<p>我々は、このビデオと記事を批評への参加のためにブラウンとラムラボのメンバーに感謝したい。この作品は、健康研究と健康研究のためのマイケルスミス財団のためのカナダの協会からの資金によって支えられている。 </p>

<p class="jove_title"> DNAの抽出および検体の調製</p><p class="jove_content">異なるさまざまなサンプル（培養細胞、新鮮なだけでなく、ホルマリン固定パラフィン包埋組織として冷凍）からDNAをMeDIPに使用することができます。このようなヒストンなどの関連蛋白質することなく、高度に精製されたDNAを使用することが重要です。それはDNAの定量と抗​​体の結合の両方を妨げることができるように、試料からできるだけ多くのRNAを除去することも重要です。 MeDIPのために使用されるDNAの量は200 ngから利用可能なDNAの量に応じて、1μgの範囲で指定できます。このプロトコルを示すために、1μgのDNAが使用されます。以下のプロトコールは、培養細胞から高品質の二本鎖DNAを提供します。他のプロトコルは、他の種類のサンプルからDNAの抽出に使用されるべきである。 </p><ol><li> 1.7ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブ中で細胞ペレットに消化緩衝液400μlを添加します。 </li><li>チューブにプロテイナーゼKの100μgを追加し、50℃一晩インキュベート℃、 </li><li> 500μlのフェノールのpH 7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>繰り返します一度3〜5を繰り返します。 </li><li> 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHが7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li> RNase Aを40μgを追加し、37℃で1時間のインキュベート℃に</li><li> 500μlのフェノールのpH 7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>繰り返しは、かつて11〜13を繰り返します。 </li><li> 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHが7を追加し、反転によって穏やかに混和する。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>の3 M酢酸ナトリウム（40μl）を10分の1の体積を加え、よく混ぜる。 </li><li> 100％エタノールの2倍量（900μl）を追加し、20分、-20 ° Cでよく混ぜ、そして場所。 </li><li> 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、 </li><li>エタノールを削除する、パルスのスピン、そして残留エタノールを除去します。 </li><li>洗浄に500μlの冷70％エタノールを加えます。 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、 </li><li> 70％エタノール、パルスのスピンを削除し、ピペッティングにより残留エタノールを除去します。 </li><li>空気が残留エタノールの痕跡をすべて削除するには、室温で10分のためのオープンキャップでペレットを乾燥させます。 </li><li> 4℃で一晩滅菌dH2Oの50μlの再懸濁し、DNA℃の</li><li>光度計分光光度計を用いてDNAを定量化する。 <sub>260：1.8</sub>の<sub>280</sub>比率が理想的です。 </li><li> 100 bpのラダーをアガロースゲル上でDNAの品質とサイズの範囲を決定します。ゲノムDNAのわずか10 ngのは、SYBRゴールドのようなDNAの少量に非常に敏感な色素を用いて染色を1.7パーセントアガロースゲル上で実行することができます。 </li><li>サンプルごとにシリコン処理したチューブに、滅菌のdH <sub>2</sub> Oで構成されたボリュームの残りの50μlの合計体積で1μgのDNAを準備する</li></ol><p class="jove_title"> DNA超音波処理</p><p class="jove_content"> DNAの超音波処理とMeDIPのプロトコルは、管壁へのタンパク質の非特異的結合を防ぐためにsiliconziedチューブで実行する必要があります。 DNAサンプル用に最適な超音波処理時間は、ゲル電気泳動（ステップ27）から決定されたDNAサンプルの断片化の程度に基づいています。例えば、培養細胞から抽出したDNAは非常に高分子量でなければならない、と続いて、しばしば部分的に分解されるアーカイブのサンプルから抽出したDNAよりも多くの超音波処理が必要になります。サンプルが均一に高分子量のものであるなら、それは個別に各サンプルを確認することなく、このプロトコルで説明されているように超音波処理を続行するには、この時点で合理的です。サンプルはアーカイブのサンプルと同様に断片化されている場合、それは300 - 100ベーシスポイントのフラグメントを得るために超音波処理時間を減少させることによって可能性が高い超音波処理の手順を適応させるために必要となります。あなたが部分的に分解されているサンプルを処理することが予想される場合は、超音波処理パラメータの最適化は重要なものから代表的なサンプルで実行することができます。ゲル電気泳動（ステップ27）から観測されたDNA断片化の程度に基づいて、実験者はサンプルのために最適な超音波処理の時間を事前に決定することができます。ここでは、高分子量のDNAを用いて自動化された超音波処理装置（DiagenodeのBioruptor、UCD - 200 TM）と超音波処理によって約300〜1,000 bpのDNA断片を取得する方法を説明します。 </p><ol><li> Biorupterの水は4でなければなりません℃に</li><li>自動設定で7分（30秒、最大パワーで30秒オン、オフ）のために超音波処理。 </li><li>免疫沈降（IP）反応のためにシリコーン1.7ミリリットルの遠心管に超音波処理した製品や場所、800 ngの（40μl）を取り外します。 </li><li>入力として機能するように、残りの200 ngの（10μl）を（IN）（4℃で保存）リファレンスDNAを脇に置きます。 </LI&gt; </ol><p class="jove_title">メチル化DNAのIMMUNOPRECIPITATON </p><ol><li>水浴中で10分間95℃でIP反応（800 ng）のために使用されるDNAを変性させる。 </li><li>氷上で直ちに冷却してください。次のステップに進む前に（氷の上で約5分）完全にDNAを冷ます。 </li><li> 5μgのモノクローナル抗体を追加。 </li><li> 500μlの最終容量にIPバッファを（このプロトコルを通じて、室温で使用される）を追加します。 </li><li>チューブホルダーを回転で4で2時間℃でインキュベートする。 </li><li>手順5が完了する直前に、（ステップ6-11）洗浄してダイナビーズを準備。最初に、ボルテックスでバイアルに徹底的にビーズを懸濁します。 </li><li>新しいシリコーンチューブ（例えば、8の反応を行う場合、9の十分なビーズを除去する、すなわち、270μL）に、反応プラス1あたりの再懸濁したダイナビーズ30μlを（〜2 × 10 <sup>7）</sup>転送する。 </li><li>室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>上清をピペットで。上清を除去する際、ピペットの先端で内部の壁（ビーズが磁石に引き付けている）に対して、ビーズには手を触れないでください。 </li><li>磁石からチューブを外し、IPバッファの過剰量（750μlの- 1000μL）でビーズを再懸濁します。バック室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>一回以上の洗浄を繰り返し、次にステップ7で取り外した元のボリュームにIPバッファーで洗浄したビーズを再懸濁します。 </li><li>各IP反応液に洗浄ダイナビーズ30μlを追加する</li><li> 4℃で2時間回転管ホルダー℃でインキュベートする</li><li>インキュベーションが完了した後、室温で2分のための磁気ラック上にチューブを置きます。 </li><li>上清をピペットで。ピペットの先端でチューブの内壁を（ビーズが磁石に引き付け場所）には触れないでください。 IP緩衝液500μlを追加。チューブの内容物を混合し、2分のための磁気ラックに戻す。 500μlのIPバッファーで1回洗浄繰り返します。 </li><li>最後の洗浄上清を除去した後、消化バッファ400μlでビーズを再懸濁します。 </li><li>プロテイナーゼK100μgのとの反応を治療し、50℃で一晩インキュベート℃、 </li></ol><p class="jove_title">免疫沈降したDNAの精製</p><ol><li> 500μlの1時01フェノール/クロロホルムpHを7と完全にボルテックスを追加。 </li><li>室温で10分間13,000 gでスピン。 </li><li>新しいチューブに水（上部）分数を取り外します。 </li><li>水溶液と有機層との間の相間が曇って表示されている場合は手順1〜3を繰り返します。 </li><li> 1 / <sup>10量</sup>の3 M酢酸ナトリウム（40μl）を、ボルテックスを追加。 </li><li> 1グリコーゲンの溶液（20μg/μLの）と渦を追加。 </li><li> 100％エタノール、渦、および20分まで-20℃での場所の2倍量（1000μL）を追加します。 </li><li> 4℃で20分間13,000 gでスピン℃、 </li><li>エタノールを削除する、パルスのスピン、そして残留エタノールを除去します。 </li><li>洗浄に500μlの冷70％エタノールを加えます。 4℃で20分間13,000 gで軽くボルテックスし、そしてスピン℃に</li><li> 70％エタノール、パルスのスピンを削除し、ピペッティングにより残留エタノールを除去します。 </li><li>空気が残留エタノールの痕跡をすべて削除するには、室温で10分のためのオープンキャップでペレットを乾燥させます。 </li><li>のdH <sub>2</sub> 0滅菌10μlに再懸DNAペレット。 </li></ol><p class="jove_title"> PCRによる検証</p><ol><li>あなたのMeDIPの手順は通常のヒトDNAを（男性または女性）を使用してMeDIPのプロトコルを実行することにより、ワーキング、その後、メチル化に富むことが知られている地域をアッセイしていることを確認するためにテストすることができます。 </li><li> PCRチューブにMeDIPの製品の30％、および他のPCRチューブにMeDIP製品の別の30％を削除します。 </li><li> PCRチューブにDNAの10ngの、および他のPCRチューブにDNA中の10 ngを置く。これで、4つの別々のPCR反応をセットアップする必要があります。 </li><li> PCRは、H19とCTRLプライマーを用いて行うには、表1に示した。 </li><li>表2に示すように12.5μL、総体積とのPCR反応の2つのmastermixes（各プライマーセットで1つずつ）を用意。 </li><li>表3に記載された条件を用いてPCRをThermocycle。 </li><li>可視化のための2％アガロースゲルでPCR産物の5μlを実行します。 </li><li>成功MeDIPの予想結果を表4に示す。 </li></ol><p class="jove_title">テーブル</p><p class="jove_content">表1：H19とPCRの検証のためにCTRLプライマー。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td>プライマーセット</td><td>フォワードプライマー</td><td>リバースプライマー</td><td>予想される製品のサイズ</td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39; - cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39; - ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bpの</td></tr><tr><td> CTRL（コントロール） </td><td> CTRL_F5&#39; - gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39; - gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bpの</td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content">表2。 PCR反応のMastermixes。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19ミックス（あたりRXN） </td><td> CTRLミックス（あたりRXN） </td></tr><tr><tD&gt;のddH <sub>2</sub> O </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> 10Xバッファー</td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> dNTPミックス（10 mMの各） </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>のMgCl <sub>2（50mM</sub>の） </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>プライマー（H19_F / RまたはCTRL_F / R）（10μMの各F / R） </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td>プラチナTaqポリメラーゼ</td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content">表3。 PCR thermocyling条件。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 5時00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X <br /></td><td> 95 ° C </td><td> 0時30分</td></tr><tr><td> 56℃ </td><td> 0時30分</td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 0時15分</td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content">表4。成功MeDIPのPCRの結果を期待。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center">テンプレートDNA </td></tr><tr><td>使用するプライマー</td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td>正</td><td>正</td></tr><tr><td> CTRL </td><td>正</td><td>マイナス</td></tr></tbody></table></p>

<ol>
	<li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methylome:+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling.">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> <em style='font-style: italic'>Trends Genet</em>. <b>24</b>, 231-237 (2008).</li><li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+disease,+and+therapeutic+interventions.">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> <em style='font-style: italic'>Ageing research reviews</em>. <b>5</b>, 449-467 (2006).</li><li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns.">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> <em style='font-style: italic'>Development</em>. <b>134</b>, 3959-3965 (2007).</li><li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+cancer+epigenetics.">The history of cancer epigenetics.</a> <em style='font-style: italic'>Nature reviews</em>. <b>4</b>, 143-153 (2004).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution,+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome.">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Genet</em>. <b>39</b>, 457-466 (2007).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells.">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Genet</em>. <b>37</b>, 853-862 (2005).</li><li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomics:+mapping+the+methylome.">Epigenomics: mapping the methylome.</a> <em style='font-style: italic'>Cell Cycle</em>. <b>5</b>, 155-158 (2006).</li><li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing.">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> <em style='font-style: italic'>Nature</em>. <b>449</b>, 1073-1077 (2007).</li><li>Karpinski, P., Sasiadek, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer.">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Rev Genet</em>. <b>3</b>, 415-428 (2002).</li><li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+a+profile+of+methods+and+applications.">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> <em style='font-style: italic'>Biotechniques</em>. <b>33</b>, 632-649 (2002).</li></ol>

<p class="jove_content">疾患において重要な役割のDNAメチル化の戯曲の認識が広がりつつあります、この修正を測定するアッセイのため、開発は<sup>13、12、3</sup>重要性を増してきています。 MeDIP技術は、全ゲノムと遺伝子座特異的レベル<sup>6、7の</sup>両方でのスクリーニングのための従順なツールです。この手法は、DNAを始めるの限られた量を使用してDNAのメチル化レベルの急速なビューを提供し、異なるソース?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biorupter sonicator</td>
<td>Tool</td>
<td>Diagenode</td>
<td>UCD-200 TM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Sorenson BioScience</td>
<td>11510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ND 3300 Spectrophotometer</td>
<td>Tool</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primary Antibody: Anti-5'-methylcytosine mouse mAb</td>
<td>Reagent</td>
<td>CalBiochem</td>
<td>162 33 D3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>112-01D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Tube Rack</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>CS15000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini LabRoller</td>
<td>Tool</td>
<td>Labnet International</td>
<td>H5500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IP Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM NaPO<sub>4</sub> pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100.  Stored at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>Digestion Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

methylated dna immunoprecipitation

<p class="jove_content">DNAのメチル化パターンの識別には、メチル化が遺伝子発現に大きな影響を持つことが知られているように、エピジェネティクスの研究では一般的な手順であり、通常の開発だけでなく、病気に関与している<sup&gt; 1月4日</sup&gt;。従って、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する能力は、そのような研究のためにメチル化プロファイルを生成するために不可欠です。メチル化DNA免疫沈降（MeDIPは）興味のサンプルからのメチル化DNAの抽出のための効率的な手法です。<sup&gt; 5月7日</sup&gt;。 DNAのようにわずか200 ngのサンプルは、抗体、または免疫沈降（IP）、反応に十分です。 DNAは、約300〜1,000 bpからサイズの範囲のフラグメントに超音波処理され、そして免疫沈降（IP）と入力（IN）部分に分かれています。 IPのDNAは、その後、熱変性し、モノクローナル抗体は、メチル化DNAを結合させること、抗5&#39;mCとインキュベートされる。この後、一次抗体に対する親和性を有する二次抗体を含む磁性ビーズを添加し、インキュベートする。これらのビーズにリンクされた抗体は、最初のステップで使用されるモノクローナル抗体をバインドします。抗体複合体（メチル化DNA）に結合したDNA溶液から複合体を引き出すために磁石を使用してDNAの残りの部分から分離されている。 IPバッファを使用して数回の洗浄が結合していない、非メチル化DNAを除去するために実行されます。メチル化DNA /抗体複合体は、唯一のメチル化DNAをそのまま残し抗体を消化するためにプロテイナーゼKで消化されています。蛋白質の物質を除去するためにクロロホルム抽出し、後で使用するために沈殿し、水に再懸濁さ：濃縮されたDNAは、フェノールによって精製する。 PCR技術は、IPの増幅産物を分析することにより、地域の欠如に知られているとメチル化配列を含むように知られているため、DNAのMeDIPの手順の効率性を検証するために使用することができます。精製したメチル化DNAは、遺伝子座特異的（PCR）またはゲノムワイド（マイクロアレイやシーケンシング）メチル化の研究に使用し、そのような遺伝子発現プロファイリングとアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションなどの他の研究ツールと組み合わせて適用する場合に特に有用であることができる（ CGH）<sup&gt; 8</sup&gt;。 DNAメチル化へのさらなる調査は、順番に、異常にメチル化DNAを特徴とする、癌などの疾患の新しい治療や予後の研究ツールの開発に便利だと思われる、新たなエピジェネティックなターゲットの発見につながる<sup&gt; 2、4、9-11</sup&gt;。</p>

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Methylated DNA Immunoprecipitation

<p class="jove_content">このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のためのプロトコルを示しています。 MeDIPは、選択的に5 - メチルシトシン（抗- 5 MC）のための特異性を有する抗体を用いてゲノムDNAのサンプルからメチル化DNA断片を抽出する二日間の手順です。</p>

メチル化DNA免疫沈降

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K ビュー.  BC Cancer Research Centre. このビデオでは、メチル化DNA免疫沈降（MeDIP）のためのプロトコルを示しています。 MeDIPは、選択的に5 - メチルシトシン（抗- 5 MC）のための特異性を有する抗体を用いてゲノムDNAのサンプルからメチル化DNA断片を抽出する二日間の手順です。