The authors would like to acknowledge the Painless Research Foundation for support of the work. This work was also supported by the NIH grants R01 NS080921-01 and R21 NS079897-01A1.

Ethik-Statement: Alle Verfahren für die Erhaltung und Nutzung der Versuchstiere entsprachen den Vorschriften der UCSF Ausschüsse für Tierforschung und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der NIH Regelungen für Tier Verwendung und Pflege (Veröffentlichung 85 durchgeführt - 23, 1996 überarbeitet ). Die UCSF Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt die in dieser Studie verwendeten Protokolle. 1. Herstellung von Instrumenten, Lösungen und Geschirr <ol><li> Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF). <ol><li> Bereiten 500 ml 10fach niedriger Kationenlösung und 500 ml 10x Bicarbonatlösung (siehe Tabelle 1 und 2 für die Herstellung der Lösung). Lagerung bei 4 ° C und Verwendung innerhalb eines Monats. </li><li> Bereiten 600 ml frischem aCSF mit 60 ml 10fach niedriger Kationenlösung mit 60 ml Bicarbonat-Lösung vermischt und fügen Sie dann 480 ml deionisiertes Wasser auf ein Endvolumen von 600 ml zu erreichen. Blase die aCSF mit Carbogen(5% O 2 und 95% CO 2) für mindestens 10 min vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Ziehen Sie Patch-Pipette aus Kapillar-Glas. <ol><li> Legen Sie dünnwandige Kapillare Glas in eine Pipette Abzieher, um die Aufnahme Pipetten vorzubereiten. Hinweis: In unserem Labor werden die folgenden Einstellparameter des Puller verwendet werden, um die ideale Pipettenform zu erreichen: Wärme (510), Geschwindigkeit (32). Die ideale Form für Pipetten intakte DRG Aufnahme sollte eine graduelle schlanken Verjüngung mit einem geringen Konuswinkel haben, und dies kann am besten durch Versuch und Irrtum erreicht werden. </li><li> Stellen Sie sicher , dass der Widerstand der Pipette 3-5 MOhm ist , wenn sie mit internen Lösungen gefüllt (siehe Tabelle 3 für Lösung Vorbereitung). Bitte beachten Sie Axon Leitfaden für die detaillierte Verfahren zur Messung von 18 Pipette Widerstand. </li></ol></li><li> 1 mg Kollagenase zu 400 ul aCSF, um eine Endkonzentration von 13 Einheiten / ml zu ergeben. Dann füllen Sie jede Glaspipette mit etwa 20 ul Kollagenase-Lösung. Geschäftdie gefüllten Pipetten in einem C - Gefrierschrank -20 o und innerhalb von drei Wochen. </li><li> Bereiten 200 ml kaltem aCSF (etwa 4 o C). Um die aCSF kühlen sie schnell platzieren in einen Becher, versiegeln Sie mit Plastikverpackung und in einem -20 ° C Gefrierschrank für etwa 20 Minuten , bis es zu gefrieren beginnt. Das Becherglas in einem Eisbad und Blase mit Carbogen für 10 min. Blase die restlichen 400 ml aCSF mit Carbogen bei RT. </li><li> Während die aCSF abkühlt, schneiden Sie das Ende einer Kunststoff-Einweg-Transferpipette um die Öffnung zu einem Durchmesser von 5 mm zu vergrößern (das verwendet wird, um die DRG zu übertragen). Sammeln Sie die folgende chirurgische Instrumente: Skalpell (# 15), Mayo geraden und gebogenen Schere, fein 2 mm Spitze rongeur, Adson (Zahn) Zange, Iris Schere, Feder Schere und zwei feinen Pinzette. Gießen Sie das mit Sauerstoff angereicherte Kälte aCSF in 3 Petrischalen aus Glas (Außendurchmesser: 10 cm). </li></ol> 2. DRG Dissection <ol><li> Anesthetize eine Ratte (200-220 g) mit Natrium pentobarbital (100 mg / kg, ip) und bestätigen, dass das Niveau der Anästhesie durch Pedal Prüfung Reflex und Augen Lidschlussreflexes ausreichend ist. </li><li> Nach Überprüfung, dass die Ratte betäubt, rasieren den Lendenbereich und einschneiden die Haut und das Unterhautgewebe entlang der Mittellinie. Lösen Sie die paraspinale Muskeln von den Dornfortsätzen an der L1-S2-Ebene ein feines Periostelevatorium verwenden. </li><li> Verwenden einer gebogenen Schere die Dornfortsätze von L1 bis S2 zu schneiden. Verwenden Sie gerade Mayo Schere Querschnitte in der exponierten Wirbelsäule bei etwa L1 und S1 und entfernen Sie dieses Segment der Wirbelsäule en bloc zu machen und es schnell untertauchen in kaltes aCSF (hergestellt in Schritt 1.5) für 2-3 min. Nach dem Entfernen der lumbalen DRGs wird Euthanasie durch bilaterale Thorakotomie durchgeführt, während die Ratte noch im tiefen Pentobarbitalbetäubung ist. </li><li> Spülen Sie weg das Blut aus der entfernten Wirbelsäule und an Gewebe und übertragen in eine Petrischale mit kaltem aCSF. Use eine feine rongeur die Schichten zu entfernen. Schneiden Sie die Dura mater entlang der Mittellinie mit Mikroschere das Rückenmark zu belichten. Heben Sie vorsichtig das Rückenmark, und schneiden Sie die Nervenwurzeln an ihrem Eintrittspunkt im Rückenmark Iris Schere, entfernen Sie dann das Rückenmark. </li><li> Übertragen Sie die verbleibende Wirbel mit DRGs auf die zweite Petrischale mit kaltem aCSF gefüllt. Identifizieren Sie die L4 und L5 DRGs auf der Grundlage ihrer relativen Position zu Querfortsätze und Ischiasnerv. Hinweis: Um den Ischiasnerv Aufrechterhaltung intakt helfen L4 und L5 DRG (der Ischiasnerv aus dem L4-6 Spinalnerven stammt) zu identifizieren. </li><li> Verwenden Dumont Pinzetten und Scheren Noyes die DRGs von den umgebenden Bindegewebe zu befreien. Halten Sie die Nervenwurzel und Spinalnerven zu den DRGs angebracht. </li><li> Verwenden Sie die Transferpipette die DRGs in die dritte Petrischale für die weitere Zergliederung zu bewegen. </li><li> Unter dem Präpariermikroskop vorsichtig entfernen, so viel wie möglich von der epineurium umgebenden the DRG. <ol><li> Verwenden Sie die Noyes Feder Schere um eine Öffnung zu schneiden, wo die dorsalen und ventralen Wurzeln der DRG und trennen Sie die ventralen Wurzel aus der DRG verbinden. Verwenden Sie Dumont # 5 Pinzette mit stumpfen Spitzen der epineurium zu halten, und verwenden Sie einen anderen feinen Pinzette die DRG vom epineurium zu rollen. </li><li> Weiter so viel wie möglich von epineurium an DRGs mit den feinen Pinzette zu entfernen. Hinweis: Ein gut seziert DRG ist wichtig, eine gute Verdauung im nächsten Schritt zu erhalten. </li></ol></li></ol> 3. DRG Verdauung <ol><li> Übertragen Sie die DRG auf die Aufzeichnungskammer. Achten Sie auf die Seite der DRG, wo die Nervenwurzeln Gesichter nach unten stammen. Anmerkung: Auf diese Weise werden die meisten Neuronen zugänglich sind. </li><li> Verwenden Sie einen Anker der DRG zu stabilisieren. Perfuse DRG mit oxygeniertem aCSF mit einer Rate von 0,5 ml / min durch Kunststoffrohre mit einer peristaltischen Pumpe verbunden, die auf das Aufzeichnungs rig nächsten auf einem Tisch platziert wird. </li><li> Warten für 30 min die Zellen zu erlauben, sich zu erholen. Bewerten Sie die Qualität der DRG unter Infrarot-Differential-Schnittstelle Kontrast (IR-DIC) Optik bei 40facher Objektivvergrößerung durch eine CCD-Kamera. Hinweis: Gut DRGs in der Regel viele runde enthält, auch gegenüber, umgeben Neuronen, die durch Satelliten Gliazellen auf seiner Oberfläche. </li><li> Digest einen kleinen Bereich der Oberfläche des DRG. Anmerkung: Die Glas Patch-Pipetten angeordnet sind, in Pipettenhalter, die kleine Kupplungen sind, die Schläuche erlauben, mit einer luftdichten Dichtung an der Glaspipette befestigt werden kann. <ol><li> verbinden Individuell zwei 1 ml Spritzen mit den Pipettenhalter durch zwei Stücke von kleinem Durchmesser Gummischlauch. Legen Sie eine Glaspipette mit Kollagenase in einer der Pipettenhalter und eine leere Glaspipette in die andere gefüllt. </li><li> Verwenden Sie den Mikromanipulator die Pipetten knapp über dem DRG zu positionieren. Dann unter dem Mikroskop Vergrößerung, kollidieren die Spitzen von zwei Pipetten gegeneinander sanft die Öffnungen von Pipettenspitzen, um zu vergrößern (idealerweise einen Durchmesser von 5-10 &amp; mgr; m). </li><li> Bewegen Sie den mit Enzym gefüllten Pipette nahe an der Oberfläche von DRG und kurz positiven Druck auf die Pipette enthält Kollagenase durch das Rohr gelten den Halter und die Spritze verbindet durch den Kolben etwa 0,5 ml zu verschieben. Hinweis: Unter dem Druck wird der Fluss des Enzyms aus der Pipette leicht den Raum zwischen den DRG-Neuronen vergrößern, die als Zeichen für die Enzym-Anwendung dienen kann. </li><li> Nach 10 bis 15 min, wenn Trümmer des verbleibenden Epineurium beobachtet wird, gelten sanfte Unterdruck auf die leere Pipetten den Schmutz abzusaugen. Hinweis: Auf diese Weise werden die Neuronen und die umliegenden Satelliten Gliazellen wird für die Patch-Aufnahme deutlich ausgesetzt und bereit sein. </li><li> Entsorgen Sie die zwei Pipetten in den Behälter für spitze Gegenstände. </li></ol></li></ol> 4. Patch-Clamp-Aufnahmen <ol><li> Platzieren Sie die Elektrodenlösung (siehe Tabelle 3) auf Eis Abbau zu verhindern. Füllen Sie das Glas Patch-Pipette mitgefiltert intrazelluläre Lösung (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 &amp; mgr; m) und legen Sie die Pipette in der headsPipettenHalter. Anwenden eines sanften Überdruck auf der Pipette durch eine 5 ml-Spritze durch den Kolben etwa 1 ml Verlagern vor der Pipette in Badlösung abgesenkt wird. Hinweis: Dies verhindert, dass die Pipette blockiert wird. </li><li> Wählen Sie &quot;V-Klemme&quot; Modus durch den Modus-Regler auf die Endstufe einschalten, dann öffnen &quot;Membrantest&quot; Schnittstelle in der Software. Bewegen Sie die Pipette der Nähe des Ziel Neuron unter dem Mikroskop Inspektion. Hinweis: In der intakten DRG Vorbereitung, eine dünne Schicht aus Satelliten Gliazellen jedes Neuron kapselt. </li><li> Mit positivem Druck aus der Pipette den Satelliten Gliazellen Schicht, bis eine plötzliche Erweiterung des Raumes zwischen dem Neuron und der umgebenden Schicht von Satelliten Gliazellen zu durchqueren beobachtet. Halten Sie die Pipette auf das Neuron, bis ein &quot;Grübchen&quot; Bewegen auf dem Neuron beobachtet wird. Hinweis: Im Vergleich mitAufnahmen von dissoziierten Neuronen, muss der positive Druck ein wenig größer zu sein, die den Satelliten glial Zellschicht zu durchdringen und erhöhen die Chancen für eine erfolgreiche patching helfen. </li><li> Reduzieren Sie den positiven Druck. Als nächstes wird eine Giga-Ohm-Dichtung mit sanften Sog erreichen. Hinweis: Bei diesem Verfahren wird die Erfolgsrate der Aufzeichnung mindestens 70% beträgt. </li><li> Erhalten whole-cell - Konfiguration wie zuvor 19 beschrieben. <ol><li> Kurz gesagt, dringen in die Neuron Zellmembran über einen kurzen, aber starken Sog. Alternativ können Sie die &quot;zappen&quot; Funktion des Verstärkers während Sog angewendet wird. </li><li> Sobald eine ganze Zelle Modus hergestellt wird, kompensieren Ganzzellkapazität und Serienwiderstand (Rs) durch den Verstärker die Kapazitäts- und Widerstandskompensation Drehknöpfe. Hinweis: Rs ist in der Regel 5-20 MOhm. </li><li> Verlassen wir die Zelle, wenn Rs ist zunächst größer als 30 MOhm; oder Rs um mehr als 20% während der Aufzeichnung. Ebenfallsmessen das Ruhemembranpotential; verlassen eine Zelle, wenn das Ruhemembranpotential mV mehr als -50 ist. </li></ol></li><li> Schließen Sie die &quot;Membrantest&quot; Fenster. Wählen Sie &quot;I-Klemme normalen&quot; Modus durch den Modus-Regler auf den Verstärker einschalten. </li><li> Klicken Sie auf &quot;offenes Protokoll&quot; in der Software auswählen und das Protokoll laden für rheobase messen. Klicken Sie auf &quot;Aufzeichnen&quot; Aufnahme zu starten. Messung der Eingangswiderstand und die neuronale Erregbarkeit Rheobase zu untersuchen, durch eine abgestufte Reihe von Einspritzen von Strömen in Schritten von 100 pA depolarisierende. <ol><li> Klicken Sie auf &quot;offenes Protokoll&quot; wieder und wählen Sie das Protokoll für die Membranschwelle zu messen. Ein 500 ms depolarisierenden Rampenstrom (2.000 pA / s) wird mit dem Neuron injiziert werden. </li><li> Verwenden Sie die Datenerfassung und Analyse - Software (zB Clampfit) die aufgezeichneten Spuren zu analysieren gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie die Software den Eingangswiderstand (Rin) auf der Grundlage der Steady-State-IV relat zu berechnenionship während der hyperpolarisierender Strömungen ausgeliefert. Bewegen Sie den Cursor den Wert für Rheobase und Membranschwelle zu messen. Hinweis: Die Amplitude des Stroms erforderlich, um den AP zu induzieren als Rheobase definiert, und die niedrigste Spannung zum Induzieren AP wird als Membranschwelle definiert. </li></ol></li><li> Notieren Sie die Ligand induzierte Ströme. <ol><li> Füllen Sie eine Pipette mit den spezifischen Agonisten. Hinweis: Im aktuellen Bericht verwendeten wir 100 uM Glutamat und 100 uM AITC die Ströme von Glutamat-Rezeptoren und TRPA1 Rezeptoren bzw. vermittelt zu induzieren. </li><li> Überprüfen Sie die Pipette, um sicherzustellen, gibt es im Inneren keine Luftblasen. Platzieren Sie die Pipette in die Pipettenhalter. Schließen Sie den Pipettenhalter mit einem Rohr zu einem Arzneimittel-Abgabesystem verbunden. </li><li> Verwenden Sie den Manipulator, um die Pipette innerhalb von 50 &amp; mgr; m des Neurons bewegen. Stellen Sie das Medikament-Abgabesystem Druck auf 1 psi und die Dauer bis 1 s. Schalten Sie den Aufnahmemodus Spannungsklemme und die Klemme bei -70 mV. gelten kurz den Druck über das Arzneimittelabgabesystem, um einen medikamenteninduzierten Strom aufzunehmen. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+pain.">Cellular and molecular mechanisms of pain.</a> Cell. 139, 267-284 (2009).</li><li>Caterina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capsaicin+receptor:+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway.">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li><li>Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GluN2B+N-methyl-D-aspartate+receptor+and+excitatory+amino+acid+transporter+3+are+upregulated+in+primary+sensory+neurons+after+7+days+of+morphine+administration+in+rats:+implication+for+opiate-induced+hyperalgesia.">GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia.</a> Pain. 157, 147-158 (2016).</li><li>Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+response+to+glutamate+in+small+diameter+dorsal+root+ganglion+neurons+after+sciatic+nerve+injury.">Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury.</a> PloS one. 9, 95491 (2014).</li><li>Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+inhibits+neurogenic+inflammation+by+blocking+the+effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).</li><li>Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+and+TNF-alpha+receptor+type+1+upregulation+in+glia+and+neurons+after+peripheral+nerve+injury:+studies+in+murine+DRG+and+spinal+cord.">TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord.</a> Spine. 29, 1082-1088 (2004).</li><li>Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+channels,+excitability+of+primary+sensory+neurons,+and+the+molecular+basis+of+pain.">Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain.</a> Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).</li><li>Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+excitability+of+sensory+neurons+in+rats+with+cutaneous+hyperalgesia+produced+by+chronic+compression+of+the+dorsal+root+ganglion.">Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion.</a> J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).</li><li>Dib-Hajj, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+sodium+channel+expression+in+DRG+neurons+in+the+chronic+constriction+injury+model+of+neuropathic+pain.">Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain.</a> Pain. 83, 591-600 (1999).</li><li>Cummins, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+persistent+tetrodotoxin-resistant+sodium+current+in+SNS-null+and+wild-type+small+primary+sensory+neurons.">A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons.</a> J Neurosci. 19, RC43 (1999).</li><li>Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+dorsal+root+ganglion+neurons+induces+hyperexcitability+that+is+maintained+by+increased+responsiveness+to+cAMP+and+cGMP.">Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP.</a> J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).</li><li>Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+phenotype+plasticity+in+cultured+dissociated+adult+rat+dorsal+root+ganglia:+an+immunocytochemical+study.">Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study.</a> J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells:+more+than+just+'rings+around+the+neuron'.">Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'.</a> Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).</li><li>Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+GABA(B)+receptors+potentiates+inward+rectifying+potassium+currents+in+satellite+glial+cells+from+rat+trigeminal+ganglia:+in+vivo+patch-clamp+analysis.">Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis.</a> Neuroscience. 288, 51-58 (2015).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+functional+properties+of+satellite+glial+cells+in+compressed+spinal+ganglia.">Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia.</a> Glia. 57, 1588-1599 (2009).</li><li>Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+compression+of+mouse+dorsal+root+ganglion+alters+voltage-gated+sodium+and+potassium+currents+in+medium-sized+dorsal+root+ganglion+neurons.">Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).</li><li>Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Na++and+K++currents+in+small+mouse+dorsal+root+ganglion+neurons+after+ganglion+compression.">Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression.</a> J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).</li><li>Sherman-Gold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Axon Guide. , (2008).</li><li>Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-clamp+and+current-clamp+recordings+from+mammalian+DRG+neurons.">Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons.</a> Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).</li><li>Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+recording+from+the+intact+dorsal+root+ganglion.">Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion.</a> J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).</li><li>Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+the+TTX-resistant+voltage-gated+sodium+channels+Nav1.8+(SNS)+and+Nav1.9+(SNS2)+in+primary+sensory+neurons.">Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons.</a> J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).</li><li>Funakoshi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+development+of+TRPV1-expressing+sensory+nerves+in+peripheral+organs.">Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs.</a> Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).</li><li>Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+patch+clamp+recording+and+calcium+imaging+of+neurons+in+the+intact+dorsal+root+ganglion+in+rats.">An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats.</a> J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).</li><li>Yagi, J., Sumino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+a+hyperpolarization-activated+current+by+clonidine+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons.">Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).</li><li>Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+and+functional+characterization+of+primary+somatic+neurons.">In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons.</a> J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).</li><li>Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+the+trigeminal+ganglion+as+a+determinant+of+orofacial+neuropathic+pain.">Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Wir berichten über eine Methode, um ganze DRGs für die Patch-Clamp-Studien vorzubereiten. Es gibt mehrere wichtige Elemente für eine ideale Probe vorbereitet. Erstens ist es wichtig, die DRGs mit dorsalen Wurzeln angebracht zu sezieren. Danach müssen die Epineurium sorgfältig entfernt werden, während eine Beschädigung der Neuronen zu vermeiden. Schließlich freizulegen, die Neuronen und deren umgebenden Satelliten Gliazellen, ist es notwendig, die verbleibende Bindegewebe zu verdauen. Intakte DRGs von erwachsenen...

Sensation ist von wesentlicher Bedeutung für einen Organismus für das Überleben und Wohlbefinden. Die Übertragung der Impulse ist abhängig von der sensorischen Bahnen an peripheren Enden der Axone von primären sensorischen Neuronen beginnen. Primären sensorischen Neuronen, mit Ausnahme des Nucleus mesencephalicus des Trigeminus, sind in der Trigeminalganglien und Dorsalwurzelganglien (DRGs) gelegen. Sie dienen als Torwächter der sensorischen Informationen 1. Am perikarial Membran, wie in den zentralen und peripheren Terminals, exprimieren DRG Neuronen Rezeptoren und Ionenkanäle, wie Glutamat - Rezeptoren, TNF alpha - Rezeptoren transient receptor potential Kationenkanal - Unterfamilie V Element 1 (TRPV1), Natriumkanäle, etc. 2 -7. Patch-Clamp-Aufnahmen der perikarial Membran erlauben Verständnis funktionelle Veränderungen vieler dieser Rezeptoren und Kanäle während des Neurons. Die Patch-Clamp-Aufnahmetechnik ist ein leistungsfähiges Werkzeug für studie Aktivitäten der Kanäle oder Rezeptoren , und eine große Anzahl von Studien haben zu sterben durch die Anwendung dieser Technik auf DRG - Neuronen 8-10 durchgeführt. In den meisten Studien wird die DRG durch Schneiden der dorsalen Würzelchen und Spinalnerven der Nähe des Ganglion entfernt. Nach dem Zerkleinern wird das Ganglion dann in Verdauungsenzyme gelegt, die in Dissoziation der DRG-Neuronen führen, die dann sofort aufgezeichnet werden können oder kultiviert für mehrere Tage vor der Aufzeichnung. Leider beinhaltet die Dissoziation von DRG-Neuronen eine notwendige Axotomie der Nähe des Perikarya. Sobald dissoziiert und axotomisierten unterliegen DRG Neuronen phänotypischen Veränderungen sowie Änderungen in Membran Erregbarkeit 11,12. Der Kontaktverlust zwischen dem Perikarya von einzelnen Neuronen und die Satelliten Gliazellen , die normalerweise sie umgeben ist wahrscheinlich auf diese Veränderungen 13 beizutragen. Das Übersprechen zwischen den Neuronen und Gliazellen Satelliten ist sowohl wesentlich unter physiologischen Bedingungen und in Anpassung an Pathologschen Bedingungen , wie sie auf hartnäckigen Schmerzen 14,15 führen. Es wäre eine Herausforderung, die Interaktion zwischen den Neuronen und Satelliten-Gliazellen zu studieren, um ein dissoziierten DRG Vorbereitung. Intact DRGs, andererseits bieten näher an in vivo - Bedingungen. In den vergangenen Jahren hat sich unser Labor, sowie einige andere Gruppen, hat sich von erwachsenen Ratten intakt DRGs wurden unter Verwendung von Änderungen der primären sensorischen Neuronen unter verschiedenen Bedingungen mit chronischen Schmerzen 3-5,11,15-17 assoziiert zu untersuchen. Obwohl die in diesen Studien verwendeten Techniken etwas etabliert sind, ein Schritt-für-Schritt-Beschreibung noch nicht veröffentlicht wurde. Im vorliegenden Manuskript beschreiben wir eine bequeme und schnelle Art und Weise intakt DRGs und ihre Verwendung für Patch-Clamp-Aufnahmen vorzubereiten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1016">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:252px;">Pentobarbital sodium</td>
			<td style="width:172px;">vortech Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:484px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td>1 ml, 5 ml.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">scalpel</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>size: 15</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mayo straight scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14010-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mayo curved scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14011-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adson toothed forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Noyes spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15124-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bone scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16044-10</td>
			<td>Special for cutting the bones.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">periosteal elevator</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>97-0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissection microscope</td>
			<td>WILD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transfer pipette</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>13-711-5AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish (10 cm)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase (Liberase TM)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>05-401-119-001</td>
			<td>dissolve at the concentration of 13 u/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">filter</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>7232520</td>
			<td>Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass pipette</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-110-7.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anchor</td>
			<td>Havard apparatus</td>
			<td>64-0250</td>
			<td>stabilize the DRG to avoid drift.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Peristaltic pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amplifier</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digitizer</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td>1440D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>NIKON</td>
			<td>FN600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-manipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MPC200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">microinjection dispense system</td>
			<td>General Valve</td>
			<td>Picrospitzer II</td>
			<td>fast drug application system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbogen (95% O2, 5% CO2)</td>
			<td>Local Medical Gas supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

patch clamp recordings on intact dorsal root ganglia from adult rats

Patch-Clamp-Studien von Dorsalwurzelganglien (DRGs) Neuronen haben unser Verständnis des peripheren Nervensystems erhöht. Derzeit sind die meisten Aufzeichnungen auf dissoziierten DRG Neuronen durchgeführt, die ein Standardpräparat für die meisten Laboratorien ist. Neuronal Eigenschaften können jedoch durch axonalen Schädigung geändert werden, die durch Enzymverdauung verwendet in dissoziierten Neuronen zu erwerben. Weiterhin kann distanzierte Neuron Präparate nicht vollständig die Mikroumgebung der DRG dar, da Kontaktverlust mit Satelliten-Glia-Zellen, die die primären sensorischen Neuronen ist eine unvermeidliche Folge dieses Verfahrens umgeben. Um die Einschränkungen bei der Verwendung herkömmlicher distanzierte DRG - Neuronen für Patch - Clamp - Aufnahmen zu überwinden, die in diesem Bericht beschreiben wir eine Methode , um intakte DRGs vorzubereiten und Patch - Clamp - Aufnahmen auf einzelnen primären sensorischen Neuronen ex vivo durchzuführen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle und unkomplizierte Herstellung von intakten DRGs, imitiert invivo - Bedingungen von DRG - Neuronen im Zusammenhang mit der sie umgebenden Satelliten Gliazellen und Basalmembran zu halten. Weiterhin vermeidet das Verfahren vor Manipulation axonale Verletzung und Enzymverdau wie bei DRGs dissoziierenden. Diese ex vivo Herstellung kann zusätzlich verwendet werden , um die Interaktion zwischen primären sensorischen Neuronen und Satelliten - Gliazellen zu studieren.

Figur 1 zeigt den Vorgang der intaktes DRG für Patch - Aufzeichnung vorbereitet. 1A zeigt die Belichtung und die Position der ganglia nach Laminektomie. Abbildung 1B zeigt , L3, L4 und L5 DRGs mit den Nervenwurzeln angebracht , nachdem das Rückenmark zu entfernen. Dann L4 und 5 DRGs werden sorgfältig seziert und von den Wirbeln befreit. Als nächstes wird das Epineurium, eine transparente Membran , die die DRG umgibt, entfernt (gelber...

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats at JoVE.com

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

patch-clamp-recordings-on-intact-dorsal-root-ganglia-from-adult-rats

Research

JoVE Journal

Biochemistry

14.1K Aufrufe.  University of California, San Francisco. This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Serie: Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

Spannklemme Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oozyten mit fluoreszierenden unnatürlichen Aminosäuren

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). Using proteomics, we have previously identified more than 150 ECM and ECM-associated proteins in cardiovascular tissues. Notably, many ECM proteins are glycosylated. This post-translational modification affects protein folding, solubility, binding, and degradation. We have developed a sequential extraction and enrichment method for ECM proteins that is compatible with the subsequent liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis of intact glycopeptides. The strategy is based on sequential incubations with NaCl, SDS for tissue decellularization, and guanidine hydrochloride for the solubilization of ECM proteins. Recent advances in LC-MS/MS include fragmentation methods, such as combinations of higher-energy collision dissociation (HCD) and electron transfer dissociation (ETD), which allow for the direct compositional analysis of glycopeptides of ECM proteins. In the present paper, we describe a method to prepare the ECM from tissue samples. The method not only allows for protein profiling but also the assessment and characterization of glycosylation by MS analysis.

This paper describes a methodology to prepare cardiovascular tissue samples for MS analysis that allows for (1) the analysis of ECM protein composition, (2) the identification of glycosylation sites, and (3) the compositional characterization of glycan forms. This methodology can be applied, with minor modifications, to the study of the ECM in other tissues.

Glycoproteomics der extrazellulären Matrix: eine Methode zur Intact Glycopeptidthioestern Analyse unter Verwendung von Massenspektrometrie

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM c-Cyts) has recently emerged as a novel whole-cell analytical method to characterize the bacterial electron transport from the respiratory chain to the cell exterior, referred to as the extracellular electron transport (EET). While the pathway and kinetics of the electron flow during the EET reaction have been investigated, a whole-cell electrochemical method to examine the impact of cation transport associated with EET has not yet been established. In the present study, an example of a biochemical technique to examine the deuterium kinetic isotope effect (KIE) on EET through OM c-Cyts using a model microbe, Shewanella oneidensis MR-1, is described. The KIE on the EET process can be obtained if the EET through OM c-Cyts acts as the rate-limiting step in the microbial current production. To that end, before the addition of D2O, the supernatant solution was replaced with fresh media containing a sufficient amount of the electron donor to support the rate of upstream metabolic reactions, and to remove the planktonic cells from a uniform monolayer biofilm on the working electrode. Alternative methods to confirm the rate-limiting step in microbial current production as EET through OM c-Cyts are also described. Our technique of a whole-cell electrochemical assay for investigating proton transport kinetics can be applied to other electroactive microbial strains.

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Here we present a protocol of whole-cell electrochemical experiments to study the contribution of proton transport to the rate of extracellular electron transport via the outer-membrane cytochromes complex in Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrochemische Detektion von Deuterium kinetische Isotop Effekt auf extrazelluläre Elektronentransport in Shewanella Oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

Analyse dynamischer Proteinkomplexe montiert auf und befreit Biolayer Interferometrie Biosensor mit Massenspektrometrie und Elektronenmikroskopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. Although the molecular mechanisms for the biological responses to fluid flow/shear force are not fully understood, fluid flow-mediated regulation of ion channel gating may contribute critically. Therefore, fluid flow/shear force sensitivity of ion channels has been studied using the patch-clamp technique. However, depending on the experimental protocol, the outcomes and interpretation of data can be erroneous. Here, we present experimental and theoretical evidence for fluid flow-related errors and provide methods for estimating, preventing, and correcting these errors. Changes in junction potential between the Ag/AgCl reference electrode and bathing fluid were measured with an open pipette filled with 3 M KCl. Fluid flow could then shift the liquid/metal junction potential to approximately 7 mV. Conversely, by measuring the voltage shift induced by fluid flow, we estimated the ion concentration in the unstirred boundary layer. In the static condition, the real ion concentrations adjacent to the Ag/AgCl reference electrode or ion channel inlet at the cell-membrane surface can reach as low as approximately 30% of that in the flow condition. Placing an agarose 3 M KCl bridge between the bathing fluid and reference electrode may have prevented this problem of junction potential shifting. However, the unstirred layer effect adjacent to the cell membrane surface could not be fixed in this way. Here, we provide a method for measuring real ion concentrations in the unstirred boundary layer with an open patch-clamp pipette, emphasizing the importance of using an agarose salt-bridge while studying fluid flow-induced regulation of ion currents. Therefore, this novel approach, which takes into consideration the real concentrations of ions in the unstirred boundary layer, may provide useful insight on the experimental design and data interpretation related to fluid shear stress regulation of ion channels.

Mechanosensitive ion channels are often studied in terms of fluid flow/shear force sensitivity with patch-clamp recording. However, depending on the experimental protocol, the outcome on fluid flow-regulations of ion channels can be erroneous. Here, we provide methods for preventing and correcting such errors with a theoretical basis.

Messung der Konzentration der Ionen in der ungerührte Grenzschicht mit offenen Patch-Clamp-Pipette: Auswirkungen auf die Kontrolle der Ionenkanäle durch Flüssigkeit fließen

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the structure-function relationship of these receptors in situ, we need to visualize and track them on the live cell surface with enough spatiotemporal resolution. Here we show how to use recently developed Lattice Light-Sheet Microscopy (LLSM) to image T-cell receptors (TCRs) four-dimensionally (4D, space and time) at the live cell membrane. T cells are one of the main effector cells of the adaptive immune system, and here we used T cells as an example to show that the signaling and function of these cells are driven by the dynamics and interactions of the TCRs. LLSM allows for 4D imaging with unprecedented spatiotemporal resolution. This microscopy technique therefore can be generally applied to a wide array of surface or intracellular molecules of different cells in biology.

The goal of this protocol is to show how to use Lattice Light-Sheet Microscopy to four-dimensionally visualize surface receptor dynamics in live cells. Here T cell receptors on CD4+ primary T cells are shown.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Transplantation of Neonatal Mouse Cardiac Macrophages into Adult Mice

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study reveals that transplantation of neonatal cardiac macrophages recruited by injury promotes adult heart regeneration after myocardial infarction with improvement of cardiac function and cardiomyocyte proliferation. The results indicate that neonatal cardiac macrophage transplantation could be a promising strategy for cardiac injury treatment. Here, we provide the technical details, including the isolation of neonatal cardiac macrophages from apical resection-injured neonatal mouse hearts, the transplantation of macrophages into myocardial-infarcted adult mice, and the estimation of heart regeneration after a macrophage graft.

We provide a protocol for neonatal cardiac macrophage separation and transplantation into an adult mouse heart, which could be a promising way to promote cardiac repair.

Transplantation von neonatalen Maus-Herzmakrophagen in erwachsene Mäuse

In an injured neonatal myocardium, macrophages facilitate cardiomyocyte proliferation and angiogenesis and promote heart regeneration. The present study ...