Name: methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
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Die Arbeit wird von CPRIT Forschung Training Award RP140105 unterstützt, sowie teilweise von US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) gewährt R01 GM114142 und von William &amp; Ella Owens Medical Research Foundation unterstützt.

Alle Gewebe erhalten nach der Zustimmung des Institutional Review Board Ausschuss und, wenn alle Teilnehmer zugestimmt sowohl der molekularen Analysen und Follow-up-Studien. Die Protokolle werden von der Human Studies Committee an der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt. 1. Methyl-bindende DNA-Capture (MBDCap) <ol><li> Probenentnahme und DNA - Isolierung <ol><li> Sammeln Sie Bulk-Tumor oder normalen Gewebeproben von Patienten Paraffingewebeproben eingebettet. </li><li> Verwenden Sie einen handelsüblichen DNA-Mini-Kit an genomische DNA aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben isolieren dem Protokoll des Herstellers nach. </li><li> Verwenden Sie eine methylierte DNA Anreicherung Kit mit dem hier beschriebenen Verfahren nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Anfängliche Wulst Wasch Anmerkung: Die Perlen werden verwendet, um Paare mit MBD-Biotin-Protein, das auf dem Genom DNA Methylierungs erkennt. Perlen sind in der Regel ausgesetztin einer Stammlösung. Verwenden Sie diese Schritte, um diese Flüssigkeit zu waschen. <ol><li> Resuspendieren der Bestand an Streptavidin - Kügelchen (siehe Materialien Table) durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten um eine homogene Suspension zu erhalten. Sie nicht die Perlen durch Vortexen mischen. </li><li> Für eine ug Input-DNA, ADD10 ul Kügelchen in ein Röhrchen mit 90 &amp; mgr; l 1x Bind / Waschpuffer. Drehen Sie für 1 min. Lassen Sie sich durch Verwirbelung mischen. </li><li> Das Röhrchen (en) auf einem Magnetträger für 1 min. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und entsorgen Sie die Flüssigkeit. </li><li> In 250 ul 1x Bind / Waschpuffer in den Perlen und drehen für 1 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3 - 1.2.5 zweimal. </li></ol></li><li> Die Kopplung des MBD-Biotin - Protein an die Kügelchen <ol><li> 1,2 ug Input DNA, fügen 7 ul (3,5 ug) des MBD-Biotin-Protein zu jedem Röhrchen. </li><li> Hinzuzufügen 93 ul 1x Bind / Waschpuffer mit dem Protein um ein Endvolumen von 100 &amp; mgr; l zu machen. </li><li> Mischen Sie die Perlen-ProteinMischung auf einer 1 h bei RT Rotationsmischer. </li></ol></li><li> Fragmentierte DNA (Eingang) <ol><li> Beschallte DNA durch Zugabe von 1,2 &amp; mgr; g genomische Gesamt-DNA in 96 ul TE-Puffer und 24 &amp; mgr; l 5x Bind / Waschpuffer mit einem 120 &amp; mgr; l Lösung herzustellen. Verwenden Sie 30 s Power ON und 30 s Leistung AUS während der Beschallung, 20 bis 25 mal. </li><li> Führen Sie 1 ul beschallt DNA-Lösung ein Bioanalyzer System mit einem kommerziellen hoher Empfindlichkeit DNA-Kit mit der Größe der Fragmente zu prüfen, im Bereich von 150 bis sein - 350 bp nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Waschen Sie die MBD-Perlen <ol><li> Das Röhrchen enthält MBD-Perlen auf einem Magnetträger für 1 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne die Perlen zu berühren. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen mit 250 &amp; mgr; l 1x Bind / Waschpuffer. </li><li> Mischen Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer bei RT für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1 - 1.5.4 zweimal. </li&gt; </ol></li><li> Fragmentierte DNA - Capture - Reaktion (1 ug Input - DNA) <ol><li> Übertragen Sie die DNA / Puffer-Gemisch in das Röhrchen die MBD-Perlen enthält. </li><li> Mischen Sie die MBD-beads mit der DNA auf einem Rotationsmischer für 1 h bei RT. Alternativ bei 4 o C O / N mischen </li></ol></li><li> Entfernen von nicht-eingefangen - DNA aus den Beads <ol><li> die DNA und MBD-beads, das Reagenzglas auf dem Magnetzahnstange nach dem Mischen für 1 min alle der Wülste an der Innenwand des Rohres zu konzentrieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und speichern Sie sie in einem sauberen DNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen als nichtmethylierten DNA. Bewahren Sie diese Probe auf Eis. </li><li> In 200 ul 1x Bind / Waschpuffer an die Kügelchen die Perlen zu waschen. </li><li> Mischen Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer 3 min. </li><li> Das Röhrchen wird auf dem Magnetträger für 1 min. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und speichern Sie sie in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Für die GAP-ture Reaktionen von ≤1 ug Input-DNA, wiederholen Sie die Schritte 1.7.3 - 1.7.6 für 2 weitere Waschfraktionen insgesamt. </li></ol></li><li> Einzel Fraktion Elution <ol><li> Mischen Sie salzarme Puffer mit hohem Salzpuffer (1: 1) Elutionspuffer zu erhalten (1000 mM NaCl). </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 200 &amp; mgr; l Elutionspuffer (1000 mM NaCl). </li><li> Inkubieren Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer 3 min. </li><li> Das Röhrchen wird auf dem Magnetträger für 1 min. </li><li> Mit dem Rohr an Ort und Stelle auf dem Magnetträger, entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne die Perlen mit der Pipettenspitze berühren, und speichern Sie sie in einem sauberen DNase-frei 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie diese Probe auf Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.8.1 - 1.8.4 einmal, die zweite Probe in der gleichen Sammelrohr (wird Gesamtvolumen 400 &amp; mgr; l sein). Bewahren Sie die Sammelprobe auf Eis. </li></ol></li><li> Ethanolfällung (DNA Cleanup) <ol><li> Jedem noncaptured, waschen und Elutionsfraktion from die vorherigen Schritte, fügen 1 ul Glykogen (20 ug / ul, im Bausatz enthalten), 1/10 Probenvolumen von 3 M Natriumacetat, pH 5,2 (zB 40 &amp; mgr; l pro 400 &amp; mgr; l der Probe) und 2 Probenvolumina von 100% Ethanol (zB 800 &amp; mgr; l pro 400 &amp; mgr; l der Probe). Das Gesamtvolumen beträgt 1.241 &amp; mgr; l. </li><li> Gut mischen und Inkubation bei -80 ° C für mindestens 2 h. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15 Minuten bei 11.363 × g bei 4 o C </li><li> verwerfen Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. </li><li> In 500 &amp; mgr; l kaltem 70% Ethanol. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 Minuten bei 11.363 × g bei 4 o C </li><li> verwerfen Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.9.6 - 1.9.7 einmal und entfernen Sie alle verbleibenden Restüberstand. </li><li> Der Luft trocknen das Pellet für ~ 5 min. Nicht ganz das Pellet trocknen. </li><li> Resuspendieren DNA-Pellet in 37,5 ul DNase-freiem Wasser oder andereentsprechende Volumen des Puffers. </li><li> Legen Sie die DNA auf Eis oder lagern Sie die DNA bei -20 ° C oder darunter bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Überprüfen Sie, dass die Gesamtmenge an DNA über 20 ng, (zB verwenden fluorimetrischen Quantifizierung System, siehe Materialien Tabelle). </li></ol></li></ol> 2. Sequenzierung <ol><li> Verwenden Sie die DNA-Fragmente aus MBDCap Verfahren zur Sequenzierung gewonnen. Für jede Probe wurden sequenziert werden insgesamt 20 bis 40 ng DNA wird für Bibliotheks Vorbereitung erforderlich. </li><li> Für die DNA-seq Bibliothek Vorbereitung eine vollautomatisierte Bibliothek Bausystem verwenden (siehe Werkstoff - Tabelle) und das Standardprotokoll des Herstellers folgen. Wählen Sie DNA-Fragmente mit einer Größe von 200 bis 400 bp für Bibliothek Vorbereitung. Die Automatisierung Bibliothek Vorbereitungssystem ermöglicht die Bibliothek Herstellungsverfahren zu standardisieren und die Unterschiede zwischen den Proben durch manuelle Vorbereitung minimiert wird. </li><li> Verwenden Adapter primers und 100x Konzentration verdünnen. Davon verwenden 10 &amp; mgr; l für jede Probe. </li><li> Nach dem Schritt 2.2, nehmen Sie die Reaktion aus, und Quantifizierung der DNA-seq Bibliothek eine fluorometrische Quantifizierungssystem (siehe Materialien Tabelle). <ol><li> Richten Sie die PCR-Amplifikation Verfahren. Die Wahl der PCR-Master-Mix ist die PCR-Effizienz von GC angereicherten Bereich des Genoms zu verbessern. In einem PCR - Röhrchen werden 15 &amp; mgr; l DNA-seq Bibliothek, 25 &amp; mgr; l PCR - Master - Mix (siehe Werkstoff - Tabelle), 2 Primermix ul PCR (siehe Materialien Tabelle) und 8 &amp; mgr; l H 2 O </li></ol></li><li> Folgen PCR Empfehlung des Herstellers des PCR - Mastermix, Zykluszeiten verändert und die Temperaturen für unterschiedliche Ausgangsmaterialien: 98 o C für 45 s, X Zyklen von 98 o C für 15 s, 65 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s, und dann 72 o C für 1 min. Halten bei 4 o C <ol><li> Perform genug Zyklen mit 2 bis am Ende - 10 nM von Bibliotheks-DNA (8 - 10 Zyklen). </li></ol></li><li> Clean up PCR - Reaktion mit 1: 1 - Verhältnis von PCR - Reinigungs - Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Werkstoff - Tabelle). </li><li> Eluieren mit 20 - 30 &amp; mgr; l Elutionspuffer. </li><li> Barcode-jede Probe und Pool 4 Proben zusammen in eine Spur einer Durchflusszelle. Verwenden Sie die Standard - 50 bp einzelnen Lese Protokoll für die Sequenzierung (siehe Materialien Tabelle). </li></ol> 3. Bioinformatik-Analyse Hinweis: Weitere Verfahren die rohen fastq Dateien aus der Sequenzierung erhaltenen Qualitätskontrolle durchführen und das Mapping der kurze DNA-Sequenzen (liest) auf dem Genom. <ol><li> Verwenden Sie Bowtie kurze Lese Aligner, Genom Mapping-Tool auf jeder Probe fastq Datei zu verbinden das liest auf dem Referenzgenom. Viele Lese-Mapping-Tools zur Verfügung, diesen Schritt auszuführen und auf den individuellen Vorlieben verwendet werden. <ol><li> Es kann bis zu zwei Fehlpaarungen in der whole liest, während die Zuordnung zu dem Referenzgenom. Bericht bis zu 20 besten Ausrichtungen für jeden zu lesen. Verwenden Sie zum Beispiel Bowtie -V 2 --bester -k 20 --chunkmbs 200 &lt;ebwt&gt; &lt;fastqFile&gt; &lt;alignFile&gt;. </li></ol></li><li> Verwenden LONUT 9 zurückzufordern multiply kartiert liest die Detektion der angereicherten Regionen zu verbessern. Für jede Lese, höchstens eine Ausrichtung würde wiederhergestellt werden, wenn es sich nahe genug an einer der oben genannten Spitzen. Verwenden Sie zum Beispiel: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 &lt;alignFile&gt; &lt;OutputPath&gt;. LONUT werden die folgenden Schritte durchführen. <ol><li> Split Ausrichtungen in eindeutig liest abgebildet und mehrfach liest abgebildet. Anruf Peak auf der eindeutig abgebildet liest mit Spitzen Anrufer Band 11. Die Option -w 250 und -p 99 im Beispielbefehl für Gürtel. </li><li> Combine eindeutig abgebildet liest mit der wiedergewonnene liest aus LONUT erhalten, und die kombinierten liest im Bett Format wird in die weitere Analyse verwendet werden. Berechnen Sie die Anzahl der combined liest für zukünftige Normalisierung. </li></ol></li><li> Bin das liest. Auszug liest in der Region von Interesse Perl-Skript: perl methyPipeline.pl &lt;sampleInfoFile&gt; &lt;refGeneFile&gt; -up &lt;stromaufwärts verlaufende Länge&gt; dn &lt;stromabwärts verlaufende Länge&gt;. Für jedes Bett-Datei im sampleInfoFile aufgeführt, führt das Perl-Skript die folgenden Aufgaben. Hinweis: Siehe ergänzende Codierung Datei für das Perl-Skript. <ol><li> Bin das liest in fixed bin Größe, zB 100 bp, 24 Chromosomen. </li><li> Für jedes Gen in refGeneFile angegeben, extrahieren die Behälter um Transkriptionsstartstelle (TSS), bis zur Verlängerung Länge von Option -up und -dn angegeben. Extrahieren Sie beispielsweise die Daten in der Region, die vor- und nachgelagerten 4 kb von TSS ist. Bei Bingröße 100 bp, extrahiert diese Daten haben 81 Bins und das Zentrum bin entspricht der TSS. </li><li> Für das Gen auf dem Antisense-Strang, drehen Sie den extrahierten Bereich von links nach rechts, so dass vorgeschalteten Behälter immer sind pladie linke Seite mit dem Perl-Skript ced auf. </li><li> Ferner teilen die TSS ± ​​4 kb-Region in drei Teilbereiche: Links, Upstream 4 kb 2 kb stromaufwärts; Mittel, die vor- und nachgelagerten 2 kb; Richtig, Downstream 2 kb bis 4 kb. </li><li> Für jede Probe, teilen Sie die Anzahl der in jedem Fach liest durch die Gesamtzahl der kombinierten in 3.3.3 berechnet abgebildet liest. Die Normalisierung wird die Probe spezifische lesen Unterschiede zu beseitigen und erlaubt es dem liest in verschiedenen Proben zu vergleichen. </li></ol></li><li> Führen Sie die Bash-Skript (wie in der Skriptdatei angegeben) statistischer Test auf der normalisierten auszuführen liest aus dem linken Bereich erhalten, Differential-Methylierung zwischen normalen und Fallgruppe in den Regionen wie im Flankenbereich beschrieben zu erfassen. Hinweis: Siehe die zusätzliche Codierung Datei für die Bash-Skript. Basierend auf den Bereichen, die differenziell methyliert sind, gibt es sieben Kombinationen: Ganze Region: Differential-Methylierung während des TSS ± ​​4 kb-Region middleLeft: Differential-Methylierung in den beiden mittleren und linken Bereich Middle: Differential-Methylierung in den beiden mittleren und rechten Bereich Flank: Differential-Methylierung in linke und rechte Region nur Differential-Methylierung in der linken Region: links Rechts: Differential-Methylierung in der rechten Region nur nur Differential-Methylierung in der mittleren Region: Mittel </li><li> Verwenden Sie die gleiche Bash-Skript, das Differential-Methylierung in einem Tornado Plot zu visualisieren. Zeichnen Sie die Hyper- und Hypo methylierte Gene auf einer separaten Platte, und in der Reihenfolge der Region Kombination sortieren, wie in 3.4 beschrieben sind. </li></ol>

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Dieses Protokoll wird in den Labors von Dr. Tim Huang und Dr. Victor Jin an der University of Texas Health Science Center in San Antonio entwickelt.

Die MBDCap-seq - Technik ist eine Affinitätsanreicherung Ansatz 3 als kostengünstige Alternative angesehen , wenn Kohorten mit einer großen Anzahl von Patienten 15 zu untersuchen. Die Pipeline präsentiert hier beschreibt einen umfassenden Ansatz von der Probenbeschaffung bis zur Datenanalyse und Interpretation. Einer der wichtigsten Schritte setzt ein PCR-Amplifikationsverfahren, um die Effizienz der PCR GC angereicherte Regionen in dem Genom zu verbessern, da dies ist, wo die DNA-Methylierung stattfindet. Auch ist...

Epigenetischen Regulation der Gene durch DNA - Methylierung ist eine der wesentlichen Mechanismen erforderlich , um die Zellschicksal durch stabile Differenzierung verschiedener Gewebearten in dem Körper 1 zu bestimmen. Dysregulation dieses Verfahrens wurde 2 verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs zu verursachen bekannt. Dieses Verfahren umfasst im Wesentlichen die Zugabe von Methylgruppen auf dem Cytosin - Rest in der CpG Dinukleotide DNA 3. Es gibt verschiedene Techniken , die derzeit diesen Mechanismus zu untersuchen, die jeweils ihre eigenen Vorteile, wie 2-8 in vielen Studien beschrieben. Hier werden wir eine dieser Techniken diskutieren namens Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), wo wir eine Affinität Anreicherungsmethode verwenden, um methylierte Bereiche der DNA zu identifizieren. Diese Technik baut auf dem methyl-Bindungsfähigkeit des MBD2-Proteins für die genomische DNA-Fragmente enthalten, methylierte CpG-Stellen zu bereichern. Wir verwenden eine kommerzielle methylierte DNA-Anreicherung Kitfür die Isolierung dieser methylierten Regionen. Unser Labor hat Hunderte von Patientenproben mit dieser Technik gezeigt und hier bieten wir ein umfassendes optimiertes Protokoll, das verwendet werden kann große Patientengruppen zu untersuchen. Wie sich bei jeder Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation erfordert MBDCap-seq auch einen spezifischen Ansatz der Bioinformatik, um das Niveau der Methylierung in den Proben genau zu quantifizieren. Es wurden in dem Bemühen viele neuere Studien, die Normalisierung und Analyseprozess der Sequenzierungsdaten 9, 10 zu optimieren. In diesem Protokoll zeigen wir eine dieser Methoden eine einzigartige Lese Recovery-Ansatz der Umsetzung - LONUT - gefolgt von linearen Normalisierung jeder Probe, um unvoreingenommene Vergleiche über große Anzahl von Patientenproben zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Methylminer DNA enrichment Kit</td><td>Invitrogen</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112-05D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus Sonication Device</td><td>diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate, pH 5.2</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>SPRIworks Fragment Library System I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A50100</td><td>Fully automated library construction system</td></tr><tr><td>Adapter Primers</td><td>Bioo Scientific</td><td>514104</td><td>PCR primer mix</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Fluorometric Quantitation System</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>KAPA scientific</td><td>KK2621</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>PCR Purification beads</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Sequencing System</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

Methylierungs ist eines der wesentlichen epigenetische Modifikationen an der DNA, die für die genaue Regulierung von Genen verantwortlich ist, die für eine stabile Entwicklung und Differenzierung von verschiedenen Gewebetypen. Dysregulation dieses Verfahrens ist oft das Kennzeichen von verschiedenen Krankheiten wie Krebs. Hier haben wir eine der jüngsten Sequenzierungstechniken skizzieren, Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), verwendet Methylierung in für große Patientenkohorten verschiedenen normalen und Krankheit Gewebe zu quantifizieren. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll dieser Affinitätsanreicherung Ansatz zusammen mit einer Bioinformatik Pipeline optimale Quantifizierung zu erreichen. Diese Technik ist verwendet worden Hunderte von Patienten in verschiedenen Krebsarten als Teil der 1000 Methyloms Projekt (Cancer Methylome System) zu sequenzieren.

Wir haben MBDCap-seq verwendet , um DNA - Methylierungs Veränderungen in einer großen Anzahl von Patienten , die an verschiedenen Krebsarten einschließlich Brust- 12, endometrial 13, der Prostata 14 und Leberkrebs unter anderem studieren. Hier zeigen wir einige Informationen aus der Studie Brustkrebs vor kurzem 12 veröffentlicht. In diesem Fall haben wir das gesamte Genom-Sequenzierung Ansatz zu CpG-Inseln zu identifizieren, die in den normalen bezüglich der Tumor in verschiedenen genomischen...

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

methyl-binding-dna-capture-sequencing-for-patient-tissues

Research

JoVE Journal

Genetics

8.6K Aufrufe.  University of Texas Health Science Center at San Antonio.  Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline. 

Serie: Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Forschung

Genetik

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Methylated DNA Immunoprecipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on gene expression, and is involved with normal development as well as disease 1-4. Thus, the ability to discriminate between methylated DNA and non-methylated DNA is essential for generating methylation profiles for such studies. Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) is an efficient technique for the extraction of methylated DNA from a sample of interest 5-7. A sample of as little as 200 ng of DNA is sufficient for the antibody, or immunoprecipitation (IP), reaction. DNA is sonicated into fragments ranging in size from 300-1000 bp, and is divided into immunoprecipitated (IP) and input (IN) portions. IP DNA is subsequently heat denatured and then incubated with anti-5'mC, allowing the monoclonal antibody to bind methylated DNA. After this, magnetic beads containing a secondary antibody with affinity for the primary antibody are added, and incubated. These bead-linked antibodies will bind the monoclonal antibody used in the first step. DNA bound to the antibody complex (methylated DNA) is separated from the rest of the DNA by using a magnet to pull the complexes out of solution. Several washes using IP buffer are then performed to remove the unbound, non-methylated DNA. The methylated DNA/antibody complexes are then digested with Proteinase K to digest the antibodies leaving only the methylated DNA intact. The enriched DNA is purified by phenol:chloroform extraction to remove the protein matter and then precipitated and resuspended in water for later use. PCR techniques can be used to validate the efficiency of the MeDIP procedure by analyzing the amplification products of IP and IN DNA for regions known to lack and known to contain methylated sequences. The purified methylated DNA can then be used for locus-specific (PCR) or genome-wide (microarray and sequencing) methylation studies, and is particularly useful when applied in conjunction with other research tools such as gene expression profiling and array comparative genome hybridization (CGH) 8. Further investigation into DNA methylation will lead to the discovery of new epigenetic targets, which in turn, may be useful in developing new therapeutic or prognostic research tools for diseases such as cancer that are characterized by aberrantly methylated DNA 2, 4, 9-11.

This video demonstrates the protocol for methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP). MeDIP is a two day procedure that selectively extracts methylated DNA fragments from a genomic DNA sample using antibodies with specificity for 5 -methylcytosine (anti-5 mC).

Methylierte DNA Immunpräzipitation

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Biologie

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Optimierte Analyse von DNA-Methylierung und Genexpression von Klein, Anatomisch-definierte Bereiche des Gehirns

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Neurowissenschaften

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

Genomweite Analyse der DNA-Methylierung bei Magen-Darm-Krebs

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Krebsforschung

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Selektive Aufnahme von 5-Hydroxymethylcytosin aus genomischer DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Biotechnik

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...