador 1,1x) é usada para depleção. Se poli (rA) portadora não está presente na amostra, em seguida, oligo (dT) não deve ser adicionado antes do esgotamento. O seguinte protocolo foi concebido para 24 reacções de PCR em formato de placa (até 250 ul de volume). Uma versão anterior deste protocolo foi relatada em Matranga, et al. 6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="965">
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:376px;">96-Well PCR Plates</td>
			<td style="width:183px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">47743-953</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Strips of Eight Caps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47745-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td>50 ml bottle</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">TURBO DNase&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2238</td>
			<td>post RNA extraction step, 2 U/&#181;L, buffer included</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">PCR cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any PCR cyclers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Agencourt RNAClean XP SPRI beads&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td>A63987</td>
			<td>beads for RNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Real Time qPCR system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any system</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">qRT-PCR primers</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>see Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">5M NaCl&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M Tris-HCl pH 7.4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2663-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M Tris-HCl pH 7.5&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">1M MgCl2&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Linear acrylamide&#160;</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM9520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DNA oligos covering entire rRNA region</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>see Table 3, order lab-ready at 100 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Oligo (dT)</td>
			<td>IDT DNA</td>
			<td></td>
			<td>40 nt long, desalted</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Hybridase Thermostable RNase H&#160;</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>H39100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">RNase-free DNase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td>post selective depletion step</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">SUPERase-In RNase Inhibitor</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Random Primers&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>48190-011</td>
			<td>mostly hexamers</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">10 mM dNTP mix</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">SuperScript III Reverse Transcriptase&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18080-093</td>
			<td>with first-strand buffer, DTT</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Air Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any air incubator cyclers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B6117S</td>
			<td>10x</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli DNA Ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0205L</td>
			<td>10 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli DNA Polymerase I&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0209L</td>
			<td>10 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">E. coli RNase H&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0297L</td>
			<td>2 U/&#956;l</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">0.5M EDTA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Agencourt AMPure XP SPRI beads</td>
			<td>Beckman Coulter Genomics</td>
			<td>A63881</td>
			<td>beads for DNA cleanup</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Elution Buffer&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Qubit fluorometer&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nextera XT DNA Sample Prep Kit&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Nextera XT DNA Index Kit&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Tapestation 2200</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2965AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity D1000 reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity D1000 ScreenTape</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-5584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">BioAnalyzer 2100&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">High Sensitivity DNA reagents</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Library Quantification Complete kit (Universal)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

Aqui destacamos um protocolo de sequenciação de RNA de última geração que permite montagens de novo e chamadas variantes intra-hospedeiras de genomas virais recolhidos a partir de fontes clínicas e biológicas. O método é imparcial e universal; que utiliza iniciadores aleatórios para a síntese de cDNA e não necessita de conhecimento prévio do conteúdo sequência viral. Antes da construção da biblioteca, digestão selectiva baseada-H de ARNase é utilizada para esgotar ARN indesejado - transportador incluindo poli (rA) e ARN ribossomal - a partir da amostra de RNA viral. depleção selectiva melhora tanto a qualidade dos dados e o número de exclusivo lê em bibliotecas RNA sequenciamento viral. Além disso, um passo à base de transposase &#39;tagmentation&#39; é utilizado no protocolo, uma vez que reduz o tempo global de construção da biblioteca. O protocolo permitiu a sequenciação rápida e profunda de mais de 600 amostras-incluindo Lassa e Ebola vírus coleções de sangue e tecido isola-e é amplamente aplicável a outros estudos de genômica microbiana.

O protocolo descrito permite a geração de sequenciamento de alta qualidade lê a partir de amostras de RNA viral baixa de entrada enquanto enriquece para conteúdo viral único. Como mostrado na Figura 1, o protocolo enriquecido conteúdo único vírus de Lassa, pelo menos, cinco vezes em todas as amostras (em comparação com os controlos não-empobrecido) com, pelo menos, um milhão de cópias de rRNA 18S (~ 100 pg de RNA total). Do mesmo modo, o sucesso de sequenciação também correlacionada com a quantidade de vírus numa dada amostra. Usando qRT-PCR como um substituto para a quantidade viral, as amostras que continham ~ 1.000 ou mais cópias de genoma virais mais frequentemente criados conjuntos completos (dados não mostrados). Além disso, a depleção de poli transportadora (Ra) reduz sequências Homopolímero de A e T, em bibliotecas, resultando em preparações mais limpas e assegurar uma melhor qualidade de sequenciação lê (Figura 2). bibliotecas finais de amostras clínicas viral baixa de entrada, muitas vezes têm um amplo comprimento de fragmentos de 150 a 1000 pb(Figura 3). Após sequenciação, para reduzir erros de identificação da amostra e crosstalk entre as bibliotecas dentro de uma piscina de 12, único índice lê com uma pontuação de 25 (Q25) a qualidade de base e assegurar a inexistência de incompatibilidades são mantidos durante o processo de desmultiplexagem. Genomas virais são montados utilizando um oleoduto bioinformática específico para vírus divergentes 2,4-6. Estas ferramentas estão disponíveis em https://github.com/broadinstitute/viral-ngs ou através de plataformas em nuvem comerciais 4. <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Passo 1.1: reacção ADNase </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> tampão 10x DNase </td><td> 7 </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 6 </td></tr><tr><td> ARN virai extraído </td><td> 55 </td></tr><tr><td> ADNase (2 U / &amp; #181; l) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 70 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: 5x tampão de hibridação </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume para 1 ml (mL) </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> M de Tris-HCl 1 M (pH 7,4) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: 10x tampão de reacção de RNase H </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume para 1 ml (mL) </td></tr><tr><td> 5 M de NaCl </td><td> 200 </td></tr><tr><td> M de Tris-HCl 1 M (pH 7,5) </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 M de MgCl2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td> Passo 2.1: Água wacrilamida linear om </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume para 1 ml de tampão (pi) </td></tr><tr><td> água livre de nuclease </td><td> 992 </td></tr><tr><td> acrilamida Linear (5 mg / ml) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 1.000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 2.2: reacção de hibridação para a depleção selectiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Tampão de Hibridização de 5x </td><td> 2 </td></tr><tr><td> -rRNA depleção mistura de oligo (100 uM) </td><td> 1,22 </td></tr><tr><td> Oligo (d) t (550 ng / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> tratado com ADNase ARN total </td><td> Até 5 </td></tr><tr><td> Spike-in RNA (Isto é opcional) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Água (com acrilamida linear) </td><td> levar até um total de 10 </td></tr><tr><td> volu totalmim </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 2.3: RNase H reacção de depleção selectiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Tampão de Reacção 10x ARNase H </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Água (com acrilamida linear) </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Termoestável ARNase H (5 U / uL) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 2.4: DNase pós reacção de depleção selectiva </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Tampão de ADNase 10x </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Água (com acrilamida linear) </td><td> 44,5 </td></tr><tr><td> inibidor de ARNase (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> livre de RNase DNase I (2,72 U / uL) </td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> O volume total (com reacção de RNase H) </td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 3.1: síntese de ADNc, hibridação do iniciador aleatório </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> rRNA ARN / empobrecido-transportador </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 ug de iniciador aleatório </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Passo 3.2: A primeira cadeia de reacção de síntese de ADNc </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> 5x primeira cadeia Tampão de Reacção </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0,1 M de DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> de mistura de dNTP 10 mM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> inibidor de ARNase (20 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> transcriptase reversa (adicione passado) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O volume total (com o ARN acima) &lt;/ Td&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> Passo 3.3: segunda cadeia reação de síntese de cDNA </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> água livre de RNase </td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10x Tampão de reacção da segunda cadeia </td><td> 8 </td></tr><tr><td> de mistura de dNTP 10 mM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> E. coli ADN-ligase (10 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ADN de E. coli polimerase I (10 U / ul) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> E. coli RNase H (2 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O volume total (com 1º reacção vertente) </td><td> 80 </td></tr><tr><td> Passo 4.2: reacção Tagmentation </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> Amplicon Mix Tagment (ATM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tampão de DNA Tagment (TD) </td&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> O volume total (com ADNc) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Passo 4.3: Biblioteca de reacção de PCR </td><td></td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> PCR Master Mix (NPM) </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Índice 1 primário (i7) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Índice 2 de primer (i5) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> O volume total (com tagmented ADNc) </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Passo 4.3.2: As condições de PCR da biblioteca </td><td></td></tr><tr><td> 72 ° C, 3 min </td><td></td></tr><tr><td> 95 ° C, 30 seg </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> -se a 18 ciclos de 10 seg a 95 ° C, 30 seg a 55 ° C, 30 seg a 72 ° C </td></tr><tr><td> 72 ° C, 5 min </td><td></td></tr><tr><td> 10 ° C, sempre </td><td></td></tr></tbody></table>Tabela 1:. Reacção set-up e buffers Passo-a-passo tabelas com conteúdo de todos os buffers e misturas de reacção. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Nome oligo </td><td> Sequência (5 &#39;para 3&#39;) </td></tr><tr><td> Ebola KGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td> Ebola KGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td> Ebola kulesh FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td> Ebola kulesh RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td> Lassa SL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYA AAB CC </td></tr><tr><td> Lassa SL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNA FW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNA RV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tcapaz&gt; Tabela 2: qRT-PCR Primers Sequências de iniciadores utilizados para medir host (18S rRNA) e viral conteúdo (Ebola e Lassa).. &#39;KGH&#39; é Hospital Kenema Governo da Serra Leoa, onde os iniciadores de Ebola foram testados 2. &#39;Kulesh&#39; é o investigador que projetou o conjunto de primers 14. Tabela 3: RNA ribossomal (rRNA) Exaustão Oligos 195 50-nucleotide longas sequências complementares para rRNA humano para a etapa depleção selectiva 6.. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples at JoVE.com

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Sequenciamento profundo imparcial de Vírus RNA de amostras clínicas

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K visualizações.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Vídeo: Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Medicina

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolamento de células-tronco cancerosas em amostras de câncer de próstata humano

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Controlling Parkinson's Disease With Adaptive Deep Brain Stimulation

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time according to fluctuating disease and medication state. In the present realization of adaptive DBS we record and stimulate from the DBS electrodes implanted in the subthalamic nucleus of patients with Parkinson&#39;s disease in the early post-operative period. Local field potentials are analogue filtered between 3 and 47 Hz before being passed to a data acquisition unit where they are digitally filtered again around the patient specific beta peak, rectified and smoothed to give an online reading of the beta amplitude. A threshold for beta amplitude is set heuristically, which, if crossed, passes a trigger signal to the stimulator. The stimulator then ramps up stimulation to a pre-determined clinically effective voltage over 250 msec and continues to stimulate until the beta amplitude again falls down below threshold. Stimulation continues in this manner with brief episodes of ramped DBS during periods of heightened beta power.
Clinical efficacy is assessed after a minimum period of stabilization (5 min) through the unblinded and blinded video assessment of motor function using a selection of scores from the Unified Parkinson&#39;s Rating Scale (UPDRS). Recent work has demonstrated a reduction in power consumption with aDBS as well as an improvement in clinical scores compared to conventional DBS. Chronic aDBS could now be trialed in Parkinsonism.

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) is effective for Parkinson&#8217;s disease, improving symptoms and reducing power consumption compared to conventional deep brain stimulation (cDBS). In aDBS we track a local field potential biomarker (beta oscillatory amplitude) in real time and use this to control the timing of stimulation.

Controlar a doença de Parkinson com Adaptive Estimulação Cerebral Profunda

Adaptive deep brain stimulation (aDBS) has the potential to improve the treatment of Parkinson&#39;s disease by optimizing stimulation in real time ...

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manuseio do Rato Cotton em Estudos para a avaliação pré-clínica de Vírus Oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding the clonal composition changes that occur within a tumor in response to certain micro-environment or treatments may lead to the design of more sophisticated and effective approaches to eradicate tumor cells. However, tracking tumor clonal sub-populations has been challenging due to the lack of distinguishable markers. To address this problem, a VDJ-seq protocol was created to trace the clonal evolution patterns of diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) relapse by exploiting VDJ recombination and somatic hypermutation (SHM), two unique features of B cell lymphomas.
In this protocol, Next-Generation sequencing (NGS) libraries with indexing potential were constructed from amplified rearranged immunoglobulin heavy chain (IgH) VDJ region from pairs of primary diagnosis and relapse DLBCL samples. On average more than half million VDJ sequences per sample were obtained after sequencing, which contain both VDJ rearrangement and SHM information. In addition, customized bioinformatics pipelines were developed to fully utilize sequence information for the characterization of IgH-VDJ repertoire within these samples. Furthermore, the pipeline allows the reconstruction and comparison of the clonal architecture of individual tumors, which enables the examination of the clonal heterogeneity within the diagnosis tumors and deduction of clonal evolution patterns between diagnosis and relapse tumor pairs. When applying this analysis to several diagnosis-relapse pairs, we uncovered key evidence that multiple distinctive tumor evolutionary patterns could lead to DLBCL relapse. Additionally, this approach can be expanded into other clinical aspects, such as identification of minimal residual disease, monitoring relapse progress and treatment response, and investigation of immune repertoires in non-lymphoma contexts.

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Seq: Análise Sequenciamento profundo do Reorganizados Imunoglobulina Cadeia Pesada Gene para revelar padrões Clonal evolução do linfoma B celular

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Using Saccadometry with Deep Brain Stimulation to Study Normal and Pathological Brain Function

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including Parkinson's and Huntington's can disrupt it. People with Parkinson's disease, for example, tend to have increased saccadic latencies. Consequently, the quantitative measurement of saccadic eye movements has received considerable attention as a potential biomarker for neurodegenerative conditions. A lot more can be learned about the brain in both health and disease by observing what happens to eye movements when the function of specific brain areas is perturbed. Deep brain stimulation is a surgical intervention used for the management of a range of neurological conditions including Parkinson's disease, in which stimulating electrodes are placed in specific brain areas including several sites in the basal ganglia. Eye movement measurements can then be made with the stimulator systems both off and on and the results compared. With suitable experimental design, this approach can be used to study the pathophysiology of the disease being treated, the mechanism by which DBS exerts it beneficial effects, and even aspects of normal neurophysiology.

This paper describes the use of quantitative measurement of eye movements in conjunction with stimulation of focal areas of the deep brain in order to study physiology, pathophysiology, and the mechanisms of deep brain stimulation.

Usando Saccadometry com Estimulação Cerebral Profunda para estudar normal e patológico função cerebral

The oculomotor system involves a large number of brain areas including parts of the basal ganglia, and various neurodegenerative diseases including ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Transarterial Administração de Oncolíticos Vírus para loco-regional Terapia de Ortotópico HCC em Ratos

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Estratégias de amostragem e processamento de amostras de tecido do Biobanco de suínos modelos biomédicos

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations often cause a distorted reading frame and premature stop codons, resulting in an almost total lack of dystrophin protein. The reading frame can be corrected using antisense oligonucleotides (AONs) that induce exon skipping. The morpholino AON viltolarsen (code name: NS-065/NCNP-01) has been shown to induce exon 53 skipping, restoring the reading frame for patients with exon 52 deletions. We recently administered NS-065/NCNP-01 intravenously to DMD patients in an exploratory investigator-initiated, first-in-human trial of NS-065/NCNP-01. In this methods article, we present the molecular characterization of dystrophin expression using Sanger sequencing, RT-PCR, and western blotting in the clinical trial. The characterization of dystrophin expression was fundamental in the study for showing the efficacy since no functional outcome tests were performed.

Here, we present the molecular characterization of dystrophin 38 expression using Sanger sequencing, RT-PCR, and western blotting in the clinical trial.

Caracterizando Exon Pulando Eficiência em Amostras de Pacientes DMD em Ensaios Clínicos de Oligonucleotídeos Antisamescenos

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release different bioactive molecules that control metabolic, hormonal, and immune processes; currently, it is unclear how these processes are regulated within the adipose tissue. Therefore, the development of methods evaluating the contribution of each cell population to the pathophysiology of adipose tissue is crucial. This protocol describes the isolation steps and provides the necessary troubleshooting guidelines for efficient isolation of viable mature adipocytes and SVF from human VAT biopsies in a single process, using a collagenase enzymatic digestion technique. Moreover, the protocol is also optimized to identify macrophage subsets and perform mature adipocyte RNA isolation for gene expression studies, which allows performing studies dissecting the interaction between these cell populations. Briefly, VAT biopsies are washed, minced mechanically, and digested to generate a single-cell suspension. After centrifugation, mature adipocytes are isolated by flotation from the SVF pellet. The RNA extraction protocol ensures a high yield of total RNA (including miRNAs) from adipocytes for downstream expression assays. Simultaneously, SVF cells are used to characterize macrophage subsets (pro- and anti-inflammatory phenotype) through flow cytometry analysis.

This protocol provides an efficient collagenase digestion method for isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction-SVF cells from human visceral fat in a single process, including methodology to obtain high-quality RNA from adipocytes and phenotypification of SVF-macrophages through staining of multiple membrane-bound markers for analysis by flow cytometry.

Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

Sequenciamento profundo imparcial de Vírus RNA de amostras clínicas

Resumo

Explore mais vídeos

PLAYLIST