Name: genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
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	<li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor.">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li><li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. 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著者は宣言することは何もありません。

タンパク質のホモオリゴマーの形成は、転写因子、酵素、イオンチャンネルおよび受容体25,26の活性を調節する基本的な生物学的プロセスです。重要なことは、タンパク質のオリゴマー化はまた、神経変性および催不整脈心臓病4,27などの病理学的な意味を持ちます。この記事で概説した方法は、タンパク質の自己会合およびオリゴマー化を媒介するドメイン - ドメイン相互作用を同定するために使用されます。以下では、各プロトコル内の重要なステップでポイントして、我々は重要な考慮事項、制限事項およびトラブルシューティングについて説明します。 Y2H系は、その比較的高いスループットスクリーニング、使いやすさと再現性の高い結果の潜在的な相互作用タンパク質パートナーをスクリーニングするために最初に使用することができます。 Y2H手順は、標準的な（プレートまたはシェーカー）インキュベーター、ルーム封じ込め施設で微生物検査室で行われます。 FRの使用β-Galのアッセイで最高の結果を得るために、新たに（古い5日まで）酵母コロニーを増殖させ（ステップ1.2.3）を使用すべきであるのに対し、eshly調製したコンピテント細胞（ステップ1.1.8）は、高効率の酵母形質転換のために重要です。 GAL4以外の転写因子および/または代替/追加のレポーター遺伝子に基づいたシステムは、利用可能であるため、ベイトおよびプレイプラスミドは、適切なY2H株と一致する必要があります。 いくつかの株は、HIS3レポーター遺伝子7,8のいずれかの構成的発現をクエンチするために、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール、HIS3タンパク質の競合的阻害剤の存在下で培養すべきです。餌とターゲット融合タンパク質の発現は、17を免疫ブロッティングによって確認する必要があります。場合餌に/餌の融合タンパク質は、酵母に対して毒性である、より低い許容タンパク質レベルはベイト/獲物発現が異なるプロモーターによって駆動される別のベクターにクローニングすることにより達成することができます。また、Tを確保するために不可欠です帽子餌/獲物の融合タンパク質は、自律的なレポーター遺伝子活性は表示されません。自律的なレポーター遺伝子の活性化は、2試験タンパク質のGAL4 DNA-BDとAD融合体を交換することにより、責任領域を除去するための構築物を修飾することによって救出することができます。それらが細胞内膜区画における融合タンパク質のミスフォールディングまたは誤局在を引き起こす可能性があるため、また、膜貫通ドメインは、より良好な餌/餌構築物から省略されています。実際、Y2H系の主な欠点は、餌とターゲットタンパク質は、偽陽性または偽陰性の相互作用6-9で、その結果、離れてそれらの生理学的細胞内位置から酵母核に局在し、潜在的に特定の翻訳後修飾を欠いているということです。 哺乳動物の異種発現系は、立体構造、翻訳後修飾および細胞内局在性の観点から、哺乳動物の内在性膜タンパク質の研究に適しています。最も広く使用される細胞のトランスフェクション法の一つは、主に最小限の設備および試薬11,15を必要とするリン酸カルシウム沈殿です。別の方法、すなわちエレクトロポレーション、リポソーム、カチオン性脂質およびポリマーは、使用される細胞株および構築物に依存して、より高いトランスフェクション効率をもたらすことができます。一般的に、トランスフェクション効率に影響を与える主な要因は、プラスミドDNAの質および細胞の健康/生存率です。最高純度の（260nmの/ 280nmの吸光度比〜1.8）と活発に分裂する細胞のプラスミドDNAを使用した場合に最良の結果が達成されます。外来DNAを取る能力が媒体11に曝露された細胞の表面領域に関連しているので、70％コンフルエンス（ステップ2.1.2） -細胞は、したがって、これ以上60以下でトランスフェクトされるべきです。さらに、トランスフェクション（ステップ2.1.3）中の培養培地中の抗生物質の含有が増加した細胞死の15のために推奨されません。 Fまたは特に、リン酸カルシウム沈殿、入念な準備及びpH調整（7.05まで正確に）2×HBS溶液を（ステップ2.1.1）、そして激しく混合（ステップ2.1.5）によりプラスミドDNA /カルシウム/リン酸複合体の適切な形成は、高効率トランスフェクションのための重要なステップ。一般的に、24内の一過性トランスフェクションピークによってタンパク質の発現 - 72時間。 細胞を回収したら、その後の手順は、プロテアーゼ活性を最小化するために4℃で実施しなければならない、およびプロテアーゼ阻害剤の添加が推奨されます。染色体DNAは、溶液粘度が増加し、非特異的結合を高めることができるので、細胞の均質化は、核を除去するための遠心分離工程が続くべきです。従って、等浸透圧緩衝液中で機械的手段により均質化は、通常、（0.3 M）のスクロースまたは（150 mM）のNaCl中で、好ましいです。一般に、スクロースベースの緩衝液は、タンパク質安定性を増強し、潜在的な非天然タンパク質凝集を減少させることが知られているが、Pのためにタンパク質表面上の基準の水和は、静電タンパク質間相互作用が好まれています。逆に、塩系緩衝剤は、より疎水性に基づく相互作用28に向かってバイアスを有する、タンパク質表面上の荷電したアミノ酸側鎖基の正味の電荷に影響を与えます。 共IPは、特に天然の組織からのタンパク質 - タンパク質相互作用を評価するための最も一般的に用いられる生化学アッセイです。その主な欠点は、IPおよびイムノ10,16,18で使用するために検証され、高度に特異的な抗体のための必要条件です。従って、組換えタンパク質は、多くの場合、 例えば 、ペプチドエピトープでタグ付けされている。、インフルエンザ赤血球凝集素（YPYDVPDYA）またはヒトCMYC（EQKLISEEDL）、高親和性特異的な抗体が市販されています。必要であれば、免疫沈降抗体は、化学的共沈PRを明瞭に免疫ブロッティング段階でその溶出および検出を回避するために、プロテインA樹脂に結合させることができます16 otein;これを達成するために、我々が正常に化学架橋剤3,3&#39;-ジチオビス（sulfosuccinimidylpropionate）24を使用しています。適切な界面活性剤は、IP緩衝液中に含まれ、均質化細胞の不溶性物質は、非特異的結合（ステップ3.1.3）を最小化するために遠心分離によって除去されることが不可欠です。洗剤の選択と集中が重要な考慮事項です：強力な洗剤および/またはより高い濃度は、実質的に非特定の結合を減少させるだけでなく、X廃止することがあります。より低濃度またはより穏やかな洗剤は弱い相互作用が観察されることを可能にする一方で、Yのタンパク質相互作用をするがよいです過剰な非特異的結合をもたらします。中間強度の界面活性剤は、 例えば 、好ましい、トリトンX-100を0.5に- 1％の濃度です。さらに、非特異的結合を減少させるために、中性タンパク質（100μg/ mlの、例えば、ウシ血清アルブミン）をIP緩衝液中に含めることができ、および/ ​​または細胞溶解物は、事前cleareすることができ単独のプロテインA樹脂とのインキュベーションの前でD。洗浄回数はX用に最適化されるべきである：Yのペアは、試験された、一般的にIPバッファ（ステップ3.1.9）で3 10分間の洗浄。いずれの場合も、免疫沈降抗体として、非免疫IgGと共IPサンプルは常に陰性対照（ステップ3.1.6）を提供するために並列に処理されるべきです。 化学的架橋の主な利点は、それがタンパク質のホモオリゴマーの化学量論組成に知らせることです。それは特殊な装置を必要とせず、それが相互作用するタンパク質19,20の間に熱的および化学的に安定な架橋を生成するので、グルタルアルデヒドは、一般的に使用される架橋剤です。これらは、化学反応を停止しますので、遊離アミノ基を有する化合物は、アッセイバッファ（ステップ3.2.1）から除外されるべきです。グルタルアルデヒド濃度と反応時間（ステップ3.2.4）は、関心のオリゴマータンパク質複合体のために最適化されるべきです。この技術の主な欠点、especi全細胞調製物に対して行わ味方場合、生物学的意義を欠く人工タンパク質凝集体を得ることができ、化学反応の非特異性です。 代替インビボで （ 例えば 、蛍光共鳴エネルギー転移、二分子蛍光又はルミネセンス相補性）およびインビトロ技術（ 例えば 、サイズ排除クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、等温滴定熱量測定）タンパク質の自己会合及び評価の特徴付けのために利用可能ですオリゴマーの化学量論29,30の。それぞれの方法は、独自の長所と短所があり、それは、タンパク質精製/安定性及び装置/試薬の利用可能性に応じて、特定のタンパク質の研究のために、より適切であり得ます。ここで詳細に説明した3つの相補的な方法、すなわちY2H、共IP及び架橋は、RyR2のホモoligomeための説得力のある証拠を提供するために組み合わせて使用​​されています分離および生体細胞内のrを形成。

骨格筋および心筋の収縮はのRyRにより媒介筋小胞体のCa 2+放出によって誘発されます。 4つの同一のサブユニットから成る機能チャネルと3の哺乳動物のRyRアイソフォームがあります。それぞれのRyRサブユニットは、大きな細胞質調節N末端 ​​部分及び高コンダクタンスの Ca 2+の細孔を形成する膜貫通ドメインを含む小さなC末端部分から成ります。異常内およびサブユニット間相互作用は、のRyRチャネルの機能障害の根底にある神経筋や心臓障害1になります。 RyR構造に関与する特定のドメインの同定および特徴：機能の関係はのRyRの病態生理の理解のために、したがって重要です。 伝統的な生化学的タンパク質 - タンパク質相互作用の技術は、多くの場合、細菌中で産生され精製されたタンパク質の実質的な量を、必要とします。これはのRyR、非常に大きな膜pの場合には現実的ではありませんその組換えフラグメントが細菌発現および精製が容易に受け入れられないのに対し、〜5000個のアミノ酸からなるrotein。したがって、真核生物宿主細胞を含む代替的な発現系は、哺乳動物の内在性膜タンパク質のために必要とされます。我々は以前、まとめN末端 ​​の四三の哺乳動物のRyRが2,3アイソフォーム間で保存されている構造的特徴であることを実証するためにY2H、共同IPおよび架橋アッセイを採用しています。重要なことは、我々は催不整脈性心疾患に関連した単一点変異は、N末端 ​​の自己会合および機能不全のRyRチャネル4の結果を破壊することを見出しました。我々はまたのRyR細胞質のC末端尾部5と同様に、相同細胞内Ca 2+放出チャネル、イノシトール1,4,5-トリスリン酸受容体2のN末端 ​​のオリゴマー化の研究にこれらの技術を適用しています。 Y2Hアッセイでは、interacti二つのタンパク質（XとY）の間に機能的な転写因子（GAL4）およびレポーター遺伝子6-9の続く活性化を再構成することによって測定されます。 DNA結合ドメイン（DNA-BD）/タンパク質Xの融合（ベイト）と活性化ドメイン（AD）/タンパク質Y 2つの異なるクローニングベクターは、GAL4の2つの物理的に分離、独立したドメインを有する2つの試験タンパク質の融合体を生成するために使用されます融合（ターゲット）。 Y2Hタンパク質がGAL4 DNA-BDと同じタンパク質のAD融合物を生成することによって、それ自体と相互作用するかどうかをテストするために使用することができます。遺伝的に改変されたY2H株はGAL4とGAL80欠損（GAL80タンパク質がGAL4のリプレッサーである）、ならびにTRP1およびLEU2が欠損（それぞれ、ベイトおよびプレイプラスミドのための栄養選択を提供するために）です。酵母核に、組換えDNA-BDとADペプチドは唯一の彼らの融合 &#39;Xを通じてハイブリッドGAL4転写因子を生成するために物理的に近接させられる：Y int型eraction。このアプローチは、レポーター遺伝子（β-ガラクトシダーゼ（β-Gal）のためのLacZ符号化）と発色性（ヒスチジン生合成に必要な酵素のHIS3エンコーディング ）原栄養の並列転写活性化を介してタンパク質-タンパク質相互作用を検出するための迅速な遺伝子スクリーニングを可能にします。 Y2Hの主な利点は、それが弱いまたは一過性のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するin vivoアッセイであることです。また、検出は、餌と対象タンパク質の精製または特定の抗体の生成を必要とせず、簡単な（メディアヒスチジンを欠く中で）増殖選択の使用または比色の（β-Galの）アッセイを伴います。また、Y2Hはまた、ライブラリーのタンパク質のcDNAへの直接アクセスを与えるベイトタンパク質の新規の結合パートナー、ランダム未知のクローン（GAL4 ADに融合したcDNAライブラリークローン）のコレクションをスクリーニングすることができます。 Y2H観測を拡張するために、INDEPENDENT生化学的技術を使用することができます。共IP及びイムノブロッティングと組み合わせた架橋アッセイは、複雑なサンプル混合物中のタンパク質の関連を検出するために用いられる方法、 例えば 、全細胞溶解物10です。それらの主な利点は、組換えタンパク質の使用を必要とする他の方法とは異なり、天然の組織からのタンパク質 - タンパク質相互作用について報告することです。組換えタンパク質は、典型的には、彼らが正しいコンホメーションおよび翻訳後修飾を有する可能性がある哺乳動物細胞株、ならびに細胞内局在性に発現し、また使用することができます。共IPと架橋がインビトロアッセイは、均質化細胞を利用しているので、2つのタンパク質パートナーは、無傷の細胞11に共局在しているかどうかを確認する必要があります。我々は日常的に一過性リン酸カルシウム沈殿法2を用いて、哺乳動物の内在性膜および細胞質タンパク質を発現する哺乳動物HEK293細胞のトランスフェクションを使用し-4,12-14は、詳細にここで説明しました。これは、効率的に細胞内にプラスミドDNAを送達するための安価な方法ですが、それは特定の使用の細胞株および細胞コンフルエンスと同様に、プラスミドDNA 11,15の純度に依存しています。 共IPアッセイは、推定上の相互作用パートナー10,16の同時精製を可能にする非変性条件下での細胞溶解物からの関心の天然または組換えタンパク質の単離を伴います。タンパク質は、2つの異なるエピトープを有する2つの異なる融合物を生成することによって、それ自体と相互作用するかどうかをテストするために使用することができる2つの独立した抗体の使用、タンパク質Xの単離のための免疫沈降用抗体、およびタンパク質パートナーYの検出のためのイムノブロッティング抗体を必要としますタグ（ 例えば 、HAおよびCMYC）。免疫沈降抗体は、プロテインAには、そのFc領域を介して結合した（プロテインG、抗体が発生した動物種に応じてか）されていますアガロース（またはセファロース）樹脂に結合しています。タンパク質Xは、抗体により沈殿させる：タンパク質 - 樹脂細胞溶解物、均質化された細胞の、すなわち界面活性剤可溶性分画とのインキュベーション後。タンパク質の免疫複合体は、SDSを含む緩衝液で溶出させ、続いてタンパク質Y 17の存在を検出するために抗体を用いるSDS-PAGEおよびイムノブロッティングにより分析します。共IPは、過剰非特異的結合を回避するために、界面活性剤、水溶性タンパク質を用いて実施されるべきです。 Y対10,16,18：洗剤とその濃度の選択だけでなく、洗浄回数は、各X用に最適化されるべきです。 架橋は、オリゴマータンパク質複合体の化学量論を決定するために使用されます。これは、隣接する相互作用プロトマーの間に共有結合を生成する化学反応に基づいており、従って、それはSDS-PAGEの分離の際、タンパク質のオリゴマー状態の保存を可能にします。多数の架橋レアージュがありますタンパク質、典型的には、第一級アミン、カルボン酸またはチオール基に異なる反応基をターゲットに様々な長さと化学のNTS。ここでは、（OHC（CH 2）3 CHO）、リジン残基19,20中に存在する遊離アミノ基と反応するいずれかの端部に2つのアルデヒド基を有するホモ二官能性架橋剤がグルタルアルデヒドの使用を記載しています。架橋は、付加物形成をもたらす濃度 - または時間依存的な様式で行われます。グルタルアルデヒドの反応は、ヒドラジン（H 2 NNH 2）で停止し、タンパク質試料をSDS-PAGEによって分析し、それらのオリゴマー化状態を評価するために17を免疫ブロッティングしています。私たちは、架橋がオリゴマー化を誘導するが、単に既存のタンパク質複合体との間で安定したブリッジを作成していないことに注意してください。架橋実験を実施する重要な考慮事項は、架橋剤の選択は、その濃度と反応時間19,20を含みます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;PART 1 yeast two-hybrid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate incubator</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Used at 30 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Used at 30 &amp;deg;C with shaking at 230 - 250 rpm</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>To measure OD&lt;sub&gt;600&lt;/sub&gt; of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&amp;nbsp; and yeast strain Y190&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>To prepare minimal SD growh medium&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Herring testes carrier DNA&amp;nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>For yeast transformation</td></tr><tr><td>Whatman filter paper Grade 5&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrophenyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>for use in liquid b-Gal assay</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 2. Protein expression in a mammalian cell line&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg;&amp;nbsp;CRL-1573&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator (5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C)</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>To culture mammalian cells</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s medium)</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>41966</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>To prepare growth medium for mammalian cells</td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Needle 23 G (0.6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>To homogenise cells</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail (Complete)&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>To prevent proteolysis</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;PART 3. In vitro biochemical methods&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&amp;nbsp;</td><td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>For electrophoretic transfer</td></tr><tr><td>Compact X-ray film processor</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>For use in chemical cross-linking</td></tr><tr><td>Protein-A sepharose beads&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5280-01&amp;nbsp;</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Non-immune rabbit IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>For use in co-IP assay</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td><td>Santa Cruz Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>sc-40</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>For use in immunoblotting</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce (ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>For use in immunoblotting</td></tr></tbody></table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Y2Hシステムでは、餌は：餌の相互作用は、最初に（トリプトファン、ロイシンなど）、ヒスチジンを欠く培地中で酵母の増殖の選択によって試験され、その後、β-GAL酵素活性アッセイ（ 図1）によって評価しました。獲物タンパク質相互作用：中ヒスチジンを欠く中で培養した酵母は、餌の強さに依存遅い成長率を持っています。 β-Galのアッセイは、（のみトリプトファンおよびロイシンを欠く培地で培養）酵母で行わいずれか後者の収量定量結果で、（寒天プレート）固体支持体上または液体培地で成長しています。我々は成功したRyR2内のドメイン-ドメイン相互作用だけでなく、新規タンパク質パートナー2-4,12,21,22を識別するためにY2Hを使用しています。例えば、我々は、N末端断片との相互作用のためのRyR2ペプチド配列の全長にわたる構築重複する一連のスクリーニング（AD4L：のRyR2残基1 - 906のGAL4 ADと融合）3コロニーリフトフィルター紙β-GalのアッセイはBT4Lのための鮮やかな青色の酵母コロニー産：AD4Lペア（ 図2A）を 、AD4L自体と相互作用することを示す、すなわちBT4Lは（RyR2の残基1構築- GAL4と融合906 DNA-BD）。淡い青色のコロニーがBT8のために検出されました：極端なC末端ドメイン（BT8）との二弱い関連を示唆AD4Lペア、酵母、他の構築物で同時形質転換は、餌のための白、したがって、負のままであった：獲物タンパク質相互作用。液体β-Galのアッセイ（ 図2B）で得られた定量的結果は、堅牢なBT4Lを示した：AD4L相互作用同等の強度でp53タンパク質（PVA3）およびSV40ラージT抗原（PTD1）間の既知の関連を、BT8に対し：AD4L相互作用を（&lt;10％を対照と比較して）かなり弱かったです。 私たちは日常的に共同-IP実験（ 図3）は、fを行いますY2H所見2-4,12-14,21-24を強化するための独立した生化学的ア ​​ッセイとして、哺乳動物細胞株（HEK293）での一過性発現をollowing。 RyR2のN末端の自己相互作用を確認するために、RyR2の残基1をコードする二つの別々のプラスミド - CMYCまたはHAペプチドエピトープ（それぞれBT4L及びAD4L）のいずれかでタグ付け906は、リン酸カルシウム沈殿法を用いてHEK293細胞に同時トランスフェクトしました。 3。均質化した細胞の後の核画分を洗剤CHAPSで可溶化し、そして不溶性物質を、細胞溶解物を生成するために遠心分離によって除去しました。還元剤ジチオスレイトールで処理された細胞溶解物を、その後、HAタグ付きAD4Lを免疫沈降抗体HAおよびプロテインAセファロースビーズとインキュベートしました。 SDSを含む緩衝液で溶出共IP試料は、R、二つの別々のSDS-PAGEゲル（1/10と9/10 番目の分割）にロードおよびAB HAおよびAB CMYCを用いたイムノブロッティングにより分析しましたespectively。アブHAによるAD4Lの成功直接IP（〜100 kDa）がなく、非免疫ウサギIgG（ 図4A）を使用して、負の制御では、イムノブロット法により確認しました。重要なことは、CMYCタグ付きBT4L（〜100 kDa）がなく、免疫沈降AD4L（ 図4B）の不在下での負の制御では、唯一の抗体HA IPで回収しました。 Y2Hと共同IPアッセイは、RyR2のN末端の自己相互作用のための一貫性のある証拠を提供し、彼らはそれが唯一の二量体以上の複合体を形成する、すなわちかどうか、N末端ドメインのオリゴマー化状態に通知しませんでした。複合体が解離することに留意すべきであるとのみからなるサブユニットは、タンパク質 - タンパク質相互作用を廃止するためにSDS-のSDS-PAGE及び熱誘導タンパク質の変性によって検出されます。これを克服するために、我々は、化学的安定既存proteiをconjoins架橋（ 図5）を使用しその分子量をSDS-PAGEのサイズ分離2-5で調べることができ、n個のオリゴマー、。例えば、還元剤ジチオスレイトールで処理CMYC-BT4Lを発現するHEK293細胞ホモジネートを、グルタルアルデヒドと反応し、抗体CMYC（ 図6）を使用して、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングによって分析しました。単量体（〜100 kDaの）に加えて、〜400キロダルトンの高分子量タンパク質バンドを、RyR2のN末端 ​​の四量体の形成3を示し、時間依存的に検出されました。特に、四量体は、最小限の二量体と観察トリマーバンドで、優勢なオリゴマー種でした。 15％勾配SDS-PAGEゲル3 -その見かけの分子量を決定するために、BT4Lオリゴマーは4を介して分離しました。私たちは30の範囲でタンパク質スタンダードを用いた分子質量/ゲル遅延標準曲線生産 - 460 kDaのを、私たちは358 kDaで15であることがオリゴマーを算出した（n = 4）。この見かけの分子量は、内​​に配置さBT4L四量体と一致していますネイティブのRyR2チャネル内の4つのサブユニットの配列から予想されるように、むしろ直線状に比べて円形のファッションを閉じました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> 図1. Y2Hフローチャート。酵母、同時形質転換餌とターゲットプラスミドで、培地ヒスチジンを欠く中で成長するために選択および/ ​​またはβ-Galの酵素活性についてアッセイされる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> 図2. Y2Hは、RyR2のN末端 ​​ドメインの自己相互作用を示唆している。ためにY2H系で試験したヒトのRyR2重複タンパク質断片の（餌）シリーズを描いた（A）の回路図<html> RyR2のN末端AD4L（獲物）との相互作用が構築します。コロニーリフトフィルター紙β-Galのアッセイによって得られた定性的結果は、「+」倍数かで示されている&quot; - &quot;負の相互作用のための陽性対照に対して標準化（B）定量的液体β-Galのアッセイ（PVA3は、GAL4 DNA-BDをコードします。 p53タンパク質との融合; PTD1は、SV40ラージT抗原とのGAL4 AD融合をコードします）。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> 図3 のCo-IPフローチャート。哺乳動物細胞、プラスミドXとYとの同時トランスフェクションは、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングに続いて、共IPアッセイにおいて使用される細胞溶解物を生成するために均質化し、界面活性剤で可溶化されています。F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> 図4. 共同-IPは、哺乳動物細胞内のRyR2 N末端 ​​ドメインの自己相互作用を示します。HEK293細胞は、CMYCタグ付き（BT4L）の一過性同時発現およびHAタグ（AD4L）のRyR2 N末端 ​​ドメインの同時トランスフェクトしました（残基1から906）。陰性対照として、共同IPアッセイは非免疫ウサギIgGを用いて行ったのに対しAD4Lは、CHAPS可溶化及びジチオスレイトール処理したHEK293の溶解物からのAb HAを用いて免疫沈降させました。免疫沈降したタンパク質を、5分間85℃に加熱し、そして1/10またはIP試料の9/10 番目を装填別個の6％SDS-PAGEゲルを介して3時間20mAで分離しました。 polyvinyへ2時間80 Vで、以下のタンパク質の転送抗体HA（A）または抗体CMYC西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG、続いて、それぞれ、（B）、（1：10,000希釈）および増強化学発光検出：lideneジフルオリド膜は、免疫ブロット分析は、（千希釈1）を用いて行きました（1分間露光）。細胞溶解物のアリコートを、IP試料で処理体積の1/50には 、また、分子質量標準を提供するために含めました。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> プラスミドXをトランスフェクトし、図5 の架橋フローチャート。哺乳動物細胞は、SDS-PA続いて、均質化および架橋アッセイでグルタルアルデヒドとの反応に供されますGEおよびイムノ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> 図6. 架橋は、RyR2のN末端 ​​ドメイン四量体形成を示す HEK293細胞は、CMYCタグ付き（BT4L）のRyR2 N末端 ​​ドメイン（残基1から906）の一過性発現のためにトランスフェクトしました。還元剤ジチオスレイトールで処理した細胞ホモジネートを、示された時間ポイントのグルタルアルデヒドを用いてインキュベートしました。サンプルを5分間85℃に加熱し、3時間20mAでSDS-PAGE（6％ゲル）により分離しました。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（1、続いて：（千希釈1）抗体CMYCをポリビニリデンジフルオリド膜上に2時間、80 Vでのタンパク質の転写後、免疫ブロット分析を用いて行きました。10,000希釈）および強化化学発光検出（1分間露光）。モノマー（M：〜100キロダルトン）と四量体（T）の形態は、矢印で示されています。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.4K ビュー.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

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Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

生化学

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. However, there is still little information about how insoluble protein aggregates exert their toxic effects in vivo. Simple prokaryotic and eukaryotic model organisms, such as bacteria and yeast, have contributed significantly to our present understanding of the mechanisms behind the intracellular amyloid formation, aggregates propagation, and toxicity. In this protocol, the use of yeast is described as a model to dissect the relationship between the formation of protein aggregates and their impact on cellular oxidative stress. The method combines the detection of the intracellular soluble/aggregated state of an amyloidogenic protein with the quantification of the cellular oxidative damage resulting from its expression using flow cytometry (FC). This approach is simple, fast, and quantitative. The study illustrates the technique by correlating the cellular oxidative stress caused by a large set of amyloid-&#946; peptide variants with their respective intrinsic aggregation propensities.

Protein aggregation elicits cellular oxidative stress. This protocol describes a method for monitoring the intracellular states of amyloidogenic proteins and the oxidative stress associated with them, using flow cytometry. The approach is used to study the behavior of soluble and aggregation-prone variants of the amyloid-&#946; peptide.

酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be employed using a conventional confocal microscope equipped with digital detectors. A protocol for the use of the technique in vitro is shown by means of a use case where number and brightness can be seen to accurately quantify the oligomeric state of mVenus-labelled FKBP12F36V before and after the addition of the dimerizing drug AP20187. The importance of using the correct microscope acquisition parameters and the correct data preprocessing and analysis methods are discussed. In particular, the importance of the choice of photobleaching correction is stressed. This inexpensive method can be employed to study protein-protein interactions in many biological contexts.

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

This protocol describes a calibration-free approach for quantifying protein homo-oligomerization in vitro based on fluorescence fluctuation spectroscopy using commercial light scanning microscopy. The correct acquisition settings and analysis methods are shown.

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest control. To date, several diamide insecticides targeting pest RyRs have been commercialized, which generate annual revenue of 2 billion U.S. dollars. But comprehension of the mode of action of RyR-targeting insecticides is limited by the lack of structural information regarding insect RyR. This in turn restricts understanding of the development of insecticide resistance in pests. The diamondback moth (DBM) is a devastating pest destroying cruciferous crops worldwide, which has also been reported to show resistance to diamide insecticides. Therefore, it is of great practical importance to develop novel insecticides targeting the DBM RyR, especially targeting a region different from the traditional diamide binding site. Here, we present a protocol to structurally characterize the N-terminal domain of RyR from DBM. The x-ray crystal structure was solved by molecular replacement at a resolution of 2.84 &#197;, which shows a beta-trefoil folding motif and a flanking alpha helix. This protocol can be adapted for the expression, purification and structural characterization of other domains or proteins in general.

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

In this article, we describe the protocols of protein expression, purification, crystallization and structure determination of the N-terminal domain of&#160;ryanodine receptor from diamondback moth (Plutella xylostella).

コナガからのリアノジン受容体の N 末端ドメインの結晶構造

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. While the outer surface membrane and associated TATS membrane components appear to be continuous, there are substantial differences in lipid and protein content. In ventricular myocytes (VMs), certain TATS components are highly abundant contributing to rectilinear tubule networks and regular branching 3D architectures. It is thought that peripheral TATS components propagate action potentials from the cell surface to thousands of remote intracellular sarcoendoplasmic reticulum (SER) membrane contact domains, thereby activating intracellular Ca2+ release units (CRUs). In contrast to VMs, the organization and functional role of TATS membranes in atrial myocytes (AMs) is significantly different and much less understood. Taken together, quantitative structural characterization of TATS membrane networks in healthy and diseased myocytes is an essential prerequisite towards better understanding of functional plasticity and pathophysiological reorganization. Here, we present a strategic combination of protocols for direct quantitative analysis of TATS membrane networks in living VMs and AMs. For this, we accompany primary cell isolations of mouse VMs and/or AMs with critical quality control steps and direct membrane staining protocols for fluorescence imaging of TATS membranes. Using an optimized workflow for confocal or superresolution TATS image processing, binarized and skeletonized data are generated for quantitative analysis of the TATS network and its components. Unlike previously published indirect regional aggregate image analysis strategies, our protocols enable direct characterization of specific components and derive complex physiological properties of TATS membrane networks in living myocytes with high throughput and open access software tools. In summary, the combined protocol strategy can be readily applied for quantitative TATS network studies during physiological myocyte adaptation or disease changes, comparison of different cardiac or skeletal muscle cell types, phenotyping of transgenic models, and pharmacological or therapeutic interventions.

In cardiac myocytes, tubular membrane structures form intracellular networks. We describe optimized protocols for i) isolation of myocytes from mouse heart including quality control, ii) live cell staining for state-of-the-art fluorescence microscopy, and iii) direct image analysis to quantify the component complexity and the plasticity of intracellular membrane networks.

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

生物工学

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

生物学

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven. In many cases membrane-spanning proteins have evolved highly sophisticated mechanisms of action.1-3 One way in which membrane proteins can modulate their structures and functions is by direct and specific contact of hydrophobic helices, forming structured transmembrane oligomers.4,5 Much recent work has focused on the distribution of amino acids preferentially found in the membrane environment in comparison to aqueous solution and the different intermolecular forces that drive protein association.6,7 Nevertheless, studies of molecular recognition at the transmembrane domain of proteins still lags behind those of water-soluble regions. A major hurdle remains: despite the remarkable specificity and affinity that transmembrane oligomerization can achieve,8 direct measurement of their association is challenging. Traditional methodologies applied to the study of integral membrane protein function can be hampered by the inherent insolubility of the sequences under examination. Biophysical insights gained from studying synthetic peptides representing transmembrane domains can provide useful structural insight. However, the biological relevance of the detergent micellar or liposome systems used in these studies to mimic cellular membranes is often questioned; do peptides adopt a native-like structure under these conditions and does their functional behaviour truly reflect the mode of action within a native membrane? In order to study the interactions of transmembrane sequences in natural phospholipid bilayers, the Langosch lab developed ToxR transcriptional reporter assays.9 The transmembrane domain of interest is expressed as a chimeric protein with maltose binding protein for location to the periplasm and ToxR to provide a report of the level of oligomerization (Figure 1).
In the last decade, several other groups (e.g. Engelman, DeGrado, Shai) further optimized and applied this ToxR reporter assay.10-13 The various ToxR assays have become a gold standard to test protein-protein interactions in cell membranes. We herein demonstrate a typical experimental operation conducted in our laboratory that primarily follows protocols developed by Langosch. This generally applicable method is useful for the analysis of transmembrane domain self-association in E. coli, where &#946;-galactosidase production is used to assess the TMD oligomerization propensity. Upon TMD-induced dimerization, ToxR binds to the ctx promoter causing up-regulation of the LacZ gene for &#946;-galactosidase. A colorimetric readout is obtained by addition of ONPG to lyzed cells. Hydrolytic cleavage of ONPG by &#946;-galactosidase results in the production of the light absorbing species o-nitrophenolate (ONP) (Figure 2).

An efficient procedure to assess the oligomerization propensity of single-pass transmembrane domains (TMDs) is described. Chimeric proteins consisting of the TMD fused to ToxR are expressed in an E. coli reporter strain. TMD-induced oligomerization causes dimerization of ToxR, activation of transcription and production of the reporter protein, -galactosidase.

ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

The oversimplified view of protein transmembrane domains as merely anchors in phospholipid bilayers has long since been disproven.  In many cases ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Functional Characterization of Endogenously Expressed Human RYR1 Variants

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia susceptibility, core myopathies and centronuclear myopathy. Because of the diverse phenotypes linked to RYR1 mutations it is fundamental to characterize their functional effects to classify variants carried by patients for future therapeutic interventions and identify non-pathogenic variants. Many laboratories have been interested in developing methods to functionally characterize RYR1 mutations expressed in patients&#39; cells. This approach has numerous advantages, including: mutations are endogenously expressed, RyR1 is not over-expressed, use of heterologous RyR1 expressing cells is avoided. However, since patients may present mutations in different genes aside RYR1, it is important to compare results from biological material from individuals harboring the same mutation, with different genetic backgrounds. The present manuscript describes methods developed to study the functional effects of endogenously expressed RYR1 variants in: (a) Epstein Barr virus immortalized human B-lymphocytes and (b) satellite cells derived from muscle biopsies and differentiated into myotubes. Changes in the intracellular calcium concentration triggered by the addition of a pharmacological RyR1 activators are then monitored. The selected cell type is loaded with a ratiometric fluorescent calcium indicator and intracellular [Ca2+] changes are monitored either at the single cell level by fluorescence microscopy or in cell populations using a spectrofluorometer. The resting [Ca2+], agonist dose response curves are then compared between cells from healthy controls and patients harboring RYR1 variants leading to insight into the functional effect of a given variant.

Here methods used to study the functional effect of RYR1 mutations endogenously expressed in Epstein Barr Virus immortalized human B-lymphocytes and muscle biopsy derived satellite cells differentiated into myotubes are described.

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

More than 700 variants in the RYR1 gene have been identified in patients with different neuromuscular disorders including malignant hyperthermia ...

医学

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ

要約

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非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープンソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

コナガからのリアノジン受容体の N 末端ドメインの結晶構造

心房と心室から心筋細胞における管状膜ネットワークの解析

スペクトル的に解決された二光子顕微鏡を用いたGタンパク質共役受容体相互作用の in vivo定量で

ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価

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