この作品は、SZ（FS / 08/063とFS / 15/31494分の30）に英国心臓財団のフェローシップによってサポートされていました。

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	<li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor.">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li><li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. 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著者は宣言することは何もありません。

タンパク質のホモオリゴマーの形成は、転写因子、酵素、イオンチャンネルおよび受容体25,26の活性を調節する基本的な生物学的プロセスです。重要なことは、タンパク質のオリゴマー化はまた、神経変性および催不整脈心臓病4,27などの病理学的な意味を持ちます。この記事で概説した方法は、タンパク質の自己会合およびオリゴマー化を媒介するドメイン - ドメイン相互作用を同定するために使用されます。以下では、各プロトコル内の重要なステップでポイントして、我々は重要な考慮事項、制限事項およびトラブルシューティングについて説明します。 Y2H系は、その比較的高いスループットスクリーニング、使いやすさと再現性の高い結果の潜在的な相互作用タンパク質パートナーをスクリーニングするために最初に使用することができます。 Y2H手順は、標準的な（プレートまたはシェーカー）インキュベーター、ルーム封じ込め施設で微生物検査室で行われます。 FRの使用β-Galのアッセイで最高の結果を得るために、新たに（古い5日まで）酵母コロニーを増殖させ（ステップ1.2.3）を使用すべきであるのに対し、eshly調製したコンピテント細胞（ステップ1.1.8）は、高効率の酵母形質転換のために重要です。 GAL4以外の転写因子および/または代替/追加のレポーター遺伝子に基づいたシステムは、利用可能であるため、ベイトおよびプレイプラスミドは、適切なY2H株と一致する必要があります。 いくつかの株は、HIS3レポーター遺伝子7,8のいずれかの構成的発現をクエンチするために、3-アミノ-1,2,4-トリアゾール、HIS3タンパク質の競合的阻害剤の存在下で培養すべきです。餌とターゲット融合タンパク質の発現は、17を免疫ブロッティングによって確認する必要があります。場合餌に/餌の融合タンパク質は、酵母に対して毒性である、より低い許容タンパク質レベルはベイト/獲物発現が異なるプロモーターによって駆動される別のベクターにクローニングすることにより達成することができます。また、Tを確保するために不可欠です帽子餌/獲物の融合タンパク質は、自律的なレポーター遺伝子活性は表示されません。自律的なレポーター遺伝子の活性化は、2試験タンパク質のGAL4 DNA-BDとAD融合体を交換することにより、責任領域を除去するための構築物を修飾することによって救出することができます。それらが細胞内膜区画における融合タンパク質のミスフォールディングまたは誤局在を引き起こす可能性があるため、また、膜貫通ドメインは、より良好な餌/餌構築物から省略されています。実際、Y2H系の主な欠点は、餌とターゲットタンパク質は、偽陽性または偽陰性の相互作用6-9で、その結果、離れてそれらの生理学的細胞内位置から酵母核に局在し、潜在的に特定の翻訳後修飾を欠いているということです。 哺乳動物の異種発現系は、立体構造、翻訳後修飾および細胞内局在性の観点から、哺乳動物の内在性膜タンパク質の研究に適しています。最も広く使用される細胞のトランスフェクション法の一つは、主に最小限の設備および試薬11,15を必要とするリン酸カルシウム沈殿です。別の方法、すなわちエレクトロポレーション、リポソーム、カチオン性脂質およびポリマーは、使用される細胞株および構築物に依存して、より高いトランスフェクション効率をもたらすことができます。一般的に、トランスフェクション効率に影響を与える主な要因は、プラスミドDNAの質および細胞の健康/生存率です。最高純度の（260nmの/ 280nmの吸光度比〜1.8）と活発に分裂する細胞のプラスミドDNAを使用した場合に最良の結果が達成されます。外来DNAを取る能力が媒体11に曝露された細胞の表面領域に関連しているので、70％コンフルエンス（ステップ2.1.2） -細胞は、したがって、これ以上60以下でトランスフェクトされるべきです。さらに、トランスフェクション（ステップ2.1.3）中の培養培地中の抗生物質の含有が増加した細胞死の15のために推奨されません。 Fまたは特に、リン酸カルシウム沈殿、入念な準備及びpH調整（7.05まで正確に）2×HBS溶液を（ステップ2.1.1）、そして激しく混合（ステップ2.1.5）によりプラスミドDNA /カルシウム/リン酸複合体の適切な形成は、高効率トランスフェクションのための重要なステップ。一般的に、24内の一過性トランスフェクションピークによってタンパク質の発現 - 72時間。 細胞を回収したら、その後の手順は、プロテアーゼ活性を最小化するために4℃で実施しなければならない、およびプロテアーゼ阻害剤の添加が推奨されます。染色体DNAは、溶液粘度が増加し、非特異的結合を高めることができるので、細胞の均質化は、核を除去するための遠心分離工程が続くべきです。従って、等浸透圧緩衝液中で機械的手段により均質化は、通常、（0.3 M）のスクロースまたは（150 mM）のNaCl中で、好ましいです。一般に、スクロースベースの緩衝液は、タンパク質安定性を増強し、潜在的な非天然タンパク質凝集を減少させることが知られているが、Pのためにタンパク質表面上の基準の水和は、静電タンパク質間相互作用が好まれています。逆に、塩系緩衝剤は、より疎水性に基づく相互作用28に向かってバイアスを有する、タンパク質表面上の荷電したアミノ酸側鎖基の正味の電荷に影響を与えます。 共IPは、特に天然の組織からのタンパク質 - タンパク質相互作用を評価するための最も一般的に用いられる生化学アッセイです。その主な欠点は、IPおよびイムノ10,16,18で使用するために検証され、高度に特異的な抗体のための必要条件です。従って、組換えタンパク質は、多くの場合、 例えば 、ペプチドエピトープでタグ付けされている。、インフルエンザ赤血球凝集素（YPYDVPDYA）またはヒトCMYC（EQKLISEEDL）、高親和性特異的な抗体が市販されています。必要であれば、免疫沈降抗体は、化学的共沈PRを明瞭に免疫ブロッティング段階でその溶出および検出を回避するために、プロテインA樹脂に結合させることができます16 otein;これを達成するために、我々が正常に化学架橋剤3,3&#39;-ジチオビス（sulfosuccinimidylpropionate）24を使用しています。適切な界面活性剤は、IP緩衝液中に含まれ、均質化細胞の不溶性物質は、非特異的結合（ステップ3.1.3）を最小化するために遠心分離によって除去されることが不可欠です。洗剤の選択と集中が重要な考慮事項です：強力な洗剤および/またはより高い濃度は、実質的に非特定の結合を減少させるだけでなく、X廃止することがあります。より低濃度またはより穏やかな洗剤は弱い相互作用が観察されることを可能にする一方で、Yのタンパク質相互作用をするがよいです過剰な非特異的結合をもたらします。中間強度の界面活性剤は、 例えば 、好ましい、トリトンX-100を0.5に- 1％の濃度です。さらに、非特異的結合を減少させるために、中性タンパク質（100μg/ mlの、例えば、ウシ血清アルブミン）をIP緩衝液中に含めることができ、および/ ​​または細胞溶解物は、事前cleareすることができ単独のプロテインA樹脂とのインキュベーションの前でD。洗浄回数はX用に最適化されるべきである：Yのペアは、試験された、一般的にIPバッファ（ステップ3.1.9）で3 10分間の洗浄。いずれの場合も、免疫沈降抗体として、非免疫IgGと共IPサンプルは常に陰性対照（ステップ3.1.6）を提供するために並列に処理されるべきです。 化学的架橋の主な利点は、それがタンパク質のホモオリゴマーの化学量論組成に知らせることです。それは特殊な装置を必要とせず、それが相互作用するタンパク質19,20の間に熱的および化学的に安定な架橋を生成するので、グルタルアルデヒドは、一般的に使用される架橋剤です。これらは、化学反応を停止しますので、遊離アミノ基を有する化合物は、アッセイバッファ（ステップ3.2.1）から除外されるべきです。グルタルアルデヒド濃度と反応時間（ステップ3.2.4）は、関心のオリゴマータンパク質複合体のために最適化されるべきです。この技術の主な欠点、especi全細胞調製物に対して行わ味方場合、生物学的意義を欠く人工タンパク質凝集体を得ることができ、化学反応の非特異性です。 代替インビボで （ 例えば 、蛍光共鳴エネルギー転移、二分子蛍光又はルミネセンス相補性）およびインビトロ技術（ 例えば 、サイズ排除クロマトグラフィー、分析的超遠心分離、等温滴定熱量測定）タンパク質の自己会合及び評価の特徴付けのために利用可能ですオリゴマーの化学量論29,30の。それぞれの方法は、独自の長所と短所があり、それは、タンパク質精製/安定性及び装置/試薬の利用可能性に応じて、特定のタンパク質の研究のために、より適切であり得ます。ここで詳細に説明した3つの相補的な方法、すなわちY2H、共IP及び架橋は、RyR2のホモoligomeための説得力のある証拠を提供するために組み合わせて使用​​されています分離および生体細胞内のrを形成。

骨格筋および心筋の収縮はのRyRにより媒介筋小胞体のCa 2+放出によって誘発されます。 4つの同一のサブユニットから成る機能チャネルと3の哺乳動物のRyRアイソフォームがあります。それぞれのRyRサブユニットは、大きな細胞質調節N末端 ​​部分及び高コンダクタンスの Ca 2+の細孔を形成する膜貫通ドメインを含む小さなC末端部分から成ります。異常内およびサブユニット間相互作用は、のRyRチャネルの機能障害の根底にある神経筋や心臓障害1になります。 RyR構造に関与する特定のドメインの同定および特徴：機能の関係はのRyRの病態生理の理解のために、したがって重要です。 伝統的な生化学的タンパク質 - タンパク質相互作用の技術は、多くの場合、細菌中で産生され精製されたタンパク質の実質的な量を、必要とします。これはのRyR、非常に大きな膜pの場合には現実的ではありませんその組換えフラグメントが細菌発現および精製が容易に受け入れられないのに対し、〜5000個のアミノ酸からなるrotein。したがって、真核生物宿主細胞を含む代替的な発現系は、哺乳動物の内在性膜タンパク質のために必要とされます。我々は以前、まとめN末端 ​​の四三の哺乳動物のRyRが2,3アイソフォーム間で保存されている構造的特徴であることを実証するためにY2H、共同IPおよび架橋アッセイを採用しています。重要なことは、我々は催不整脈性心疾患に関連した単一点変異は、N末端 ​​の自己会合および機能不全のRyRチャネル4の結果を破壊することを見出しました。我々はまたのRyR細胞質のC末端尾部5と同様に、相同細胞内Ca 2+放出チャネル、イノシトール1,4,5-トリスリン酸受容体2のN末端 ​​のオリゴマー化の研究にこれらの技術を適用しています。 Y2Hアッセイでは、interacti二つのタンパク質（XとY）の間に機能的な転写因子（GAL4）およびレポーター遺伝子6-9の続く活性化を再構成することによって測定されます。 DNA結合ドメイン（DNA-BD）/タンパク質Xの融合（ベイト）と活性化ドメイン（AD）/タンパク質Y 2つの異なるクローニングベクターは、GAL4の2つの物理的に分離、独立したドメインを有する2つの試験タンパク質の融合体を生成するために使用されます融合（ターゲット）。 Y2Hタンパク質がGAL4 DNA-BDと同じタンパク質のAD融合物を生成することによって、それ自体と相互作用するかどうかをテストするために使用することができます。遺伝的に改変されたY2H株はGAL4とGAL80欠損（GAL80タンパク質がGAL4のリプレッサーである）、ならびにTRP1およびLEU2が欠損（それぞれ、ベイトおよびプレイプラスミドのための栄養選択を提供するために）です。酵母核に、組換えDNA-BDとADペプチドは唯一の彼らの融合 &#39;Xを通じてハイブリッドGAL4転写因子を生成するために物理的に近接させられる：Y int型eraction。このアプローチは、レポーター遺伝子（β-ガラクトシダーゼ（β-Gal）のためのLacZ符号化）と発色性（ヒスチジン生合成に必要な酵素のHIS3エンコーディング ）原栄養の並列転写活性化を介してタンパク質-タンパク質相互作用を検出するための迅速な遺伝子スクリーニングを可能にします。 Y2Hの主な利点は、それが弱いまたは一過性のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するin vivoアッセイであることです。また、検出は、餌と対象タンパク質の精製または特定の抗体の生成を必要とせず、簡単な（メディアヒスチジンを欠く中で）増殖選択の使用または比色の（β-Galの）アッセイを伴います。また、Y2Hはまた、ライブラリーのタンパク質のcDNAへの直接アクセスを与えるベイトタンパク質の新規の結合パートナー、ランダム未知のクローン（GAL4 ADに融合したcDNAライブラリークローン）のコレクションをスクリーニングすることができます。 Y2H観測を拡張するために、INDEPENDENT生化学的技術を使用することができます。共IP及びイムノブロッティングと組み合わせた架橋アッセイは、複雑なサンプル混合物中のタンパク質の関連を検出するために用いられる方法、 例えば 、全細胞溶解物10です。それらの主な利点は、組換えタンパク質の使用を必要とする他の方法とは異なり、天然の組織からのタンパク質 - タンパク質相互作用について報告することです。組換えタンパク質は、典型的には、彼らが正しいコンホメーションおよび翻訳後修飾を有する可能性がある哺乳動物細胞株、ならびに細胞内局在性に発現し、また使用することができます。共IPと架橋がインビトロアッセイは、均質化細胞を利用しているので、2つのタンパク質パートナーは、無傷の細胞11に共局在しているかどうかを確認する必要があります。我々は日常的に一過性リン酸カルシウム沈殿法2を用いて、哺乳動物の内在性膜および細胞質タンパク質を発現する哺乳動物HEK293細胞のトランスフェクションを使用し-4,12-14は、詳細にここで説明しました。これは、効率的に細胞内にプラスミドDNAを送達するための安価な方法ですが、それは特定の使用の細胞株および細胞コンフルエンスと同様に、プラスミドDNA 11,15の純度に依存しています。 共IPアッセイは、推定上の相互作用パートナー10,16の同時精製を可能にする非変性条件下での細胞溶解物からの関心の天然または組換えタンパク質の単離を伴います。タンパク質は、2つの異なるエピトープを有する2つの異なる融合物を生成することによって、それ自体と相互作用するかどうかをテストするために使用することができる2つの独立した抗体の使用、タンパク質Xの単離のための免疫沈降用抗体、およびタンパク質パートナーYの検出のためのイムノブロッティング抗体を必要としますタグ（ 例えば 、HAおよびCMYC）。免疫沈降抗体は、プロテインAには、そのFc領域を介して結合した（プロテインG、抗体が発生した動物種に応じてか）されていますアガロース（またはセファロース）樹脂に結合しています。タンパク質Xは、抗体により沈殿させる：タンパク質 - 樹脂細胞溶解物、均質化された細胞の、すなわち界面活性剤可溶性分画とのインキュベーション後。タンパク質の免疫複合体は、SDSを含む緩衝液で溶出させ、続いてタンパク質Y 17の存在を検出するために抗体を用いるSDS-PAGEおよびイムノブロッティングにより分析します。共IPは、過剰非特異的結合を回避するために、界面活性剤、水溶性タンパク質を用いて実施されるべきです。 Y対10,16,18：洗剤とその濃度の選択だけでなく、洗浄回数は、各X用に最適化されるべきです。 架橋は、オリゴマータンパク質複合体の化学量論を決定するために使用されます。これは、隣接する相互作用プロトマーの間に共有結合を生成する化学反応に基づいており、従って、それはSDS-PAGEの分離の際、タンパク質のオリゴマー状態の保存を可能にします。多数の架橋レアージュがありますタンパク質、典型的には、第一級アミン、カルボン酸またはチオール基に異なる反応基をターゲットに様々な長さと化学のNTS。ここでは、（OHC（CH 2）3 CHO）、リジン残基19,20中に存在する遊離アミノ基と反応するいずれかの端部に2つのアルデヒド基を有するホモ二官能性架橋剤がグルタルアルデヒドの使用を記載しています。架橋は、付加物形成をもたらす濃度 - または時間依存的な様式で行われます。グルタルアルデヒドの反応は、ヒドラジン（H 2 NNH 2）で停止し、タンパク質試料をSDS-PAGEによって分析し、それらのオリゴマー化状態を評価するために17を免疫ブロッティングしています。私たちは、架橋がオリゴマー化を誘導するが、単に既存のタンパク質複合体との間で安定したブリッジを作成していないことに注意してください。架橋実験を実施する重要な考慮事項は、架橋剤の選択は、その濃度と反応時間19,20を含みます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1190">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:387px;">1.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; PART 1 yeast two-hybrid</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:472px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate incubator</td>
			<td>Hereaus</td>
			<td>B6120</td>
			<td>Used at 30&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital shaker incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>INNOVA 4300</td>
			<td>Used at 30&#176;C with shaking at 230-250 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Lambda Bio+</td>
			<td>To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>K1604-1</td>
			<td>Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2&#160; and yeast strain Y190&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0626</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dropout supplement lacking leucine and tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0750</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2001</td>
			<td>To prepare minimal SD growh medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Herring testes carrier DNA&#160;</td>
			<td>Takara Clontech</td>
			<td>630440</td>
			<td>For yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter paper Grade 5&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA1005070</td>
			<td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4252</td>
			<td>for use in colony-lift filter paper b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ONPG (o-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1127</td>
			<td>for use in liquid b-Gal assay</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;">PART 2. Protein expression in a mammalian cell line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;&#160;CRL-1573&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified incubator (5% CO2, 37 &#176;C)</td>
			<td>SANYO</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td>To culture mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s medium)</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td>41966</td>
			<td>To prepare growth medium for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen (ThermoFisher)</td>
			<td>10500</td>
			<td>To prepare growth medium for mammalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>To homogenise cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Needle 23G (0.6 x 30mm)</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300700</td>
			<td>To homogenise cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor cocktail (Complete)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873508001</td>
			<td>To prevent proteolysis</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">PART 3. In vitro biochemical methods&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:387px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU&#160;</td>
			<td>For polyacrylamide gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td>For electrophoretic transfer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Compact X-ray film processor</td>
			<td>Xograph</td>
			<td>X4</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882</td>
			<td>For use in chemical cross-linking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein-A sepharose beads&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5280-01&#160;</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-805</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-immune rabbit IgG</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-2027</td>
			<td>For use in co-IP assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-40</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-101P</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyperfilm ECL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28906836</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>Pierce (ThermoFisher)</td>
			<td>32106</td>
			<td>For use in immunoblotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic and biochemical approaches for in vivo and in vitro assessment of protein oligomerization: the ryanodine receptor case study

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by &#946;-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Y2Hシステムでは、餌は：餌の相互作用は、最初に（トリプトファン、ロイシンなど）、ヒスチジンを欠く培地中で酵母の増殖の選択によって試験され、その後、β-GAL酵素活性アッセイ（ 図1）によって評価しました。獲物タンパク質相互作用：中ヒスチジンを欠く中で培養した酵母は、餌の強さに依存遅い成長率を持っています。 β-Galのアッセイは、（のみトリプトファンおよびロイシンを欠く培地で培養）酵母で行わいずれか後者の収量定量結果で、（寒天プレート）固体支持体上または液体培地で成長しています。我々は成功したRyR2内のドメイン-ドメイン相互作用だけでなく、新規タンパク質パートナー2-4,12,21,22を識別するためにY2Hを使用しています。例えば、我々は、N末端断片との相互作用のためのRyR2ペプチド配列の全長にわたる構築重複する一連のスクリーニング（AD4L：のRyR2残基1 - 906のGAL4 ADと融合）3コロニーリフトフィルター紙β-GalのアッセイはBT4Lのための鮮やかな青色の酵母コロニー産：AD4Lペア（ 図2A）を 、AD4L自体と相互作用することを示す、すなわちBT4Lは（RyR2の残基1構築- GAL4と融合906 DNA-BD）。淡い青色のコロニーがBT8のために検出されました：極端なC末端ドメイン（BT8）との二弱い関連を示唆AD4Lペア、酵母、他の構築物で同時形質転換は、餌のための白、したがって、負のままであった：獲物タンパク質相互作用。液体β-Galのアッセイ（ 図2B）で得られた定量的結果は、堅牢なBT4Lを示した：AD4L相互作用同等の強度でp53タンパク質（PVA3）およびSV40ラージT抗原（PTD1）間の既知の関連を、BT8に対し：AD4L相互作用を（&lt;10％を対照と比較して）かなり弱かったです。 私たちは日常的に共同-IP実験（ 図3）は、fを行いますY2H所見2-4,12-14,21-24を強化するための独立した生化学的ア ​​ッセイとして、哺乳動物細胞株（HEK293）での一過性発現をollowing。 RyR2のN末端の自己相互作用を確認するために、RyR2の残基1をコードする二つの別々のプラスミド - CMYCまたはHAペプチドエピトープ（それぞれBT4L及びAD4L）のいずれかでタグ付け906は、リン酸カルシウム沈殿法を用いてHEK293細胞に同時トランスフェクトしました。 3。均質化した細胞の後の核画分を洗剤CHAPSで可溶化し、そして不溶性物質を、細胞溶解物を生成するために遠心分離によって除去しました。還元剤ジチオスレイトールで処理された細胞溶解物を、その後、HAタグ付きAD4Lを免疫沈降抗体HAおよびプロテインAセファロースビーズとインキュベートしました。 SDSを含む緩衝液で溶出共IP試料は、R、二つの別々のSDS-PAGEゲル（1/10と9/10 番目の分割）にロードおよびAB HAおよびAB CMYCを用いたイムノブロッティングにより分析しましたespectively。アブHAによるAD4Lの成功直接IP（〜100 kDa）がなく、非免疫ウサギIgG（ 図4A）を使用して、負の制御では、イムノブロット法により確認しました。重要なことは、CMYCタグ付きBT4L（〜100 kDa）がなく、免疫沈降AD4L（ 図4B）の不在下での負の制御では、唯一の抗体HA IPで回収しました。 Y2Hと共同IPアッセイは、RyR2のN末端の自己相互作用のための一貫性のある証拠を提供し、彼らはそれが唯一の二量体以上の複合体を形成する、すなわちかどうか、N末端ドメインのオリゴマー化状態に通知しませんでした。複合体が解離することに留意すべきであるとのみからなるサブユニットは、タンパク質 - タンパク質相互作用を廃止するためにSDS-のSDS-PAGE及び熱誘導タンパク質の変性によって検出されます。これを克服するために、我々は、化学的安定既存proteiをconjoins架橋（ 図5）を使用しその分子量をSDS-PAGEのサイズ分離2-5で調べることができ、n個のオリゴマー、。例えば、還元剤ジチオスレイトールで処理CMYC-BT4Lを発現するHEK293細胞ホモジネートを、グルタルアルデヒドと反応し、抗体CMYC（ 図6）を使用して、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングによって分析しました。単量体（〜100 kDaの）に加えて、〜400キロダルトンの高分子量タンパク質バンドを、RyR2のN末端 ​​の四量体の形成3を示し、時間依存的に検出されました。特に、四量体は、最小限の二量体と観察トリマーバンドで、優勢なオリゴマー種でした。 15％勾配SDS-PAGEゲル3 -その見かけの分子量を決定するために、BT4Lオリゴマーは4を介して分離しました。私たちは30の範囲でタンパク質スタンダードを用いた分子質量/ゲル遅延標準曲線生産 - 460 kDaのを、私たちは358 kDaで15であることがオリゴマーを算出した（n = 4）。この見かけの分子量は、内​​に配置さBT4L四量体と一致していますネイティブのRyR2チャネル内の4つのサブユニットの配列から予想されるように、むしろ直線状に比べて円形のファッションを閉じました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" /> 図1. Y2Hフローチャート。酵母、同時形質転換餌とターゲットプラスミドで、培地ヒスチジンを欠く中で成長するために選択および/ ​​またはβ-Galの酵素活性についてアッセイされる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" /> 図2. Y2Hは、RyR2のN末端 ​​ドメインの自己相互作用を示唆している。ためにY2H系で試験したヒトのRyR2重複タンパク質断片の（餌）シリーズを描いた（A）の回路図<html> RyR2のN末端AD4L（獲物）との相互作用が構築します。コロニーリフトフィルター紙β-Galのアッセイによって得られた定性的結果は、「+」倍数かで示されている&quot; - &quot;負の相互作用のための陽性対照に対して標準化（B）定量的液体β-Galのアッセイ（PVA3は、GAL4 DNA-BDをコードします。 p53タンパク質との融合; PTD1は、SV40ラージT抗原とのGAL4 AD融合をコードします）。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" /> 図3 のCo-IPフローチャート。哺乳動物細胞、プラスミドXとYとの同時トランスフェクションは、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングに続いて、共IPアッセイにおいて使用される細胞溶解物を生成するために均質化し、界面活性剤で可溶化されています。F = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg&quot;ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" /> 図4. 共同-IPは、哺乳動物細胞内のRyR2 N末端 ​​ドメインの自己相互作用を示します。HEK293細胞は、CMYCタグ付き（BT4L）の一過性同時発現およびHAタグ（AD4L）のRyR2 N末端 ​​ドメインの同時トランスフェクトしました（残基1から906）。陰性対照として、共同IPアッセイは非免疫ウサギIgGを用いて行ったのに対しAD4Lは、CHAPS可溶化及びジチオスレイトール処理したHEK293の溶解物からのAb HAを用いて免疫沈降させました。免疫沈降したタンパク質を、5分間85℃に加熱し、そして1/10またはIP試料の9/10 番目を装填別個の6％SDS-PAGEゲルを介して3時間20mAで分離しました。 polyvinyへ2時間80 Vで、以下のタンパク質の転送抗体HA（A）または抗体CMYC西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG、続いて、それぞれ、（B）、（1：10,000希釈）および増強化学発光検出：lideneジフルオリド膜は、免疫ブロット分析は、（千希釈1）を用いて行きました（1分間露光）。細胞溶解物のアリコートを、IP試料で処理体積の1/50には 、また、分子質量標準を提供するために含めました。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" /> プラスミドXをトランスフェクトし、図5 の架橋フローチャート。哺乳動物細胞は、SDS-PA続いて、均質化および架橋アッセイでグルタルアルデヒドとの反応に供されますGEおよびイムノ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" /> 図6. 架橋は、RyR2のN末端 ​​ドメイン四量体形成を示す HEK293細胞は、CMYCタグ付き（BT4L）のRyR2 N末端 ​​ドメイン（残基1から906）の一過性発現のためにトランスフェクトしました。還元剤ジチオスレイトールで処理した細胞ホモジネートを、示された時間ポイントのグルタルアルデヒドを用いてインキュベートしました。サンプルを5分間85℃に加熱し、3時間20mAでSDS-PAGE（6％ゲル）により分離しました。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG（1、続いて：（千希釈1）抗体CMYCをポリビニリデンジフルオリド膜上に2時間、80 Vでのタンパク質の転写後、免疫ブロット分析を用いて行きました。10,000希釈）および強化化学発光検出（1分間露光）。モノマー（M：〜100キロダルトン）と四量体（T）の形態は、矢印で示されています。 3から変更された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

11.3K ビュー.  Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences. Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

初期のニワトリ胚をex vivo（新文化）の文化のための方法

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

鶏胚における神経誘導のためのアッセイ

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular metabolism. Many methods to detect glycogen already exist but only a few are quantitative. We describe here a method using the Abcam Glycogen assay kit, which is based on specific degradation of glycogen to glucose by glucoamylase. Glucose is then specifically oxidized to a product that reacts with the OxiRed probe to produce fluorescence. Titration is accurate, sensitive and can be achieved on cell extracts or tissue sections. However, in contrast to other techniques, it does not give information about the distribution of glycogen in the cell. As an example of this technique, we describe here the titration of glycogen in two cell lines, Chinese hamster lung fibroblast CCL39 and human colon carcinoma LS174, incubated in normoxia (21% O2) versus hypoxia (1% O2). We hypothesized that hypoxia is a signal that prepares cells to synthesize and store glycogen in order to survive1.

Biochemical Titration of Glycogen In vitro

We describe here an accurate, reproducible and convenient biochemical method for titration of glycogen in vitro. This technique uses the Abcam Glycogen assay kit and is based on successive hydrolysis of glycogen to glucose and glucose titration by fluorescence.

グリコーゲンの生化学的滴定<em&gt;インビトロ</em

Glycogen is the main energetic polymer of glucose in vertebrate animals and plays a crucial role in whole body metabolism as well as in cellular ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

タンパク質アルギニンメチル化を研究するためのin vitroでメチル化アッセイで

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...