Die Arbeit wird von CPRIT Forschung Training Award RP140105 unterstützt, sowie teilweise von US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) gewährt R01 GM114142 und von William &amp; Ella Owens Medical Research Foundation unterstützt.

Alle Gewebe erhalten nach der Zustimmung des Institutional Review Board Ausschuss und, wenn alle Teilnehmer zugestimmt sowohl der molekularen Analysen und Follow-up-Studien. Die Protokolle werden von der Human Studies Committee an der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt. 1. Methyl-bindende DNA-Capture (MBDCap) <ol><li> Probenentnahme und DNA - Isolierung <ol><li> Sammeln Sie Bulk-Tumor oder normalen Gewebeproben von Patienten Paraffingewebeproben eingebettet. </li><li> Verwenden Sie einen handelsüblichen DNA-Mini-Kit an genomische DNA aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben isolieren dem Protokoll des Herstellers nach. </li><li> Verwenden Sie eine methylierte DNA Anreicherung Kit mit dem hier beschriebenen Verfahren nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Anfängliche Wulst Wasch Anmerkung: Die Perlen werden verwendet, um Paare mit MBD-Biotin-Protein, das auf dem Genom DNA Methylierungs erkennt. Perlen sind in der Regel ausgesetztin einer Stammlösung. Verwenden Sie diese Schritte, um diese Flüssigkeit zu waschen. <ol><li> Resuspendieren der Bestand an Streptavidin - Kügelchen (siehe Materialien Table) durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten um eine homogene Suspension zu erhalten. Sie nicht die Perlen durch Vortexen mischen. </li><li> Für eine ug Input-DNA, ADD10 ul Kügelchen in ein Röhrchen mit 90 &amp; mgr; l 1x Bind / Waschpuffer. Drehen Sie für 1 min. Lassen Sie sich durch Verwirbelung mischen. </li><li> Das Röhrchen (en) auf einem Magnetträger für 1 min. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und entsorgen Sie die Flüssigkeit. </li><li> In 250 ul 1x Bind / Waschpuffer in den Perlen und drehen für 1 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3 - 1.2.5 zweimal. </li></ol></li><li> Die Kopplung des MBD-Biotin - Protein an die Kügelchen <ol><li> 1,2 ug Input DNA, fügen 7 ul (3,5 ug) des MBD-Biotin-Protein zu jedem Röhrchen. </li><li> Hinzuzufügen 93 ul 1x Bind / Waschpuffer mit dem Protein um ein Endvolumen von 100 &amp; mgr; l zu machen. </li><li> Mischen Sie die Perlen-ProteinMischung auf einer 1 h bei RT Rotationsmischer. </li></ol></li><li> Fragmentierte DNA (Eingang) <ol><li> Beschallte DNA durch Zugabe von 1,2 &amp; mgr; g genomische Gesamt-DNA in 96 ul TE-Puffer und 24 &amp; mgr; l 5x Bind / Waschpuffer mit einem 120 &amp; mgr; l Lösung herzustellen. Verwenden Sie 30 s Power ON und 30 s Leistung AUS während der Beschallung, 20 bis 25 mal. </li><li> Führen Sie 1 ul beschallt DNA-Lösung ein Bioanalyzer System mit einem kommerziellen hoher Empfindlichkeit DNA-Kit mit der Größe der Fragmente zu prüfen, im Bereich von 150 bis sein - 350 bp nach dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Waschen Sie die MBD-Perlen <ol><li> Das Röhrchen enthält MBD-Perlen auf einem Magnetträger für 1 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne die Perlen zu berühren. </li><li> Resuspendieren der Kügelchen mit 250 &amp; mgr; l 1x Bind / Waschpuffer. </li><li> Mischen Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer bei RT für 5 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1 - 1.5.4 zweimal. </li&gt; </ol></li><li> Fragmentierte DNA - Capture - Reaktion (1 ug Input - DNA) <ol><li> Übertragen Sie die DNA / Puffer-Gemisch in das Röhrchen die MBD-Perlen enthält. </li><li> Mischen Sie die MBD-beads mit der DNA auf einem Rotationsmischer für 1 h bei RT. Alternativ bei 4 o C O / N mischen </li></ol></li><li> Entfernen von nicht-eingefangen - DNA aus den Beads <ol><li> die DNA und MBD-beads, das Reagenzglas auf dem Magnetzahnstange nach dem Mischen für 1 min alle der Wülste an der Innenwand des Rohres zu konzentrieren. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und speichern Sie sie in einem sauberen DNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen als nichtmethylierten DNA. Bewahren Sie diese Probe auf Eis. </li><li> In 200 ul 1x Bind / Waschpuffer an die Kügelchen die Perlen zu waschen. </li><li> Mischen Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer 3 min. </li><li> Das Röhrchen wird auf dem Magnetträger für 1 min. </li><li> Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und speichern Sie sie in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Für die GAP-ture Reaktionen von ≤1 ug Input-DNA, wiederholen Sie die Schritte 1.7.3 - 1.7.6 für 2 weitere Waschfraktionen insgesamt. </li></ol></li><li> Einzel Fraktion Elution <ol><li> Mischen Sie salzarme Puffer mit hohem Salzpuffer (1: 1) Elutionspuffer zu erhalten (1000 mM NaCl). </li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 200 &amp; mgr; l Elutionspuffer (1000 mM NaCl). </li><li> Inkubieren Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer 3 min. </li><li> Das Röhrchen wird auf dem Magnetträger für 1 min. </li><li> Mit dem Rohr an Ort und Stelle auf dem Magnetträger, entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne die Perlen mit der Pipettenspitze berühren, und speichern Sie sie in einem sauberen DNase-frei 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie diese Probe auf Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.8.1 - 1.8.4 einmal, die zweite Probe in der gleichen Sammelrohr (wird Gesamtvolumen 400 &amp; mgr; l sein). Bewahren Sie die Sammelprobe auf Eis. </li></ol></li><li> Ethanolfällung (DNA Cleanup) <ol><li> Jedem noncaptured, waschen und Elutionsfraktion from die vorherigen Schritte, fügen 1 ul Glykogen (20 ug / ul, im Bausatz enthalten), 1/10 Probenvolumen von 3 M Natriumacetat, pH 5,2 (zB 40 &amp; mgr; l pro 400 &amp; mgr; l der Probe) und 2 Probenvolumina von 100% Ethanol (zB 800 &amp; mgr; l pro 400 &amp; mgr; l der Probe). Das Gesamtvolumen beträgt 1.241 &amp; mgr; l. </li><li> Gut mischen und Inkubation bei -80 ° C für mindestens 2 h. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15 Minuten bei 11.363 × g bei 4 o C </li><li> verwerfen Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. </li><li> In 500 &amp; mgr; l kaltem 70% Ethanol. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 Minuten bei 11.363 × g bei 4 o C </li><li> verwerfen Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.9.6 - 1.9.7 einmal und entfernen Sie alle verbleibenden Restüberstand. </li><li> Der Luft trocknen das Pellet für ~ 5 min. Nicht ganz das Pellet trocknen. </li><li> Resuspendieren DNA-Pellet in 37,5 ul DNase-freiem Wasser oder andereentsprechende Volumen des Puffers. </li><li> Legen Sie die DNA auf Eis oder lagern Sie die DNA bei -20 ° C oder darunter bis zur weiteren Verwendung. </li><li> Überprüfen Sie, dass die Gesamtmenge an DNA über 20 ng, (zB verwenden fluorimetrischen Quantifizierung System, siehe Materialien Tabelle). </li></ol></li></ol> 2. Sequenzierung <ol><li> Verwenden Sie die DNA-Fragmente aus MBDCap Verfahren zur Sequenzierung gewonnen. Für jede Probe wurden sequenziert werden insgesamt 20 bis 40 ng DNA wird für Bibliotheks Vorbereitung erforderlich. </li><li> Für die DNA-seq Bibliothek Vorbereitung eine vollautomatisierte Bibliothek Bausystem verwenden (siehe Werkstoff - Tabelle) und das Standardprotokoll des Herstellers folgen. Wählen Sie DNA-Fragmente mit einer Größe von 200 bis 400 bp für Bibliothek Vorbereitung. Die Automatisierung Bibliothek Vorbereitungssystem ermöglicht die Bibliothek Herstellungsverfahren zu standardisieren und die Unterschiede zwischen den Proben durch manuelle Vorbereitung minimiert wird. </li><li> Verwenden Adapter primers und 100x Konzentration verdünnen. Davon verwenden 10 &amp; mgr; l für jede Probe. </li><li> Nach dem Schritt 2.2, nehmen Sie die Reaktion aus, und Quantifizierung der DNA-seq Bibliothek eine fluorometrische Quantifizierungssystem (siehe Materialien Tabelle). <ol><li> Richten Sie die PCR-Amplifikation Verfahren. Die Wahl der PCR-Master-Mix ist die PCR-Effizienz von GC angereicherten Bereich des Genoms zu verbessern. In einem PCR - Röhrchen werden 15 &amp; mgr; l DNA-seq Bibliothek, 25 &amp; mgr; l PCR - Master - Mix (siehe Werkstoff - Tabelle), 2 Primermix ul PCR (siehe Materialien Tabelle) und 8 &amp; mgr; l H 2 O </li></ol></li><li> Folgen PCR Empfehlung des Herstellers des PCR - Mastermix, Zykluszeiten verändert und die Temperaturen für unterschiedliche Ausgangsmaterialien: 98 o C für 45 s, X Zyklen von 98 o C für 15 s, 65 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s, und dann 72 o C für 1 min. Halten bei 4 o C <ol><li> Perform genug Zyklen mit 2 bis am Ende - 10 nM von Bibliotheks-DNA (8 - 10 Zyklen). </li></ol></li><li> Clean up PCR - Reaktion mit 1: 1 - Verhältnis von PCR - Reinigungs - Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Werkstoff - Tabelle). </li><li> Eluieren mit 20 - 30 &amp; mgr; l Elutionspuffer. </li><li> Barcode-jede Probe und Pool 4 Proben zusammen in eine Spur einer Durchflusszelle. Verwenden Sie die Standard - 50 bp einzelnen Lese Protokoll für die Sequenzierung (siehe Materialien Tabelle). </li></ol> 3. Bioinformatik-Analyse Hinweis: Weitere Verfahren die rohen fastq Dateien aus der Sequenzierung erhaltenen Qualitätskontrolle durchführen und das Mapping der kurze DNA-Sequenzen (liest) auf dem Genom. <ol><li> Verwenden Sie Bowtie kurze Lese Aligner, Genom Mapping-Tool auf jeder Probe fastq Datei zu verbinden das liest auf dem Referenzgenom. Viele Lese-Mapping-Tools zur Verfügung, diesen Schritt auszuführen und auf den individuellen Vorlieben verwendet werden. <ol><li> Es kann bis zu zwei Fehlpaarungen in der whole liest, während die Zuordnung zu dem Referenzgenom. Bericht bis zu 20 besten Ausrichtungen für jeden zu lesen. Verwenden Sie zum Beispiel Bowtie -V 2 --bester -k 20 --chunkmbs 200 &lt;ebwt&gt; &lt;fastqFile&gt; &lt;alignFile&gt;. </li></ol></li><li> Verwenden LONUT 9 zurückzufordern multiply kartiert liest die Detektion der angereicherten Regionen zu verbessern. Für jede Lese, höchstens eine Ausrichtung würde wiederhergestellt werden, wenn es sich nahe genug an einer der oben genannten Spitzen. Verwenden Sie zum Beispiel: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 &lt;alignFile&gt; &lt;OutputPath&gt;. LONUT werden die folgenden Schritte durchführen. <ol><li> Split Ausrichtungen in eindeutig liest abgebildet und mehrfach liest abgebildet. Anruf Peak auf der eindeutig abgebildet liest mit Spitzen Anrufer Band 11. Die Option -w 250 und -p 99 im Beispielbefehl für Gürtel. </li><li> Combine eindeutig abgebildet liest mit der wiedergewonnene liest aus LONUT erhalten, und die kombinierten liest im Bett Format wird in die weitere Analyse verwendet werden. Berechnen Sie die Anzahl der combined liest für zukünftige Normalisierung. </li></ol></li><li> Bin das liest. Auszug liest in der Region von Interesse Perl-Skript: perl methyPipeline.pl &lt;sampleInfoFile&gt; &lt;refGeneFile&gt; -up &lt;stromaufwärts verlaufende Länge&gt; dn &lt;stromabwärts verlaufende Länge&gt;. Für jedes Bett-Datei im sampleInfoFile aufgeführt, führt das Perl-Skript die folgenden Aufgaben. Hinweis: Siehe ergänzende Codierung Datei für das Perl-Skript. <ol><li> Bin das liest in fixed bin Größe, zB 100 bp, 24 Chromosomen. </li><li> Für jedes Gen in refGeneFile angegeben, extrahieren die Behälter um Transkriptionsstartstelle (TSS), bis zur Verlängerung Länge von Option -up und -dn angegeben. Extrahieren Sie beispielsweise die Daten in der Region, die vor- und nachgelagerten 4 kb von TSS ist. Bei Bingröße 100 bp, extrahiert diese Daten haben 81 Bins und das Zentrum bin entspricht der TSS. </li><li> Für das Gen auf dem Antisense-Strang, drehen Sie den extrahierten Bereich von links nach rechts, so dass vorgeschalteten Behälter immer sind pladie linke Seite mit dem Perl-Skript ced auf. </li><li> Ferner teilen die TSS ± ​​4 kb-Region in drei Teilbereiche: Links, Upstream 4 kb 2 kb stromaufwärts; Mittel, die vor- und nachgelagerten 2 kb; Richtig, Downstream 2 kb bis 4 kb. </li><li> Für jede Probe, teilen Sie die Anzahl der in jedem Fach liest durch die Gesamtzahl der kombinierten in 3.3.3 berechnet abgebildet liest. Die Normalisierung wird die Probe spezifische lesen Unterschiede zu beseitigen und erlaubt es dem liest in verschiedenen Proben zu vergleichen. </li></ol></li><li> Führen Sie die Bash-Skript (wie in der Skriptdatei angegeben) statistischer Test auf der normalisierten auszuführen liest aus dem linken Bereich erhalten, Differential-Methylierung zwischen normalen und Fallgruppe in den Regionen wie im Flankenbereich beschrieben zu erfassen. Hinweis: Siehe die zusätzliche Codierung Datei für die Bash-Skript. Basierend auf den Bereichen, die differenziell methyliert sind, gibt es sieben Kombinationen: Ganze Region: Differential-Methylierung während des TSS ± ​​4 kb-Region middleLeft: Differential-Methylierung in den beiden mittleren und linken Bereich Middle: Differential-Methylierung in den beiden mittleren und rechten Bereich Flank: Differential-Methylierung in linke und rechte Region nur Differential-Methylierung in der linken Region: links Rechts: Differential-Methylierung in der rechten Region nur nur Differential-Methylierung in der mittleren Region: Mittel </li><li> Verwenden Sie die gleiche Bash-Skript, das Differential-Methylierung in einem Tornado Plot zu visualisieren. Zeichnen Sie die Hyper- und Hypo methylierte Gene auf einer separaten Platte, und in der Reihenfolge der Region Kombination sortieren, wie in 3.4 beschrieben sind. </li></ol>

<ol>
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Dieses Protokoll wird in den Labors von Dr. Tim Huang und Dr. Victor Jin an der University of Texas Health Science Center in San Antonio entwickelt.

Die MBDCap-seq - Technik ist eine Affinitätsanreicherung Ansatz 3 als kostengünstige Alternative angesehen , wenn Kohorten mit einer großen Anzahl von Patienten 15 zu untersuchen. Die Pipeline präsentiert hier beschreibt einen umfassenden Ansatz von der Probenbeschaffung bis zur Datenanalyse und Interpretation. Einer der wichtigsten Schritte setzt ein PCR-Amplifikationsverfahren, um die Effizienz der PCR GC angereicherte Regionen in dem Genom zu verbessern, da dies ist, wo die DNA-Methylierung stattfindet. Auch ist...

Epigenetischen Regulation der Gene durch DNA - Methylierung ist eine der wesentlichen Mechanismen erforderlich , um die Zellschicksal durch stabile Differenzierung verschiedener Gewebearten in dem Körper 1 zu bestimmen. Dysregulation dieses Verfahrens wurde 2 verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs zu verursachen bekannt. Dieses Verfahren umfasst im Wesentlichen die Zugabe von Methylgruppen auf dem Cytosin - Rest in der CpG Dinukleotide DNA 3. Es gibt verschiedene Techniken , die derzeit diesen Mechanismus zu untersuchen, die jeweils ihre eigenen Vorteile, wie 2-8 in vielen Studien beschrieben. Hier werden wir eine dieser Techniken diskutieren namens Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), wo wir eine Affinität Anreicherungsmethode verwenden, um methylierte Bereiche der DNA zu identifizieren. Diese Technik baut auf dem methyl-Bindungsfähigkeit des MBD2-Proteins für die genomische DNA-Fragmente enthalten, methylierte CpG-Stellen zu bereichern. Wir verwenden eine kommerzielle methylierte DNA-Anreicherung Kitfür die Isolierung dieser methylierten Regionen. Unser Labor hat Hunderte von Patientenproben mit dieser Technik gezeigt und hier bieten wir ein umfassendes optimiertes Protokoll, das verwendet werden kann große Patientengruppen zu untersuchen. Wie sich bei jeder Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation erfordert MBDCap-seq auch einen spezifischen Ansatz der Bioinformatik, um das Niveau der Methylierung in den Proben genau zu quantifizieren. Es wurden in dem Bemühen viele neuere Studien, die Normalisierung und Analyseprozess der Sequenzierungsdaten 9, 10 zu optimieren. In diesem Protokoll zeigen wir eine dieser Methoden eine einzigartige Lese Recovery-Ansatz der Umsetzung - LONUT - gefolgt von linearen Normalisierung jeder Probe, um unvoreingenommene Vergleiche über große Anzahl von Patientenproben zu ermöglichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methylminer DNA enrichment Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ME10025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>112-05D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus Sonication Device</td>
			<td>diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M sodium acetate pH 5.2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRIworks Fragment Library System I</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A50100</td>
			<td>Fully automated library construction system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter Primers</td>
			<td>Bioo Scientific</td>
			<td>514104</td>
			<td>PCR primer mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>Fluorometric Quantitation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR master mix</td>
			<td>KAPA scientific</td>
			<td>KK2621</td>
			<td>PCR master mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR Purification beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EB Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq 2000 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methyl-binding dna capture sequencing for patient tissues

Methylierungs ist eines der wesentlichen epigenetische Modifikationen an der DNA, die für die genaue Regulierung von Genen verantwortlich ist, die für eine stabile Entwicklung und Differenzierung von verschiedenen Gewebetypen. Dysregulation dieses Verfahrens ist oft das Kennzeichen von verschiedenen Krankheiten wie Krebs. Hier haben wir eine der jüngsten Sequenzierungstechniken skizzieren, Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), verwendet Methylierung in für große Patientenkohorten verschiedenen normalen und Krankheit Gewebe zu quantifizieren. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll dieser Affinitätsanreicherung Ansatz zusammen mit einer Bioinformatik Pipeline optimale Quantifizierung zu erreichen. Diese Technik ist verwendet worden Hunderte von Patienten in verschiedenen Krebsarten als Teil der 1000 Methyloms Projekt (Cancer Methylome System) zu sequenzieren.

Wir haben MBDCap-seq verwendet , um DNA - Methylierungs Veränderungen in einer großen Anzahl von Patienten , die an verschiedenen Krebsarten einschließlich Brust- 12, endometrial 13, der Prostata 14 und Leberkrebs unter anderem studieren. Hier zeigen wir einige Informationen aus der Studie Brustkrebs vor kurzem 12 veröffentlicht. In diesem Fall haben wir das gesamte Genom-Sequenzierung Ansatz zu CpG-Inseln zu identifizieren, die in den normalen bezüglich der Tumor in verschiedenen genomischen...

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

methyl-binding-dna-capture-sequencing-for-patient-tissues

Research

JoVE Journal

Genetics

8.5K Aufrufe.  University of Texas Health Science Center at San Antonio.  Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline. 

Serie: Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics of these pathogens, in part due to a lack of well-developed genetic and genomic resources. These organisms have large, repetitive genomes, which have made genome sequencing and assembly prohibitively difficult. Here, we describe methods for the collection, extraction, purification and quality control assessment of high molecular weight genomic DNA from one powdery mildew species, Golovinomyces cichoracearum. The protocol described includes mechanical disruption of spores followed by an optimized phenol/chloroform genomic DNA extraction. A typical yield was 7 &#181;g DNA per 150 mg conidia. The genomic DNA that is isolated using this procedure is suitable for long-read sequencing (i.e., &#62; 48.5 kbp). Quality control measures to ensure the size, yield, and purity of the genomic DNA are also described in this method. Sequencing of the genomic DNA of the quality described here will allow for the assembly and comparison of multiple powdery mildew genomes, which in turn will lead to a better understanding and improved control of this agricultural pathogen.

Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.

Reinigung von High Molecular Weight genomischer DNA aus Echten Mehltaus für Long-Read-Sequenzierung

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a protocol for performing the chromatin conformation capture technique in situ Hi-C on staged Drosophila melanogaster embryo populations. The result is a sequencing library that allows the mapping of all chromatin interactions that occur in the nucleus in a single experiment. Embryo sorting is done manually using a fluorescent stereo microscope and a transgenic fly line containing a nuclear marker. Using this technique, embryo populations from each nuclear division cycle, and with defined cell cycle status, can be obtained with very high purity. The protocol may also be adapted to sort older embryos beyond gastrulation. Sorted embryos are used as inputs for in situ Hi-C. All experiments, including sequencing library preparation, can be completed in five days. The protocol has low input requirements and works reliably using 20 blastoderm stage embryos as input material. The end result is a sequencing library for next generation sequencing. After sequencing, the data can be processed into genome-wide chromatin interaction maps that can be analyzed using a wide range of available tools to gain information about topologically associating domain (TAD) structure, chromatin loops, and chromatin compartments during Drosophila development.

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

This work describes a protocol for the generation of high resolution in situ Hi-C libraries from tightly staged pre-gastrulation Drosophila melanogaster embryos.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...